CN105420400A - 用于微量降解生物样本miniSTR分析的ZNA引物 - Google Patents

Abstract

本发明属于法医DNA检验分析领域，具体涉及用于微量降解生物样本miniSTR分析的ZNA引物。本发明提供了用于12个适合中国人群的非CODIS系统STR基因座miniSTR检验的ZNA引物。本发明提供的ZNA引物对于上述STR基因座扩增产物的在长度71～161bp，在PCR扩增时需要的模板量仅为6.25～25pg，利用本发明提供的ZNA引物对上述12个STR基因座进行扩增的PCR产物能够成功在遗传分析仪上实现电泳检测。因此，本发明提供的ZNA引物能够替代相应的常规DNA引物，实现对降解以及微量生物样本中的上述12个基因座的miniSTR检验。

Description

用于微量降解生物样本miniSTR分析的ZNA引物

技术领域

本发明属于法医DNA检验分析领域，具体涉及用于微量降解生物样本miniSTR分析的ZNA引物。

背景技术

短串联重复序列(shorttandemrepeat，STR)又被称为微卫星DNA(microsatelliteDNA),是人类基因组中分布较为广泛的一类遗传标记，其核心序列一般由2～6个碱基组成，核心序列的重复单位数目不同导致同一基因座中存在不同的等位基因。由于其重复单位较为简单，也被称为简单重复序列(simplesequencerepeats，SSRs)。由于核心单位数目的变化，使STR的长度在人群中变异较大，构成了STR的遗传多态性，进而成为STR分析技术的生物学基础。STR序列绝大多数分布于基因组非编码区，核心重复序列呈串联排列，扩增片段一般在400bp以下，目前在法医个人识别及亲子鉴定中得到了广泛应用。然而在实际应用中，由于物理、化学以及天气等环境因素的影响，检材中DNA分子易发生降解、断裂，经常得不到完整的DNA分型甚至分型失败，这就给法医学分析带来了很大的困难。为了解决上述降解生物样本的分型问题，产生了一种新的STR分型技术：在设计引物时，使其结合在更靠近核心重复序列的侧翼序列，PCR扩增的产物就会比STR基因座更短一些，即miniSTR技术。

虽然miniSTR分型技术在对降解生物样本的分析中获得了很大的成功，但其应用仍然存在一定的局限性。例如，由于受限于STR核心重复序列的长度，miniSTR的扩增片段长度不可能无限的减小，这就令不同基因座的miniSTR扩增片段分布更为集中，各个基因座的等位基因片段长度范围相互重叠的机率比普通STR要高得多。因此基于miniSTR原理设计的荧光标记复合扩增试剂盒不可能同时容纳很多基因座，一次检验所提供的信息量较少，必须增加复合扩增的次数。此外，当DNA模板数量很少或者样本扩增产量很低的时候，miniSTR的使用就会受到限制。另外，PCR扩增产物的长度小于150bp的时候，剩余在引物上的染料分子会对电泳图谱产生影响。而在实际的法医学检案工作中，由于环境因素等影响，使用的生物样本通常既是降解样本，同时往往也是低拷贝数((Lowcopynumber，LCN)样本，即DNA含量少于100pg，相当于15个双倍体或30个单倍体细胞的生物样本。

为提高LCN生物样本的法医学STR分型的灵敏度和成功率，通常采用两种策略。一种是增加PCR反应的循环次数，提高STR基因座扩增成功率和产物量，而后进行DNA分析。虽然增加PCR循环数能够提高LCN样本的STR成功检出率,但存在以下风险：实验室环境和操作污染对样本STR分型的干扰作用变得更加明显；非特异产物大量积累，分型精确性大幅下降；分型结果中易出现等位基因扩增不均衡、甚至丢失的现象。另一种策略是首先进行LCN样本的全基因组扩增，获取足量的DNA模板，而后进行STR分型。这种策略也存在一些实际应用的缺陷：发生等位基因丢失；针对特定类型检材的全基因组扩增技术尚不明确等。

法庭科学STR基因组的选取需要考虑众多因素，其中首要因素是STR基因座的个体识别力(Powerofdiscrimination，PD)。美国联邦调查局(FBI)在1997年选定了13个核心STR基因座用于建立DNA联合索引系统(CODIS)：CSF1P0、D3S12358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、HUMTH01、TPOX、Vwa。为进一步增强区分度，FBI随后又在CODIS数据库中加入了基因座D2S1338和D19S433。目前常用的商品化STR复合扩增试剂盒，如ABI公司的IdentifilerTM以及Promega公司的PowerPlex等，均包括上述13个核心STR基因座。然而STR基因座的多态性在不同种族和人群中存在明显的差异，上述STR基因座的选取主要是基于西方人群所选定的，在实际应用中并不一定适用于中国人群。

未解决上述问题，中国专利公告CN1327005C公开了一种荧光标记STR基因座的复合扩增检验系统,该系统包括14个适合中国人群的STR基因座。该系统使用的DNA引物能够将相应基因座扩增产物控制在400个碱基(bp)的范围内，灵敏度达到0.125ng。该系统虽然提供了适合中国人群的STR基因座，但是由于其检测灵敏度的限制，难以实现对LCN样本的检测。

ZNA(ZipNucleicAcids)是一种新型的寡核苷酸衍生物，是通过在DNA分子的核苷酸上偶联阳离子环形结构的精胺衍生物(Z-unit)而获得，ZNA分子的结构示意图如图1所示。Z-unit的偶联部位既可以在DNA分子5'或者3'末端的核苷酸上，也可以位于中间部位的核苷酸上。与DNA分子一样，ZNA分子也具有相同的严格配对选择性(A-T或G-C)；此外，ZNA分子还具有相交于DNA分子更高的Tm值以及快速动力学的特征。虽然ZNA分子与DNA分子具有相似的配对选择性，但目前未有将ZNA引物设计用于miniSTR分型技术的研究报道。

