CN112592981A - 用于dna档案建库的引物组、试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于DNA档案建库的引物组、试剂盒和方法。引物组针对25个常染色体STR基因座，1个X，Y染色体同源基因位点、AMEL，27个Y‑STR基因座，25个X‑STR基因座，33个全球人群常见常染色体SNP位点，28个东亚人群常见Y染色体SNP位点以及3个线粒体高变区。位点经过高级筛选，可以满足各种司法或法医鉴定用途，累积个体识别率达到0.99999999999999，能满足中国汉族及世界大部分人的个体识别应用。引物如SEQ ID NO.：1～284所示。引物组可以直接用于多重PCR，多重PCR联合二代测序技术只需要一轮实验即可最大程度获得检材的遗传标记信息。适用于新生儿出生医学证明DNA档案建库、亲子鉴定、DNA比对、群体遗传学研究等应用场景，也适合严重降解、腐化样本检测，有重要价值。

Description

用于DNA档案建库的引物组、试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及用于DNA档案建库的引物组、试剂盒和方法。
背景技术
早在1989年，我国指纹图技术成果鉴定会上，就有法医学专家、公安部及科技部的领导提出过建立“DNA指纹数据库”的设想。2005年，我国公安系统DNA数据库投入运行，经过十多年的发展，DNA数据库数据容量剧增。截至2016年5月，全国公安机关DNA数据库总量达到4400万条，2015年利用DNA检测技术破获各类案件17万余起，其中成功帮助3555名多年前被拐儿童找到了亲生父母。DNA数据库已成为公安机关打击犯罪，维护治安的重要工具。
STR技术仍是当前法医DNA领域的主流技术。首先，我国公安机关400余个DNA实验室，对于其中90％以上的实验室，基于PCR-CE方法进行STR分析是唯一的技术手段(又称CE-STR技术)；第二，CE-STR技术平台的STR分析仍是DNA鉴定金标准；第三，全球各国DNA数据库均基于STR基因座。然而，当前全球仍存在大量积案，并且检材已无法再次获得。由于CE-STR技术可分析的STR基因座数量有限，并且应对复杂样本、微量DNA样本或严重降解样本时，可能要进行多轮实验，如分别对常染色体STR基因座、X染色体STR 基因座、Y染色体STR基因座、线粒体基因进行检测，但是不少案件得到的DNA量有限，不能满足多轮实验检测。此外，有学者研究发现，在核心STR基因座检测中CE-STR平台检测结果中30％的纯合子经测序验证为杂合子，CE-STR技术仅区分等位基因的片段大小，核苷酸数量相等的所有等位基因会被认为是同一个等位基因。近年来，随着二代测序(Next generationsequencing，NGS)技术的成熟和测序成本大幅下降，NGS逐渐应用于法医学STR 分型研究。相比于CE分型，NGS技术在STR分析中具有很多优势：1、NGS技术能够得出完整的STR的碱基序列，即除了可获得STR基因座长度多态性信息，还可明确内部序列组成，得到的信息更多，不同个体的STR基因座之间的差别一目了然，尤其是对于复杂重复的基因座以及混合样本；2、CE-STR技术受荧光种类限制，可组合检测的STR基因座较少， NGS_STR的探针不需要荧光标记，可一次性检测成百上千个基因座；3、NGS_STR技术对混合样本或严重降解、腐败样本的检测能力较高；4、NGS_STR技术具有开放性，发现、分析额外基因突变的能力更胜一筹；5、NGS_STR技术成本低，通过对每个样本检材添加标签一次可以同时对多个样本进行平行测序，既节约了时间又降低了测序成本；6、NGS_STR与传统毛细胞电泳CE-STR技术的数据兼容性良好；7、NGS技术还可以通过一次实验，同时获得众多的常染色体STR基因座、X染色体基因座、Y染色体基因座、SNP位点、线粒体基因突变等遗传标记信息，为司法或法医DNA鉴定提供了重要参考信息。
随着二代测序技术的成熟，Illumina公司推出了基于二代测序技术的法医基因组分析系统—MiSeq FGx TM系统，并配套二代测序试剂盒—Forenseq DNA Signature Prep试剂盒，该试剂盒包含27个常染色体STR基因座、26个Y-STR基因座、7个X-STR基因座、94 个身源识别SNP基因座、22个表型SNP基因座和56个祖源来源SNP基因座，支持 STR、SNP、线粒体DNA等多种法庭科学分子标记检测与分析。然而，其价格昂贵。
随着国产高通量基因测序仪的开发，大幅降低了测序成本，现有技术已经开发出了多种基于STR位点和SNP位点的引物组及试剂盒，一般检测位点较多，以保证数据的可靠性。但是这些技术也存在检测位点过多，部分检测位点的选择缺乏特异性或者个体识别能力不高，导致检测成本依然较高，同时数据量过大，对后续数据分析及司法鉴定标准的建立也带来困扰；PCR捕获目标基因座或区域后，还需要额外进行文库构建，实验流程繁琐，检测成本也较高。
开发出一种优化的用于DNA档案建库的引物组，对于降低成本，减少数据处理量，具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种优化的用于DNA档案建库的引物组、试剂盒及方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
用于DNA档案建库的引物组，其检测位点包含25个常染色体STR基因座，27个Y-STR基因座，25个X-STR基因座，33个全球人群常见常染色体SNP位点，28个东亚人群常见Y 染色体SNP位点以及3个线粒体高突变区，引物如SEQ ID NO.：1～284所示，其中，STR 位点对应的特异性引物如SEQ ID NO.：1～156所示；全球人群常见常染色体SNP位点对应的特异性引物如SEQ ID NO.：157～222所示；28个东亚人群常见Y染色体SNP位点对应的特异性引物如SEQ ID NO.：223～278所示；线粒体高突变区对应的特异性引物如SEQ ID NO.：279～284所示。
本发明的第二个方面，提供：
一种基于二代测序的个体识别试剂盒，包括样本处理液、PCR反应混合液、引物混合物、标签序列引物、核酸纯化磁珠、洗脱液，所述引物混合物中含有权利要求1所述的引物组。
在一些实例中，所述样本处理液的组分包括：无核酸酶水、TE缓冲液、10～50μg/mL糖原、10mM～50mM KCl的至少一种。
在一些实例中，所述标签序列引物结构由通用序列互补序列、8～22个碱基的index序列以及测序接头序列组成。
在一些实例中，不同index标签之间，至少有2个碱基的差异，GC含量20～70％。
在一些实例中，通用序列、测序接头序列可根据高通量测序平台类型进行设计或调整。高通量测序平台，包括但不限于MGISEQ测序平台、Ion torrent平台、Illumina平台、Roche454 平台等。
本发明的第三个方面，提供：
一种个体识别方法，包括如下操作：
使用样本处理液对样本进行处理，得到样本液；
多重PCR和NGS文库制备：使用权利要求1所述的引物组进行多重PCR，纯化得到NGS文库；
测序模板制备及高通量测序；
基因分型与个体识别：根据测序结果，确定样本或样本间的亲权概率、亲缘关系亲权指数、非父排除率、个体识别率。
在一些实例中，多重PCR的体系为：6μL样本液或DNA模板、12.5μL的2×PCR反应混合液、4μL的引物混合物、2.5μL标签序列引物、总体积25μL。
在一些实例中，多重PCR的程序为：95℃，5min，1个循环；98℃，10s，60℃，1-3 min，72℃，30s，16-24个循环；72℃，5min，1个循环；4℃，保持
在一些实例中，所述样本选自血片滤纸、FTA卡、血液、咽拭子。
在一些实例中，所述样本处理液的组分包括：无核酸酶水、TE缓冲液、10～50μg/mL糖原、10mM～50mM KCl的至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明一些实例的引物组，可以在一个反应管内，只进行一轮PCR扩增，就可捕获上百个遗传标记位点，一次测序实验可以安排数百上千例样本并行测序，获得遗传标记位点的基因分型数据，包括片段度多态性、碱基序列多态性及其他位点突变信息。克服了CE-STR技术对复杂样本，混合样本检材需要进行多轮实验，并且只能获得DNA长度多态性数据的缺陷。另外，有些限量检材不能满足多轮实验需求，多重PCR联合二代测序技术只需要一轮实验即可。
本发明一些实例的引物组，包含25个常染色体STR基因座，27个Y-STR基因座，25个X-STR基因座，33个全球人群常见常染色体SNP位点，28个东亚人群常见Y染色体SNP位点以及3个线粒体高突变区，适合用于新生儿出生医学证明DNA档案建库、亲子鉴定、DNA 比对、群体遗传学研究等应用场景，也适合严重降解、腐化样本检测，有重要价值。
本发明一些实例的引物组，所对应的位点经过高级筛选，无需检测庞大的位点数量，就可以满足各种司法鉴定或法医鉴定用途，累积个体识别率达到0.99999999999999，除了能满足中国汉族个体识别，还能满足世界大部分人的个体识别应用。
本发明一些实例的试剂盒，可以对血片、血液、口腔拭子/咽拭子等样本的PCR直扩，并且PCR扩增同时形成NGS文库，避免了复杂的核酸提取、也降低检测成本。
附图说明
图1是多重PCR捕获测序_78个STR位点测序深度分布图；
图2是多重PCR捕获测序_61个SNP位点测序深度分布图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例及其说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
相关遗传标记位点的筛选：
发明人通过自有程序，筛选了针对25个常染色体STR基因座，1个X，Y染色体同源基因位点(人类牙釉质蛋白基因Amelogenin，AMEL)，27个Y-STR基因座，25个X-STR基因座，33个常见于全球人群的常染色体SNP位点，28个东亚人群常见Y染色体SNP位点以及3个线粒体高变区的检测位点。具体的：
25个高度多态性的常染色体STR基因座(对应的引物序列如SEQ ID NO.：1～50所示)， 1个X，Y染色体同源基因位点(人类牙釉质蛋白基因Amelogenin，AMEL)(对应的引物序列如SEQ ID NO.：51～52所示)，与中国公安建库常用的几款基于CE-STR技术的常染色体STR遗传标记试剂盒检测位点高度重合(见表1)，可以兼容公安系统现有的数据库。单独使用这25个STR和AMEL位点进行DNA鉴定时的匹配概率就可达到1.98×10-29，可满足不存在混合他人样本污染的单一来源检材样本(如个人干血片、血液、口腔拭子/咽拭子等) 的个体识别，亲子鉴定，嫌疑犯DNA比对等应用场景。
27个Y-STR基因座(对应的引物序列如SEQ ID NO.：53～106所示)，与中国公安建库常用的几款基于CE-STR技术的Y-STR遗传标记试剂盒检测位点高度重合(见表2)，可以兼容公安系统现有的数据库。单独使用这27个Y-STR进行DNA鉴定时的非父排除率就可达到0.99999999999996，满足亲子鉴定非父排除率大于0.9999的要求。也适用于父系关系鉴定和性侵案件嫌疑犯DNA鉴定等应用场景。