综上所述，虽然STR分型技术在法医DNA检验分析领域中有重要意义，然而目前建立起的商品化扩增系统或试剂盒多数是针对西方人群，在实际使用中并不适合中国人群；少数适合中国人群的检测系统，无法同时满足对微量(或低拷贝数)以及高度降解生物样本的STR分型；虽然ZNA分子与DNA分子具有相似的特性，但目前所有的STR分型系统均采用常规DNA引物。

发明内容

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

本发明中的A⁺、T⁺、G⁺和C⁺分别代表偶联了Z-unit的腺嘌呤核糖核苷酸、胸腺嘧啶核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸和胞嘧啶核糖核苷酸。

本发明要解决的一个问题是提供一组适用于中国人群个体识别的STR基因座，为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一组适用于中国人群个体识别的STR基因座，包括：D10S1248、D2S441、D1S1677、D6S474、D2S1776、D1S1627、D3S4529、D9S2157、D9S1122、D10S1435、D12ATA63和D20S1082共12个非CODIS系统STR基因座。

使用东北、西北、西南、中南和华东汉族人群以及藏族、蒙古族、土家族、撒拉族、哈萨克、白族、维族、俄罗斯族等少数民族群体样本对上述12个STR基因座进行多态性验证。并按照法医学DNA检验对STR基因座的要求，对上述基因座的个体识别力(DP)、非父排除率(EPP)、多态性信息含量(PIC)、预期杂合度(HE)、观察杂合度(HO)等法医学参数进行统计分析，结果见下表：

表112个STR基因座的法医学参数

验证结果显示：上述12个STR基因座的等位基因频率均符合Hardy-Weinberg平衡，在中国主要人群中且具有较高的多态信息和个体识别率，更加适合中国人群的群体遗传学特征。

本发明要解决的另一个问题是提供用于上述12个STR基因座的miniSTR分型技术的DNA引物，使得12个STR基因座扩增产物长度在71～161bp之间，为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