25个遗传多态性丰富的国内外的常用X-STR基因座，分别是DXS101、DXS6795、DXS6801、DXS6803、DXS6804、DXS6807、DXS6810、DXS7130、DXS7132、DXS7423、 DXS7424、DXS8378、DXS9902、DXS9898、GATA31E08、GATA165B12、GATA172D05、 DXS10074、DXS10079、DXS10101、HPRTB、DXS10103、DXS10134、DXS10135和DXS10148 (对应的引物序列如SEQ IDNO.：107～156所示)。与中国公安建库常用的几款基于CE- STR技术的X-STR遗传标记试剂盒检测位点高度重合(见表3)，可以兼容公安系统现有的数据库。有效保证满足对X染色体遗传的跟踪(如母子关系单亲亲权鉴定，父女关系单亲亲权鉴定，适用于同父异母及缺乏双亲的姐妹亲缘鉴定，隔代认亲等)。
33个在东亚人、南亚人、欧洲人、非洲人、美国人都常见的常染色体SNP位点(对应的引物序列如SEQ ID NO.：157～222所示，相关位点信息见表4)，每个检测位点在上述所有人群中的Alt allele等位基因频率在0.34-0.64之间，使得单独使用这33个SNP进行个体识别时的匹配概率达到1.53×10-14，累积个体识别率可达到0.99999999999999，满足大部分世界人群的个体识别。
28个在东亚人群中常见的SNP位点(对应的引物序列如SEQ ID NO.：223～278所示)，遗传标记间距离大于15kb，以便使用少量SNP位点就能获得大量的Y染色体遗传追踪信息，并设计了引物，Y-SNP扩增产物尽量控制在150bp内，为更好的对DNA严重降解的检材进行基因分型提供技术支持。所选Y-SNP位点信息见表5。
3个线粒体DNA(简称mtDNA)高变区信息(对应的引物序列如SEQ ID NO.：279～284所示)。为降解严重的毛干、骨、牙等生物检材，在无法获取核基因组DNA或核基因组DNA 量不足而无法完成检测时进行线粒体DNA检测，帮助个体身份信息的确认。也可以用于母系亲缘关系如母子(女)、隔代外祖母/外孙(女)、舅甥关系、姨甥关系、同母的全同胞或半同胞亲缘关系鉴定。
表1本发明与常见一代CE-STR分型试剂盒检测位点比较
Figure RE-GDA0002962712990000051
Figure RE-GDA0002962712990000061
注：重合位点以“+”表示。
表2本发明与常见一代CE-STR Y-STR分型试剂盒检测位点比较(重合位点)
Figure RE-GDA0002962712990000062
Figure RE-GDA0002962712990000071
表3本发明与常见一代CE-STR X-STR分型试剂盒检测位点比较(重合位点)
Figure RE-GDA0002962712990000072
Figure RE-GDA0002962712990000081
表4本发明所筛选的个体识别33个常染色体SNP位点信息
Figure RE-GDA0002962712990000082
Figure RE-GDA0002962712990000091
表5本发明所筛选的东亚人群高突变Y-SNP位点信息
Figure RE-GDA0002962712990000092
Figure RE-GDA0002962712990000101
针对这些检测位点，发明人通过自有技术进行了多重PCR引物的设计，保证可以在一管内进行多重PCR反应并获得令人满意的扩增效果。
实施例1
本实施例提供了一种基于多重PCR以及二代测序技术的经济、快捷、高效、准确、用途广泛的个体识别方法，并且支持核酸免提取即PCR直扩，本实施例的二代测序采用华大智造 DNB-SEQ技术，以MGISEQ-2000测序平台SE400测序为例，对1例新生儿血卡样本进行 DNA档案建立，以及用2800M标准品作对照进行说明，包括以下步骤：
步骤1：引物混合物配置。分别对表1、表2、表3、表4和表5所述检测位点的特异性引物进行混合，使每条引物的反应终浓度为0.01-0.2uM(根据期望的STR位点与SNP位点、线粒体高变区测序深度需求，进行混合，与测序结果观察值进行比较，优化引物混合方案)。特异性引物5’包含通用引物序列，所述通用引物序列为MGISEQ测序接头的一部分序列，其中F引物的通用序列为5’-GAACGACATGGCTACGA-3’(SEQ ID NO.：285)，R引物5’端的通用序列为5’-AGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3’(SEQ ID NO.：286)。
标签引物设计，标签序列引物结构是由通用序列互补序列、8-22个碱基的index序列以及测序接头序列组成，本实施例使用的index序列长度为16个碱基。5'- TGTGAGCCAAGGAGTTNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT- 3’(SEQ ID NO.：287)，其中NNNNNNNNNN为index标签，不同index标签之间，至少有2个碱基的差异，GC含量20-70％(占index序列长度的34％或以上)碱基重复的出现。因后续的DNB-SEQ上机模板制备中需要对DNA文库进行环化等操作，因此，标签引物中还添加一条磷酸化修饰PCR引物，5'-PHO-GAACGACATGGCTACGA-3’(SEQ ID NO.：288)，磷酸化PCR引物与标签引物摩尔量为1：1～1.2。
步骤2：样本预处理。利用权利要求1、2所述的样本处理液，对待检标本进行简单的预处理，得到预处理样本液。预处理样本液无需进行核酸免提取，可直接投入到PCR反应中。
所述样本处理液由无核酸酶水、TE缓冲液(10mM Tris-HCl【pH 8.0】，0.1mMEDTA)、10～50μg/mL糖原、10mM-50mM KCl的一种或以上成分组成。
具体操作如下：使用打孔器在干血片样本中心位置取1个直径1.0mm血片，将血片置于 0.2mL离心管底部，添加30μL样本处理液，70℃孵育5分钟；短暂离心去除上清，添加30μL 无核酸酶水，使用移液器吹打混匀，避免产生气泡，短暂离心，去掉上清至剩余6μL(此时DNA浓度约0.2-2ng/μL，PCR抑制物浓度也在PCR体系可承受范围内)，作为下一步PCR 反应的模板。
步骤3：多重PCR和NGS文库制备。通过多重PCR实现在一个反应管里同时捕获权利要求3所述的所有检测位点并且形成NGS文库。PCR扩增体系为6μL步骤S1所得预处理样本液或DNA模板(投入量0.5-10ng)，12.5μL的2x PCR反应混合液，4μL的引物混合物，2.5μL标签序列引物，总体积25μL。多重PCR扩增程序为：95℃，5min，1个循环； 98℃，10s，60℃，2min，72℃，30s，20个循环；72℃，5min，1个循环；4℃，保持。
步骤4：PCR产物纯化。PCR下机后，短暂离心，把PCR产物转至含有25μL核酸纯化磁珠的1.5mL离心管或96孔浅孔板中，混匀，温室放置10min后，置于磁力架，待液体澄清后弃上清，保留磁珠，使用200μL 80％乙醇洗涤2次，最后用25μL洗脱液进行洗脱和回收PCR产物，同时也完成了NGS文库制备。
步骤5：测序模板制备及高通量测序。按照所用测序平台的官方说明书完成测序模板制备及高通量测序。
步骤6：基因分型与个体识别。使用个体识别数据分析套件进行数据质控、过滤、序列比对、分析得到检测位点的基因分型与碱基序列信息。
结果：
1)2800M标准品和干血片样本的测序原始数据中的总序列数分别为92万条、82万条 (MGISEQ-2000测序平台1个run即可满足成千上万个样本同时检测)；过滤后原始数据中质量值>＝20的碱基占比分别为83.11％、83.51％；质量值>＝30的碱基占比分别为74.25％、74.68％；比对到参考基因组上的序列数占比分别为99.67％、99.31％；比对到靶标区间上的序列数占比分别为98.07％、97.27％；平均测序深度分别为6061 ×、5414×；2800M标准品和干血片样本的所有目标检测位点的测序深度均大于100 ×，测序深度大于500×的占比分别为99.3％、98.6％，测序深度大于1000×的占比分别为97.1％、96.4％。图1是多重PCR捕获测序_78个STR位点测序深度分布图，图中78个STR位点由左到右依次为D1S1656、D2S441、D2S1338、TPOX、D3S1358、 FGA、CSF1PO、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D10S1248、D11S2368、TH01、vWA、D12S391、D13S317、D13S325、Penta E、D16S539、D18S51、D19S433、PentaD、 D21S11、D22S1045、Amelogenin、DYS19、DYS385a/b、DYS388、DYS389 I/II、DYS390、 DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、Y- GATA-H4、DYS456、DYS458、DYS460、DYS481、DYS518、DYS549、DYS533、 DYS570、DYS576、DYS627、DYS643、DYS635、DYF387S1a/b、DXS101、DXS6795、 DXS6801、DXS6803、DXS6804、DXS6807、DXS6810、DXS7130、DXS7132、DXS7423、 DXS7424、DXS8378、DXS9902、DXS9898、GATA31E08、GATA165B12、GATA172D05、 DXS10074、DXS10079、DXS10101、HPRTB、DXS10103、DXS10134、DXS10135和 DXS10148；图2是多重PCR捕获测序_61个SNP位点测序深度分布图，图中61个 SNP位点由左到右依次为rs7520386、rs4847034、rs1490413、rs993934、rs1872575、 rs6811238、rs279844、rs2046361、rs7704770、rs2811231、rs2503107、rs2073009、 rs1358856、rs13218440、rs10092491、rs7041158、rs702209、rs3780962、rs1498553、 rs10488710、rs2920816、rs2111980、rs354439、rs722290、rs9951171、rs7229946、rs521861、 rs1736442、rs1493232、rs576261、rs1523537、rs2833736、rs221956、rs77711040、 rs13447361、rs77461301、rs74454695、rs79730708、rs79517187、rs75118556、rs78945156、 rs75220363、rs74392032、rs75113834、rs79823174、rs74364776、rs77347063、rs17269816、 rs76366888、rs75702914、rs79205706、rs76853414、rs17316592、rs17269928、rs77063702、 rs78149062、rs78109950、rs2075640、rs9306845、rs9786707和rs16980711。从图1和图2可以看出，多重PCR的结果良好，可以同时有效扩增出目标区域，目标检测位点测序深度最高值最低值相差在1个数量级范围内，且2800M DNA标准品和干血片的捕获测序性能相当；
2)本个体识别体系78个STR基因座的基因分型与通过科学验证的2800M标准品基因分型结果完全一致，基因分型结果见表5；
3)本个体识别体系实现了对干血片样本的经济、简单、快捷的DNA档案建立，一次实验就成功地获得了78个STR基因座、117SNP和mtDNAHVR I/II/III区域的遗传标记信息。其中，与Illumina ForenSeq DNA特征制备试剂盒检测共同存在的遗传标记位点基因分型结果完全一致，表6为本识别vs MiSeq FGx Forensic Genomics System 基因分型结果，“－”代表对应试剂盒中不包括该位点；
4)大量的遗传标记信息可为日后进行高级数据分析，关联分析具体的遗传标记信息进而应用于亲权概率、亲缘关系、亲权指数、非父排除率、个体识别率、打击犯罪等场景。
表5本个体识别体系与2800M标准品基因分型结果比较
Figure RE-GDA0002962712990000131
表6本个体识别体系与MiSeq FGx对同一血卡样本的基因分型结果比较
Figure RE-GDA0002962712990000132
Figure RE-GDA0002962712990000141
Figure RE-GDA0002962712990000142
Figure RE-GDA0002962712990000143
Figure RE-GDA0002962712990000151
“－”代表对应试剂盒中不包括该位点。
<110> 广州精科医学检验所有限公司
深圳精科基因科技有限公司
<120> 用于DNA档案建库的引物组、试剂盒和方法
<160> 288
<210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 1 gagaaataga atcactaggg aacca 25
<210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 2 gggtcattgt aaaggtcttc atcctta 27
<210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 3 gcacccaaca ttctaacaaa agg 23
<210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 4 accacaccca gccataaata ac 22
<210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 5 gtttcttgtt gatacatttg ctggc 25
<210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 6 tttggaaaca gaaatggctt gg 22
<210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 7 gcacagaaca ggcacttagg 20
<210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 8 cgctcaaacg tgaggttg 18
<210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 9 cgctagggag ccttgtgatg at 22
<210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 10 cagcctcctc caatggtcac ag 22
<210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 11 cttaactggc attcatgg 18
<210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 12 ggttgtaggt attatcacgg 20
<210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 13 ccggaggtaa aggtgtctta aagt 24
<210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 14 atttcctgtg tcagaccctg tt 22
<210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 15 taggctgttg aggtagtttc ctaag 25
<210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 16 gcaagtatgt gacaagggtg attt 24
<210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 17 ttcccttgtt ctgaggcttt tgt 23
<210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 18 tttcctttca tacagaatgg cact 24
<210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 19 atgttggtca ggctgactat gg 22
<210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 20 gattccacat ttatcctcat tgacag 26
<210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 21 gaagaaagcc gttaaaagca tc 22
<210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 22 tcatcactgt atcgtatccc attg 24
<210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 23 aaagcaaacc tgagcattag cc 22
<210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 24 ccaactagat cctgtgagaa accata 26
<210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 25 atgaagtggg taggataggg att 23
<210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 26 ctcctccaag agctttccag ac 22
<210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 27 acagggaaca cagactccat 20
<210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 28 ctagtcagca ccccaaccag 20
<210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 29 gatataggat agataactag atacaa 26
<210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 30 agtatgtgac ttggattgat ct 22
<210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 31 gagaaagaat caacaggatc aatgg 25
<210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 32 tcctgtcttt gtactctggg actta 25
<210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 33 gacccatcta acgcctatct gta 23
<210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 34 ttgggtagga aaaagagtgg ag 22
<210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 35 tgtgctatct cctccaacgg tc 22
<210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 36 ggagagattc ctaatttccc ctgt 24
<210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 37 gttaatactg gacattgtgg gg 22
<210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 38 gattgaagtg agccgaga 18
<210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 39 gtacaagtgc cagatgctcg tt 22
<210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 40 tggtaaaaca gcctacagag tgatt 25
<210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 41 ctgaggcagg aggagttctt ga 22