所述的DNA引物的核苷酸序列与扩增产物信息如下：

D10S1248基因座的DNA引物为：

正向引物5’-TTAATGAATTGAACAAATGAGTGAG-3’(SEQIDNO：1)；

反向引物5’-GCAACTCTGGTTGTATTGTCTTCAT-3’(SEQIDNO：2)；

扩增产物长度为79～123bp。

D2S441基因座的DNA引物为：

正向引物5’-CTGTGGCTCATCTATGAAAACTT-3’(SEQIDNO：3)；

反向引物5’-GAAGTGGCTGTGGTGTTATGAT-3’(SEQIDNO：4)；

扩增产物长度为78～110bp。

D1S1677基因座的DNA引物为：

正向引物5’-TTCTGTTGGTATAGAGCAGTGTTT-3’(SEQIDNO：5)；

反向引物5’-GTGACAGGAAGGACGGAATG-3’(SEQIDNO：6)；

扩增产物长度为78～110bp。

D6S474基因座的DNA引物为：

正向引物5’-GGTTTTCCAAGAGATAGACCAATTA-3’(SEQIDNO：7)；

反向引物5’-GTCCTCTCATAAATCCCTACTCATATC-3’(SEQIDNO：8)；

扩增产物长度为107～136bp。

D2S1776基因座的DNA引物为：

正向引物5’-TGAACACAGATGTTAAGTGTGTATATG-3’(SEQIDNO：9)；

反向引物5’-GTCTGAGGTGGACAGTTATGAAA-3’(SEQIDNO：10)；

扩增产物长度为127～161bp。

D1S1627基因座的DNA引物为：

正向引物5’-CATGAGGTTTGCAAATACTATCTTAAC-3’(SEQIDNO：11)；

反向引物5’-GTTTTAATTTTCTCCAAATCTCCA-3’(SEQIDNO：12)；

扩增产物长度为81～100bp。

D3S4529基因座的DNA引物为：

正向引物5’-CCCAAAATTACTTGAGCCAAT-3’(SEQIDNO：13)；

反向引物5’-GAGACAAAATGAAGAAACAGACAG-3’(SEQIDNO：14)；

扩增产物长度为111～139bp。

D9S2157基因座的DNA引物为：

正向引物5’-CAAAGCGAGACTCTGTCTCAA-3’(SEQIDNO：15)；

反向引物5’-GAAAATGCTATCCTCTTTGGTATAAAT-3’(SEQIDNO：16)；

扩增产物长度为71～107bp。

D9S1122基因座的DNA引物为：

正向引物5’-GGGTATTTCAAGATAACTGTAGATAGG-3’(SEQIDNO：17)；

反向引物5’-GCTTCTGAAAGCTTCTAGTTTACC-3’(SEQIDNO：18)；

扩增产物长度为93～125bp。

D10S1435基因座的DNA引物为：

正向引物5’-TGTTATAATGCATTGAGTTTTATTCTG-3’(SEQIDNO：19)；

反向引物5’-GCCTGTCTCAAAAATAAAGAGATAGACA-3’(SEQIDNO：20)；

扩增产物长度为82～139bp。

D12ATA63基因座的DNA引物为：

正向引物5’-GAGCGAGACCCTGTCTCAAG-3’(SEQIDNO：21)；

反向引物5’-GGAAAAGACATAGGATAGCAATTT-3’(SEQIDNO：22)；

扩增产物长度为76～106bp。

D20S1082基因座的DNA引物为：

正向引物5’-ACATGTATCCCAGAACTTAAAGTAAAC-3’(SEQIDNO：23)；

反向引物5’-GCAGAAGGGAAAATTGAAGCTG-3’(SEQIDNO：24)；

扩增产物长度为73～101bp。

本发明要解决的再一个问题是提供用于上述12个STR基因座的miniSTR分型技术的ZNA引物，该ZNA引物与DNA引物具有相同的严格的碱基互补配对原则，能够替代相应DNA引物在PCR扩增中的作用，并且能够显著降低样本用量，同时满足对高度降解以及低拷贝数生物样本的分析需求。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：以上述24条DNA引物序列为基础，在其分子中特定位置的核苷酸上设计Z-unit，获得ZNA引物序列。

具体地，用于D10S1248基因座miniSTR分析的一对ZNA引物为以下序列：

正向引物为序列1-3中的任意一条；优选为序列1或3；进一步优选为序列3。

序列1：5’-TTAATGAATTGAAC⁺AAATGAGT⁺GAG-3’

序列2：5’-TTAATGA⁺ATTGAAC⁺AAATGAGT⁺GAG-3’

序列3：5’-TTA⁺ATGAATTGAACA⁺AATGAGTG⁺AG-3’

反向引物为序列4-6中的任意一条；优选为序列4或6；进一步优选为序列4。

序列4：5’-GCAAC⁺TC⁺TGGTTGTATTGTCTTCAT-3’

序列5：5’-GCAAC⁺TCTGGTTGTA⁺TTGTCTTCAT-3’

序列6：5’-GCA⁺ACTCTGGTTGTATTGT⁺CTTCAT-3’

具体地，用于D2S441基因座miniSTR分析的一对ZNA引物为以下序列：

正向引物为序列7或8中的任意一条；优选为序列8。

序列7：5’-CTG⁺TGGCTCATCTA⁺TGAA⁺AACTT-3’

序列8：5’-CTGT⁺GGCTCA⁺TCTATG⁺AAAACTT-3’

反向引物为序列9或10中的任意一条；优选为序列10。

序列9：5’-GAA⁺GTGG⁺CTGTGGTGTTA⁺TGAT-3’

序列10：5’-GAAG⁺TGGC⁺TGTGGT⁺GTTATGAT-3’

具体地，用于D1S1677基因座miniSTR分析的一对ZNA引物为以下序列：

正向引物为序列11-13中的任意一条；优选为序列11或12；进一步优选为序列12。

序列11：5’-TTC⁺TGTTGGTA⁺TAGAGCAGTGTTT-3’

序列12：5’-TTCT⁺GTTGGTATAGA⁺GCAGTGTTT-3’

序列13：5’-TTCTGTTG⁺GTATA⁺GAGCAGTG⁺TTT-3’

反向引物为序列14-16中的任意一条；优选为序列15或16；进一步优选为序列15。

序列14：5’-GTGAC⁺AGGAA⁺GGACGG⁺AATG-3’

序列15：5’-GTGA⁺CAGGAAGGA⁺CG⁺GAATG-3’

序列16：5’-GTG⁺ACAGGA⁺AGGACG⁺GAATG-3’

具体地，用于D6S474基因座miniSTR分析的一对ZNA引物为以下序列：

正向引物为序列17-19中的任意一条；优选为序列18或19；进一步优选为序列18。

序列17：5’-GGTTT⁺TCCA⁺AGAGATAGACCA⁺ATTA-3’

序列18：5’-GGTT⁺TTCCAAGAGATAGACC⁺AATTA-3’

序列19：5’-GGTTTTCCA⁺AGA⁺GATAGACCAAT⁺TA-3’

反向引物为序列20-22中的任意一条；优选为序列21或22；进一步优选为序列22。

序列22：5’-GTCC⁺TCTCAT⁺AAATCCCTACTC⁺ATATC-3’

序列21：5’-GTCCTCTCAT⁺AAATCCCTACTCA⁺TATC-3’

序列22：5’-GTCCTCTCA⁺TAAATCCCTACTC⁺ATATC-3’

具体地，用于D2S1776基因座miniSTR分析的一对ZNA引物为以下序列：

正向引物为序列23-25中的任意一条；优选为序列23或24；进一步优选为序列23。

序列23：5’-TGAACA⁺CAGATG⁺TTAAGTGTG⁺TATATG-3’

序列24：5’-TGAA⁺CA⁺CAGATG⁺TTA⁺AGTGTG⁺TATATG-3’

序列25：5’-TGA⁺ACAC⁺AGAT⁺GTTAAGTG⁺TGTATATG-3’

反向引物为序列26-28中的任意一条；优选为序列26或27；进一步优选为序列27。

序列26：5’-GTCTG⁺AGGT⁺GGACA⁺GTTAT⁺GAAA-3’

序列27：5’-GT⁺CTGAGGTGGA⁺CA⁺GTTA⁺TGAAA-3’

序列28：5’-GTCT⁺GA⁺GGTGGA⁺CA⁺GTTAT⁺GAAA-3’

具体地，用于D1S1627基因座miniSTR分析的一对ZNA引物为以下序列：

正向引物为序列29-31中的任意一条；优选为序列29或31；进一步优选为序列29。

序列29：5’-CATG⁺AGGTTTG⁺CAAATACT⁺ATC⁺TTAAC-3’