<210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 42 cgactaccag caacaacaca aataaac 27
<210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 43 cctggggttc taggaatcaa tc 22
<210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 44 ggctgcaaaa agctataatt gtaccac 27
<210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 45 tacactccag cctaggtga 19
<210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 46 tttgcctaac ctatggtca 19
<210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 47 gcttgtagat ggtctgttat ggg 23
<210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 48 gtcaatgttc tccagagaca gactaat 27
<210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 49 tagattttcc ccgatgatag tagtc 25
<210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 50 ctcaggcaag tccctaaggc tc 22
<210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 51 aagctaccac ctcatcctgg 20
<210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 52 cacaggcttg aggccaacca t 21
<210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 53 ggcaccagga gtaatacttc gg 22
<210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 54 gacaagccca aagttcttaa cattc 25
<210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 55 agcatgggtg acagagctag 20
<210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 56 tgggatgcta ggtaaagctg g 21
<210> 57 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 57 gaattccatg tgaagttagc cgtttagc 28
<210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 58 gaggcggagc ttttagtgag 20
<210> 59 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 59 ccaactctca tctgtattat ctatga 26
<210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 60 tcttatctcc acccaccaga tg 22
<210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 61 tgagtgggag aaatggatga ca 22
<210> 62 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 62 cagacttcaa tatcacagaa catcg 25
<210> 63 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 63 acctatcatc catccttatc tcttg 25
<210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 64 ggtttcttgg cttcagtact aggg 24
<210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 65 agacccagtt gatgcaatgt 20
<210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 66 tcattaatct agcttttaaa aacaa 25
<210> 67 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 67 ttcctaatgt ggtcttctac ttgtgtc 27
<210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 68 ctaaaaacaa gccagataac gtgtg 25
<210> 69 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 69 tgagtagctg ggactatggg cg 22
<210> 70 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 70 gtgagaccct gtcattcata gatagat 27
<210> 71 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 71 gtggggaata gttgaacggt aa 22
<210> 72 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 72 atcacccagg gtctggagtt cg 22
<210> 73 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 73 catgcctatg tcctgaatgg tac 23
<210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 74 ctggcttgga attcttttac cc 22
<210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 75 tgtcaaagag cttcaatgga ga 22
<210> 76 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 76 tcttccttaa cgtgaatttc ctca 24
<210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 77 tggagtctct caagcctgtt ctat 24
<210> 78 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 78 cctggaagtg gagtttgctg ta 22
<210> 79 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 79 gagacctaag cagagatgtt ggttttc 27
<210> 80 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 80 cctctgatgg tgaagtaatg gaattaga 28
<210> 81 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 81 ctgccctcaa acattggact ct 22
<210> 82 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 82 cactgtgttc agtcactggt tcttt 25
<210> 83 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 83 catggcagct gcctctaatg tg 22
<210> 84 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 84 atttcctgac cttgtgatcc ag 22
<210> 85 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 85 gaggaatctg acacctctga ca 22
<210> 86 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 86 gtccatatca tctatcctct gccta 25
<210> 87 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 87 tgagagtgtt gcgagagtta gatg 24
<210> 88 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 88 cagagcccca caacccaaga ag 22
<210> 89 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 89 ccagcctggg caacacaag 19
<210> 90 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 90 ctaatcacat cttcagctct taccatg 27
<210> 91 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 91 tgtaagccaa acccaaatat agcag 25
<210> 92 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 92 tggcataagt ggtaatgtcc cc 22
<210> 93 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 93 tattcatcta acatctttgt catctacc 28
<210> 94 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 94 attaacttgc ctttttgcat cc 22
<210> 95 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 95 tttttgagag gagattagga gca 23
<210> 96 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 96 ttattcagca tagtcaagaa accag 25
<210> 97 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 97 cttgggctga ggagttcaat ct 22
<210> 98 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 98 ccatgattca attaccttcc actag 25
<210> 99 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 99 cgggagggtg tgactggaga at 22
<210> 100 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 100 ccttctttcc ttccttactt cca 23
<210> 101 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 101 ggaatggtgg gtcattgaac ct 22
<210> 102 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 102 gagggataaa agactacata ttggg 25
<210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 103 accagcccaa atatccatca 20
<210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 104 tggaatgctc tcttggcttc 20
<210> 105 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 105 agaacatctg tgtatcagtg ctggt 25
<210> 106 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 106 gctagattcc attttacccc taaca 25
<210> 107 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 107 taatatcagt tttatccccg ctacagg 27
<210> 108 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 108 ctccatggca catgtatact tatgt 25
<210> 109 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 109 tgtctgctaa tgaatgattt gg 22
<210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 110 ccatccccta aacctctcat 20
<210> 111 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 111 tttccagaga gtcagaatca gtagg 25
<210> 112 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 112 catgcaagct tccagattcg ttata 25
<210> 113 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 113 gtaacttcag agggaaaaaa agacc 25
<210> 114 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 114 gcaggtcctg cacacgtatc ct 22
<210> 115 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 115 tggggtctca ctatattgcc taa 23
<210> 116 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 116 agccaagacg ctacctacac ac 22
<210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 117 gagcaatgat ctcatttgca 20
<210> 118 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 118 aagtaaacat gtataggaaa aagct 25
<210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 119 acagaaaacc ttttgggacc 20
<210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 120 cccagccctg aatattatca 20
<210> 121 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 121 ttggaatata gaggaagggg aaatc 25
<210> 122 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 122 aggcacggaa gaggtaacag aa 22
<210> 123 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 123 gtgtgatgac attagagagc cagtt 25
<210> 124 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 124 ccattggttc ttctgattct gactttc 27
<210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 125 gtcttcctgt catctcccaa c 21
<210> 126 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 126 tagcttagcg cctggcacat a 21
<210> 127 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 127 tcatccaggg ttcatagtgt cag 23
<210> 128 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 128 gagtgcttgt agtcccaggt attt 24
<210> 129 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 129 gcgacaagag cgaaactcca ac 22
<210> 130 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 130 ttgcagtcct acgcttttcc ga 22
<210> 131 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 131 cagattgaaa gggatgacga aa 22
<210> 132 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 132 attcatatca ggagtatggg atcac 25
<210> 133 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 133 taacctcccc cgagcacacc ta 22
<210> 134 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 134 aatgccctcg tgtaattgtc tc 22
<210> 135 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 135 attcttgaag tgggaggtta tgac 24
<210> 136 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 136 ggaccaagca aatcaataga aacac 25
<210> 137 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 137 ctctcttgac aacagatttc taagcc 26
<210> 138 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 138 agccaagcca aggtgacaga ta 22
<210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 139 tagtggtgat ggttgcacag 20
<210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 140 ataattgaaa gcccggattc 20
<210> 141 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 141 ttcctactgc cccaccttta tt 22
<210> 142 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 142 gtgaatgtct cctctgctag aaagt 25