序列30：5’-CATG⁺AGGTTTGC⁺AAATACT⁺ATCTT⁺AAC-3’

序列31：5’-CATGAG⁺GTTTGCA⁺AATACTA⁺TCTTAAC-3’

反向引物为序列32-34中的任意一条；优选为序列32或34；进一步优选为序列32。

序列32：5’-GTTTTA⁺ATTTTCTC⁺CAAAT⁺CTCCA-3’

序列33：5’-GTTTT⁺AATTTT⁺CTCCAAA⁺TCTCCA-3’

序列34：5’-GTTTT⁺AA⁺TTTTC⁺TCCAAATC⁺TCCA-3’

具体地，用于D3S4529基因座miniSTR分析的一对ZNA引物为以下序列：

正向引物为序列35-37中的任意一条；优选为序列36或37；进一步优选为序列37。

序列35：5’-CCCA⁺AAA⁺TTA⁺CTTGA⁺GCCAAT-3’

序列36：5’-CCCAAAAT⁺TACT⁺TGAGC⁺CAAT-3’

序列37：5’-CCCAAAA⁺TTA⁺CTTGAGCCA⁺AT-3’

反向引物为序列38-40中的任意一条；优选为序列38或40；进一步优选为序列40。

序列38：5’-GAGAC⁺AAAATGA⁺AGAAACAG⁺ACAG-3’

序列39：5’-GAGACA⁺AAATGAAGAAACAGA⁺CAG-3’

序列40：5’-GAGA⁺CAAAATGA⁺AGAAACAGAC⁺AG-3’

具体地，用于D9S2157基因座miniSTR分析的一对ZNA引物为以下序列：

正向引物为序列41或42中的任意一条；优选为序列41。

序列41：5’-CAAAGCGA⁺GA⁺CTC⁺TGTC⁺TCAA-3’

序列42：5’-CAAAG⁺CGA⁺GACTCTGTC⁺TCAA-3’

反向引物为序列43或44中的任意一条；优选为序列44。

序列43：5’-GAAAATG⁺CTATCCTCTTTGGTAT⁺AAAT-3’

序列44：5’-GAAAAT⁺GCTA⁺TCCTCT⁺TTG⁺GTATAAAT-3’

具体地，用于D9S1122基因座miniSTR分析的一对ZNA引物为以下序列：

正向引物为序列45-47中的任意一条；优选为序列47或16；进一步优选为序列46。

序列45：5’-GGGT⁺ATTTCAAG⁺ATAACTGTA⁺GATAGG-3’

序列46：5’-GGGTA⁺TTTCAAGATAACTGTA⁺GATAGG-3’

序列47：5’-GGG⁺TATTT⁺CAA⁺GATAACTGTA⁺GATAGG-3’

反向引物为序列48-50中的任意一条；优选为序列48或50；进一步优选为序列50。

序列48：5’-GCTT⁺CTGAAAG⁺CTTCTAGTT⁺TACC-3’

序列49：5’-GCTT⁺CTGAAA⁺GCTTC⁺TAGTT⁺TACC-3’

序列50：5’-GCTTC⁺TGA⁺AAG⁺CTTCTAGT⁺TTACC-3’

具体地，用于D10S1435基因座miniSTR分析的一对ZNA引物为以下序列：

正向引物为序列51-53中的任意一条；优选为序列52或53；进一步优选为序列52。

序列51：5’-TGTTA⁺TA⁺ATGCATTGAG⁺TTTTATTCTG-3’

序列52：5’-TGTTATA⁺ATGC⁺ATTGA⁺GTTTTAT⁺TCTG-3’

序列53：5’-TGTTATA⁺ATGCATTGA⁺GTTTTATTCTG-3’

反向引物为序列54-56中的任意一条；优选为序列54或56；进一步优选为序列56。

序列54：5’-GCCTGT⁺CTCA⁺AAAA⁺TAAAGA⁺GAT⁺AGA⁺CA-3’

序列55：5’-GCCTGT⁺CTCAAAAAT⁺AAAGA⁺GATAGA⁺CA-3’

序列56：5’-GC⁺CTGT⁺CTCAAAA⁺ATAAAGAGA⁺TAGA⁺CA-3’

具体地，用于D12ATA63基因座miniSTR分析的一对ZNA引物为以下序列：

正向引物为序列57-59中的任意一条；优选为序列58或59；进一步优选为序列59。

序列57：5’-GAGCG⁺AGA⁺CCCTGT⁺CTCAAG-3’

序列58：5’-GAG⁺CGAGAC⁺CCTGTC⁺TCAAG-3’

序列59：5’-GAGC⁺GAGACC⁺CTGTCTCA⁺AG-3’

反向引物为序列60-62中的任意一条；优选为序列61或62；进一步优选为序列62。

序列60：5’-GGAAAAG⁺ACATA⁺GGATAGC⁺AATTT-3’

序列61：5’-GGAAAA⁺GACA⁺TA⁺GGATAGCA⁺ATTT-3’

序列62：5’-GGA⁺AAAGACA⁺TAGGATAGC⁺AAT⁺TT-3’

具体地，用于D20S1082基因座miniSTR分析的一对ZNA引物为以下序列：

正向引物为序列63-65中的任意一条；优选为序列63或64；进一步优选为序列64。

序列63：5’-ACA⁺TGTATC⁺CCAGAAC⁺TTAAAGT⁺AAAC-3’

序列64：5’-ACATGTAT⁺CCCAGA⁺ACTTAAAGTAAAC-3’

序列65：5’-ACATG⁺TAT⁺CCCAGA⁺ACT⁺TAAAGTAAAC-3’