<210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 143 gctgagattg tgccaatgct c 21
<210> 144 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 144 ccttgcatcc taggtgtaaa tcc 23
<210> 145 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 145 aattgttgaa gctgggtgat gg 22
<210> 146 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 146 tcacagcccc tacacaagat ttat 24
<210> 147 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 147 gtataccact ttgatgttga cactagtt 28
<210> 148 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 148 taatacacat ccccattcct gc 22
<210> 149 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 149 tcaggaggct ttcagacttg ga 22
<210> 150 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 150 tggactctca cacaccattg tattag 26
<210> 151 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 151 cactccagcc tgggtgacat 20
<210> 152 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 152 tatgaacaga taactggttg agcc 24
<210> 153 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 153 tcgtgcctgg cctataattt ta 22
<210> 154 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 154 cgaaaatggt actgaggaat atgga 25
<210> 155 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 155 gacagaggga gattctgtct caac 24
<210> 156 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 156 aaaagacaat atgggttaat atgtgc 26
<210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 157 tccaccaagg gaacgtgagg 20
<210> 158 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 158 agggattgct ggatcatacg g 21
<210> 159 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 159 gctcagcaca gaaataaaag ctct 24
<210> 160 <211> 29 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 160 ctatagggaa catttaatga cctatgtag 29
<210> 161 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 161 tcctcaaaag acttaaatga cctgg 25
<210> 162 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 162 agctctctga cctctgggtt ga 22
<210> 163 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 163 gggtttgcca tgtttgtcac ag 22
<210> 164 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 164 gtatgtaaac ttgtcaattg cttcatc 27
<210> 165 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 165 ctgttttgcc ctgttctttg tg 22
<210> 166 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 166 cttccctcat tccattggca g 21
<210> 167 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 167 taaacctgta ttcacccaaa tatcatag 28
<210> 168 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 168 gctagagatg ttgggcctct acat 24
<210> 169 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 169 atttcatcat ggtacaaaca ttatcac 27
<210> 170 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 170 cctcgcctac tgtgctgttt ct 22
<210> 171 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 171 agagtggcat tagaaattcc agatag 26
<210> 172 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 172 gcaatggtga gaggttgatg gt 22
<210> 173 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 173 tggatacagt cattgactta tataggct 28
<210> 174 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 174 atcctcaaaa acaaagaaac atgg 24
<210> 175 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 175 tgttttctct cagctgcaat taatact 27
<210> 176 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 176 ggactgcact ttgcgaaaca t 21
<210> 177 <211> 29 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 177 tctaaaccta ttccactaac ttcaggaac 29
<210> 178 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 178 acggagcgga ggcaccag 18
<210> 179 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 179 ctcaaattgc aggttgcgat ag 22
<210> 180 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 180 accaaatgac tgtatgaaat tacgttc 27
<210> 181 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 181 gggatgcaac atgagagagc ag 22
<210> 182 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 182 agaaggaaac atccagcaaa cat 23
<210> 183 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 183 ttgggttaca ttgtccctgc tc 22
<210> 184 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 184 cccactcaac acacagaaac atc 23
<210> 185 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 185 caaagctatt ctctcttttg ggtg 24
<210> 186 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 186 cctcccctcc catcaacct 19
<210> 187 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 187 catgggtggg gtttcagtct g 21
<210> 188 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 188 cacttggata cctagagagg ctaaac 26
<210> 189 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 189 gtcctctgag atgatgaatg ctttg 25
<210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 190 ggtgggaggt ggcatcacag 20
<210> 191 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 191 actgttgctg agaaggtaga ttggt 25