反向引物为序列66-68中的任意一条；优选为序列66或67；进一步优选为序列67。

序列66：5’-GCAG⁺AAG⁺GGA⁺AAAT⁺TGA⁺AGCTG-3’

序列67：5’-GCA⁺GAAGG⁺GAAAATT⁺GAAGCTG-3’

序列68：5’-GCAG⁺AAGGGAAAAT⁺TGAAGCTG-3’

本发明的有益效果：

本发明提供的12个STR基因座在包括东北、西北、西南、中南和华东汉族人群以及藏族、蒙古族、土家族、撒拉族、哈萨克、白族、维族、俄罗斯族等少数民族的中国主要人群中具有较高的多态性信息和个体识别率，在法医个体识别技术中，更加适合中国人群的群体遗传学特征。

本发明提供的ZNA引物对上述12个STR基因座的扩增产物的在长度71～161bp，适用于DNA分子高度降解的生物样本；在PCR扩增时需要的模板量仅为6.25～25pg，也适用于低拷贝数生物样本；利用本发明提供的ZNA引物对上述12个STR基因座进行扩增的PCR产物能够成功在遗传分析仪上实现电泳检测。

综上所述，本发明提供了用于12个非CODIS系统的STR基因座miniSTR分型技术的ZNA引物，这些ZNA引物能够替代相应的常规DNA引物，实现对降解以及微量生物样本中的上述12个基因座的miniSTR检验。

附图说明

图1为ZNA分子结构示意图。

图2为D2S441基因座使用DNA和ZNA引物的扩增效果。Lane1：模板量为500pg的阳性对照；Lane2：模板量200pg；Lane3：模板量100pg；Lane4：模板量50pg；Lane5：模板量25pg；Lane6：模板量12.5pg；Lane7：模板量6.25pg；Lane8：不加引物直接扩增的阴性对照。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明中，DNA分子的Z-unit修饰委托美国SA公司进行。

实施例1一对用于D10S1248基因座miniSTR分析的ZNA引物

ZNA引物的设计方法：

首先根据需要达到的扩增产物长度(79～123bp)设计常规的DNA引物，DNA引物序列如下：

正向引物5’-TTAATGAATTGAACAAATGAGTGAG-3’

反向引物5’-GCAACTCTGGTTGTATTGTCTTCAT-3’

然后对上述正向引物的第14位胞嘧啶和糖核苷酸(C)，第22位胸腺嘧啶核糖核苷酸(T)进行Z-unit修饰，得到相应ZNA正向引物序列5’-TTAATGAATTGAAC⁺AAATGAGT⁺GAG-3’；对上述反向引物的第5位和第7位C进行Z-unit修饰，得到相应ZNA反向引物序列5’-GCAAC⁺TC⁺TGGTTGTATTGTCTTCAT-3’。

实施例2一对用于D2S441基因座miniSTR分析的ZNA引物

ZNA引物的设计方法：

首先根据需要达到的扩增产物长度(78～110bp)设计常规的DNA引物，DNA引物序列如下：

正向引物5’-CTGTGGCTCATCTATGAAAACTT-3’

反向引物5’-GAAGTGGCTGTGGTGTTATGAT-3’

然后对上述正向引物的第4位T、第10位腺嘌呤核糖核苷酸(A)和第16位鸟嘌呤核糖核苷酸(G)进行Z-unit修饰，得到相应ZNA正向引物序列5’-CTGT⁺GGCTCA⁺TCTATG⁺AAAACTT-3’；对上述反向引物的第4位G、第8位C、第14位T进行Z-unit修饰，得到相应ZNA反向引物序列5’-GAAG⁺TGGC⁺TGTGGT⁺GTTATGAT-3’。

实施例3一对用于D1S1677基因座miniSTR分析的ZNA引物

ZNA引物的设计方法：

首先根据需要达到的扩增产物长度(81～117bp)设计常规的DNA引物，DNA引物序列如下：

正向引物5’-TTCTGTTGGTATAGAGCAGTGTTT-3’

反向引物5’-GTGACAGGAAGGACGGAATG-3’

然后对上述正向引物的第4位T和第15位A进行Z-unit修饰，得到相应ZNA正向引物序列5’-TTCT⁺GTTGGTATAGA⁺GCAGTGTTT-3’；对上述反向引物的第3和15位G、第9位A进行Z-unit修饰，得到相应ZNA反向引物序列5’-GTG⁺ACAGGA⁺AGGACG⁺GAATG-3’。

实施例4一对用于D6S474基因座miniSTR分析的ZNA引物

ZNA引物的设计方法：

首先根据需要达到的扩增产物长度(107～136bp)设计常规的DNA引物，DNA引物序列如下：

正向引物5’-GGTTTTCCAAGAGATAGACCAATTA-3’

反向引物5’-GTCCTCTCATAAATCCCTACTCATATC-3’

然后对上述正向引物的第4位T、第20位C进行Z-unit修饰，得到相应ZNA正向引物序列5’-GGTT⁺TTCCAAGAGATAGACC⁺AATTA-3’；对上述反向引物的第9位A，第22位C进行Z-unit修饰，得到相应ZNA反向引物序列5’-GTCCTCTCA⁺TAAATCCCTACTC⁺ATATC-3’。

实施例5一对用于D2S1776基因座miniSTR分析的ZNA引物

ZNA引物的设计方法：

首先根据需要达到的扩增产物长度(127～161bp)设计常规的DNA引物，DNA引物序列如下：

正向引物5’-TGAACACAGATGTTAAGTGTGTATATG-3’

反向引物5’-GTCTGAGGTGGACAGTTATGAAA-3’

然后对上述正向引物的第3位A、第7位C、第11位T、第19为G进行Z-unit修饰，得到相应ZNA正向引物序列5’-TGA⁺ACAC⁺AGAT⁺GTTAAGTG⁺TGTATATG-3’；对上述反向引物的第5位G、第9和19位T、第14位A进行Z-unit修饰，得到相应ZNA反向引物序列5’-GTCTG⁺AGGT⁺GGACA⁺GTTAT⁺GAAA-3’。

实施例6一对用于D1S1627基因座miniSTR分析的ZNA引物

ZNA引物的设计方法：

首先根据需要达到的扩增产物长度(81～100bp)设计常规的DNA引物，DNA引物序列如下：

正向引物5’-CATGAGGTTTGCAAATACTATCTTAAC-3’

反向引物5’-GTTTTAATTTTCTCCAAATCTCCA-3’

然后对上述正向引物的第4位G、第12位C、第19和24位T进行Z-unit修饰，得到相应ZNA正向引物序列5’-CATG⁺AGGTTTGC⁺AAATACT⁺ATCTT⁺AAC-3’；对上述反向引物的第6位A、第14位C、第19位T进行Z-unit修饰，得到相应ZNA反向引物序列5’-GTTTTA⁺ATTTTCTC⁺CAAAT⁺CTCCA-3’。

实施例7一对用于D3S4529基因座miniSTR分析的ZNA引物

ZNA引物的设计方法：

首先根据需要达到的扩增产物长度(111～139bp)设计常规的DNA引物，DNA引物序列如下：

正向引物5’-CCCAAAATTACTTGAGCCAAT-3’

反向引物5’-GAGACAAAATGAAGAAACAGACAG-3’

然后对上述正向引物的第8和12位T、第17位C进行Z-unit修饰，得到相应ZNA正向引物序列5’-CCCAAAAT⁺TACT⁺TGAGC⁺CAAT-3’；对上述反向引物的第5位C、第12位A、第20位G进行Z-unit修饰，得到相应ZNA反向引物序列5’-GAGAC⁺AAAATGA⁺AGAAACAG⁺ACAG-3’。

实施例8一对用于D9S2157基因座miniSTR分析的ZNA引物

ZNA引物的设计方法：

首先根据需要达到的扩增产物长度(71～107bp)设计常规的DNA引物，DNA引物序列如下：

正向引物5’-CAAAGCGAGACTCTGTCTCAA-3’

反向引物5’-GAAAATGCTATCCTCTTTGGTATAAAT-3’

然后对上述正向引物的第5位G，第8位A、和第17位C进行Z-unit修饰，得到相应ZNA正向引物序列5’-CAAAG⁺CGA⁺GACTCTGTC⁺TCAA-3’；对上述反向引物的第7位G和第23位T进行Z-unit修饰，得到相应ZNA反向引物序列5’-GAAAATG⁺CTATCCTCTTTGGTAT⁺AAAT-3’。

实施例9一对用于D9S1122基因座miniSTR分析的ZNA引物

ZNA引物的设计方法：

首先根据需要达到的扩增产物长度(93～125bp)设计常规的DNA引物，DNA引物序列如下：

正向引物5’-GGGTATTTCAAGATAACTGTAGATAGG-3’

反向引物5’-GCTTCTGAAAGCTTCTAGTTTACC-3’

然后对上述正向引物的第5位A和第21位A进行Z-unit修饰，得到相应ZNA正向引物序列5’-GGGTA⁺TTTCAAGATAACTGTA⁺GATAGG-3’；对上述反向引物的第4位T、第11位G和第20位T进行Z-unit修饰，得到相应ZNA反向引物序列5’-GCTT⁺CTGAAAG⁺CTTCTAGTT⁺TACC-3’。

实施例10一对用于D10S1435基因座miniSTR分析的ZNA引物

ZNA引物的设计方法：

首先根据需要达到的扩增产物长度(82～139bp)设计常规的DNA引物，DNA引物序列如下：

正向引物5’-TGTTATAATGCATTGAGTTTTATTCTG-3’

反向引物5’-GCCTGTCTCAAAAATAAAGAGATAGACA-3’

然后对上述正向引物的第7和16位A进行Z-unit修饰，得到相应ZNA正向引物序列5’-TGTTATA⁺ATGCATTGA⁺GTTTTATTCTG-3’；对上述反向引物的第6和15位T、第20和26位A进行Z-unit修饰，得到相应ZNA反向引物序列5’-GCCTGT⁺CTCAAAAAT⁺AAAGA⁺GATAGA⁺CA-3。

实施例11一对用于D12ATA63基因座miniSTR分析的ZNA引物

ZNA引物的设计方法：

首先根据需要达到的扩增产物长度(76～106bp)设计常规的DNA引物，DNA引物序列如下：

正向引物5’-GAGCGAGACCCTGTCTCAAG-3’

反向引物5’-GGAAAAGACATAGGATAGCAATTT-3’

然后对上述正向引物的第3位G、第9和15位C进行Z-unit修饰，得到相应ZNA正向引物序列5’-GAG⁺CGAGAC⁺CCTGTC⁺TCAAG-3’；对上述反向引物的第7位G、第12位A、第19位C进行Z-unit修饰，得到相应ZNA反向引物序列5’-GGAAAAG⁺ACATA⁺GGATAGC⁺AATTT-3’。