<210> 192 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 192 acacctgaac cagacacttc tcact 25
<210> 193 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 193 tgaatgacat ttcttcactt gacttaac 28
<210> 194 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 194 atcactccca cttcaaggct gt 22
<210> 195 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 195 accaggcatt tgaccttcta gc 22
<210> 196 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 196 tatcaaggaa gtttagagag ttgtgag 27
<210> 197 <211> 29 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 197 ctatttgtat gtatctattg tctatgaac 29
<210> 198 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 198 ccctgggggt ggttctgac 19
<210> 199 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 199 tcattgtggt tttgatttgt atttct 26
<210> 200 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 200 ctccacaacc atttaggcaa ctt 23
<210> 201 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 201 cagctgccta acttctggaa actc 24
<210> 202 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 202 aagtatttaa ttttgctggc agtgt 25
<210> 203 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 203 tcagaggcag tgggagctgt ac 22
<210> 204 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 204 gctgcagaaa accaaatgga ag 22
<210> 205 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 205 gagaataaca ttgcctctcc tttg 24
<210> 206 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 206 gccattggaa gaatgatcag ttg 23
<210> 207 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 207 gtgactggtg gtgtgtattc tgc 23
<210> 208 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 208 ttcttccctt ctcagcactt cc 22
<210> 209 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 209 actgtattag gagttcccac ttgttc 26
<210> 210 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 210 tcaaattcca tgctatcaat tgc 23
<210> 211 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 211 tctcttttta tccctttcct gtctgg 26
<210> 212 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 212 aagaggggtg ttctggtggc 20
<210> 213 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 213 tcccaaggta ggaccagaag tg 22
<210> 214 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 214 cactggacgg aggtcacgag 20
<210> 215 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 215 tgggcagact tggataaagc ag 22
<210> 216 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 216 cacagccatc tgctggacct 20
<210> 217 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 217 ccaccacacc cagctcctct 20
<210> 218 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 218 caaactagag attcacagtg atccatac 28
<210> 219 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 219 aaaggcattt ttctctcatc ttgtt 25
<210> 220 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 220 gttactgtga ggactgggtg agac 24
<210> 221 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 221 tcacaaaatc agcacaaatg gc 22
<210> 222 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 222 gctggaagag tttgggggtc 20
<210> 223 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 223 ctaggcgagg cacaaaggaa t 21
<210> 224 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 224 aggaacatag caagacccaa aatc 24
<210> 225 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 225 caattggtga caagggcata gg 22
<210> 226 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 226 gctttatgcc cgactaactc agg 23
<210> 227 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 227 ttgtaattaa atgcttttcc cactgt 26
<210> 228 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 228 actctcagtg gtgtcccagg gt 22
<210> 229 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 229 gttttaccca acatgatagc agatacag 28
<210> 230 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 230 tcactggcca actgacaaat cc 22
<210> 231 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 231 cacaaaacca cccatgtact tgact 25
<210> 232 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 232 gacattttac catttcctct ccca 24
<210> 233 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 233 tcaaagaaca caacaggcaa acac 24
<210> 234 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 234 tcattgattt cactactttg atttgct 27
<210> 235 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 235 ttggaaaatg aggcataaaa cattc 25
<210> 236 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 236 cattttccta accacaagca tcat 24
<210> 237 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 237 tggtctcttt gggtgaaaga ctacat 26
<210> 238 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 238 ttctgtaata caggtgtaga ggtctcc 27
<210> 239 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 239 ggcacccact agccagtcaa c 21