实施例12一对用于D20S1082基因座miniSTR分析的ZNA引物

ZNA引物的设计方法：

首先根据需要达到的扩增产物长度(73～101bp)设计常规的DNA引物，DNA引物序列如下：

正向引物5’-ACATGTATCCCAGAACTTAAAGTAAAC-3’

反向引物5’-GCAGAAGGGAAAATTGAAGCTG-3’

然后对上述正向引物的第8位T、第14位A进行Z-unit修饰，得到相应ZNA正向引物序列5’-ACATGTAT⁺CCCAGA⁺ACTTAAAGTAAAC-3’；对上述反向引物的第4位G、第14位T进行Z-unit修饰，得到相应ZNA反向引物序列5’-GCAG⁺AAGGGAAAAT⁺TGAAGCTG-3’。

实施例13PCR扩增最低模板用量的确定

实验方法：采用超声波打断和DNasel酶切法处理基因组DNA，人工制备片段长度小于150bp的高度降解DNA样本；以该样本作为模板，分别用200pg、100pg、50pg、25pg、12.5pg和6.25pg的模板量进行PCR扩增，观察并记录能够出现清晰的扩增条带的最低模板用量。PCR程序为：95℃变性5min，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃保温10min。

利用上述实验方法分别确定实施例1-12所述的DNA引物和ZNA引物对D10S1248、D2S441、D1S1677、D6S474、D2S1776、D1S1627、D3S4529、D9S2157、D9S1122、D10S1435、D12ATA63和D20S1082基因座进行PCR扩增的最低模板用量，结果见下表：

表1DNA引物和ZNA引物的PCR扩增最低模板用量

结果显示：使用ZNA引物对本发明中的12个STR基因座进行扩增时，模版用量在6.25～25pg之间即可扩增出清晰条带，而相应的DNA引物则需要多达50～100pg的模版，才能扩增出清晰条带。证明本发明提供的ZNA引物在进行miniSTR检验时能够有效降低模版用量，实现微量降解生物样本的检验分析。

Claims (3)

1.一组用于微量降解生物样本miniSTR基因座分析的ZNA引物，其特征在于：所述的ZNA引物用于扩增以下12个miniSTR基因座：D10S1248、D2S441、D1S1677、D6S474、D2S1776、D1S1627、D3S4529、D9S2157、D9S1122、D10S1435、D12ATA63和D20S1082；

所述的一组ZNA引物的序列为：

D10S1248基因座：

5’-TTAATGA⁺ATTGAAC⁺AAATGAGT⁺GAG-3’

5’-GCA⁺ACTCTGGTTGTATTGT⁺CTTCAT-3’

D2S441基因座：

5’-CTG⁺TGGCTCATCTA⁺TGAA⁺AACTT-3’

5’-GAA⁺GTGG⁺CTGTGGTGTTA⁺TGAT-3’

D1S1677基因座：

5’-TTCTGTTG⁺GTATA⁺GAGCAGTG⁺TTT-3’

5’-GTGA⁺CAGGAAGGA⁺CG⁺GAATG-3’

D6S474基因座：

5’-GGTTTTCCA⁺AGA⁺GATAGACCAAT⁺TA-3’

5’-GTCCTCTCAT⁺AAATCCCTACTCA⁺TATC-3’

D2S1776基因座：

5’-TGAA⁺CA⁺CAGATG⁺TTA⁺AGTGTG⁺TATATG-3’

5’-GTCT⁺GA⁺GGTGGA⁺CA⁺GTTAT⁺GAAA-3’

D1S1627基因座：

5’-CATG⁺AGGTTTG⁺CAAATACT⁺ATC⁺TTAAC-3’

5’-GTTTT⁺AATTTT⁺CTCCAAA⁺TCTCCA-3’

D3S4529基因座：

5’-CCCA⁺AAA⁺TTA⁺CTTGA⁺GCCAAT-3’

5’-GAGACA⁺AAATGAAGAAACAGA⁺CAG-3’

D9S2157基因座：

5’-CAAAGCGA⁺GA⁺CTC⁺TGTC⁺TCAA-3’

5’-GAAAATG⁺CTATCCTCTTTGGTAT⁺AAAT-3’

D9S1122基因座：

5’-GGG⁺TATTT⁺CAA⁺GATAACTGTA⁺GATAGG-3’

5’-GCTT⁺CTGAAA⁺GCTTC⁺TAGTT⁺TACC-3’

D10S1435基因座：

5’-TGTTATA⁺ATGC⁺ATTGA⁺GTTTTAT⁺TCTG-3’

5’-GCCTGT⁺CTCA⁺AAAA⁺TAAAGA⁺GAT⁺AGA⁺CA-3’

D12ATA63基因座：

5’-GAGC⁺GAGACC⁺CTGTCTCA⁺AG-3’

5’-GGA⁺AAAGACA⁺TAGGATAGC⁺AAT⁺TT-3’

D20S1082基因座：

5’-ACA⁺TGTATC⁺CCAGAAC⁺TTAAAGT⁺AAAC-3’

5’-GCA⁺GAAGG⁺GAAAATT⁺GAAGCTG-3’。

2.一组用于微量降解生物样本中12个miniSTR基因座分析的ZNA引物，其特征在于：所述的ZNA引物用于扩增以下12个miniSTR基因座：D10S1248、D2S441、D1S1677、D6S474、D2S1776、D1S1627、D3S4529、D9S2157、D9S1122、D10S1435、D12ATA63和D20S1082；

所述的一组ZNA引物的序列为：

D10S1248基因座：

5’-TTAATGAATTGAAC⁺AAATGAGT⁺GAG-3’

5’-GCAAC⁺TC⁺TGGTTGTATTGTCTTCAT-3’

D2S441基因座：

5’-CTGT⁺GGCTCA⁺TCTATG⁺AAAACTT-3’

5’-GAAG⁺TGGC⁺TGTGGT⁺GTTATGAT-3’

D1S1677基因座：

5’-TTCT⁺GTTGGTATAGA⁺GCAGTGTTT-3’

5’-GTG⁺ACAGGA⁺AGGACG⁺GAATG-3’

D6S474基因座：

5’-GGTT⁺TTCCAAGAGATAGACC⁺AATTA-3’

5’-GTCCTCTCA⁺TAAATCCCTACTC⁺ATATC-3’

D2S1776基因座：

5’-TGA⁺ACAC⁺AGAT⁺GTTAAGTG⁺TGTATATG-3’

5’-GTCTG⁺AGGT⁺GGACA⁺GTTAT⁺GAAA-3’

D1S1627基因座：

5’-CATG⁺AGGTTTGC⁺AAATACT⁺ATCTT⁺AAC-3’

5’-GTTTTA⁺ATTTTCTC⁺CAAAT⁺CTCCA-3’

D3S4529基因座：

5’-CCCAAAAT⁺TACT⁺TGAGC⁺CAAT-3’

5’-GAGAC⁺AAAATGA⁺AGAAACAG⁺ACAG-3’

D9S2157基因座：

5’-CAAAG⁺CGA⁺GACTCTGTC⁺TCAA-3’

5’-GAAAATG⁺CTATCCTCTTTGGTAT⁺AAAT-3’

D9S1122基因座：

5’-GGGTA⁺TTTCAAGATAACTGTA⁺GATAGG-3’

5’-GCTT⁺CTGAAAG⁺CTTCTAGTT⁺TACC-3’

D10S1435基因座：

5’-TGTTATA⁺ATGCATTGA⁺GTTTTATTCTG-3’

5’-GCCTGT⁺CTCAAAAAT⁺AAAGA⁺GATAGA⁺CA-3’

D12ATA63基因座：

5’-GAG⁺CGAGAC⁺CCTGTC⁺TCAAG-3’

5’-GGAAAAG⁺ACATA⁺GGATAGC⁺AATTT-3’

D20S1082基因座：

5’-ACATGTAT⁺CCCAGA⁺ACTTAAAGTAAAC-3’

5’-GCAG⁺AAGGGAAAAT⁺TGAAGCTG-3’。

3.一组用于微量降解生物样本中12个miniSTR基因座分析的ZNA引物，其特征在于：所述的ZNA引物用于扩增以下12个miniSTR基因座：D10S1248、D2S441、D1S1677、D6S474、D2S1776、D1S1627、D3S4529、D9S2157、D9S1122、D10S1435、D12ATA63和D20S1082；

所述的一组ZNA引物的序列为：

D10S1248基因座：

5’-TTA⁺ATGAATTGAACA⁺AATGAGTG⁺AG-3’

5’-GCAAC⁺TCTGGTTGTA⁺TTGTCTTCAT-3’

D2S441基因座：

5’-CTG⁺TGGCTCATCTA⁺TGAA⁺AACTT-3’

5’-GAAG+TGGC+TGTGGT+GTTATGAT-3’

D1S1677基因座：

5’-TTC⁺TGTTGGTA⁺TAGAGCAGTGTTT-3’

5’-GTGAC⁺AGGAA⁺GGACGG⁺AATG-3’

D6S474基因座：

5’-GGTTT⁺TCCA⁺AGAGATAGACCA⁺ATTA-3’

5’-GTCC⁺TCTCAT⁺AAATCCCTACTC⁺ATATC-3’

D2S1776基因座：

5’-TGAACA⁺CAGATG⁺TTAAGTGTG⁺TATATG-3’

5’-GT⁺CTGAGGTGGA⁺CA⁺GTTA⁺TGAAA-3’

D1S1627基因座：

5’-CATGAG⁺GTTTGCA⁺AATACTA⁺TCTTAAC-3’

5’-GTTTT⁺AA⁺TTTTC⁺TCCAAATC⁺TCCA-3’

D3S4529基因座：

5’-CCCAAAA⁺TTA⁺CTTGAGCCA⁺AT-3’

5’-GAGA⁺CAAAATGA⁺AGAAACAGAC⁺AG-3’

D9S2157基因座：

5’-CAAAGCGA⁺GA⁺CTC⁺TGTC⁺TCAA-3’

5’-GAAAAT⁺GCTA⁺TCCTCT⁺TTG⁺GTATAAAT-3’

D9S1122基因座：

5’-GGGT⁺ATTTCAAG⁺ATAACTGTA⁺GATAGG-3’

5’-GCTTC⁺TGA⁺AAG⁺CTTCTAGT⁺TTACC-3’

D10S1435基因座：

5’-TGTTA⁺TA⁺ATGCATTGAG⁺TTTTATTCTG-3’

5’-GC⁺CTGT⁺CTCAAAA⁺ATAAAGAGA⁺TAGA⁺CA-3’

D12ATA63基因座：

5’-GAGCG⁺AGA⁺CCCTGT⁺CTCAAG-3’

5’-GGAAAA⁺GACA⁺TA⁺GGATAGCA⁺ATTT-3’

D20S1082基因座：

5’-ACATG⁺TAT⁺CCCAGA⁺ACT⁺TAAAGTAAAC-3’

5’-GCAG⁺AAG⁺GGA⁺AAAT⁺TGA⁺AGCTG-3’。