<210> 240 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 240 tggtgagtga aggcaacact gag 23
<210> 241 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 241 ctccttatga ccttcaatca ttcact 26
<210> 242 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 242 tctgtttaat cgctcacctt ttct 24
<210> 243 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 243 gataggtaag tgttcctagc ttagcagt 28
<210> 244 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 244 ggaaggttct atccttggac tagtg 25
<210> 245 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 245 ttttcccctg agagcatgaa ttag 24
<210> 246 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 246 cctaagagag tatgttgcct cgtg 24
<210> 247 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 247 taaatcagta tgggagatca tcagc 25
<210> 248 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 248 tataaaatga cagtcttgac ctctaaac 28
<210> 249 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 249 ctatttttct atgtagggga gttgtg 26
<210> 250 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 250 tctacaaaaa cgtagatata tgccaat 27
<210> 251 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 251 tgaaggcaac tcttaaaaat gacc 24
<210> 252 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 252 tcatgatatt cacatttctg aaatgc 26
<210> 253 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 253 aaagtaaggt ttgcaccaaa gtctg 25
<210> 254 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 254 ctagagaagt tgtaccataa aagcaaca 28
<210> 255 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 255 cagaaggatc cataccaggc tgt 23
<210> 256 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 256 agctagggac cttgtgtatc atgac 25
<210> 257 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 257 agagtggcac attagacctc atgac 25
<210> 258 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 258 catgaccctt ccgtggataa tc 22
<210> 259 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 259 tttgcatttg cagtgtcact tgag 24
<210> 260 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 260 gtttcttaac ttaatgtggt tacaacag 28
<210> 261 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 261 ggaaaggcac cacggcac 18
<210> 262 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 262 gagggtgaga ggcatccttt tc 22
<210> 263 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 263 caaccttaaa aaccagcgag acc 23
<210> 264 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 264 ttcttccaca cactttctca gagc 24
<210> 265 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 265 gcataagtgg ctaacttcta aatatgg 27
<210> 266 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 266 ttgttcctat aacaacatgg cttatc 26
<210> 267 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 267 aatccaccac cacaaaccct t 21
<210> 268 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 268 aagacgaaac ttgtgaagca aagg 24
<210> 269 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 269 catggcttat cattgcccaa ac 22
<210> 270 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 270 gagttgccat ctgtcccctc t 21
<210> 271 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 271 caacatgatg aacgtttgag acaaag 26
<210> 272 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 272 gcataccata caaacggtct gactc 25
<210> 273 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 273 agtgactgca aatggtatgc aac 23
<210> 274 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 274 acaaaccaaa tggacaccga gt 22
<210> 275 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 275 gcagtcaccc agacattact tatcc 25
<210> 276 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 276 caacaaagga gtgtgactgt gtacc 25
<210> 277 <211> 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 277 gtagaaacag attgtactag gtgaggtt 28
<210> 278 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 278 cactgatctt gagggtgagg ttc 23
<210> 279 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 279 tgcatttggt attttcgtct gg 22
<210> 280 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 280 gcagagatgt gtttaagtgc tgtg 24
<210> 281 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 281 gaaccctaac accagcctaa cc 22
<210> 282 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 282 ttgtttatgg ggtgatgtga gc 22
<210> 283 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 283 tcaacaaccg ctatgtattt cg 22
<210> 284 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 284 gggatattga tttcacggag gat 23
<210> 285 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 285 gaacgacatg gctacga 17
<210> 286 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 286 agaccgcttg gcctccgact t 21
<210> 287 <211> 58 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <221> misc_feature <222> (17)..(26) <223> n is a, c, g, t or u <400> 287 tgtgagccaa ggagttnnnn nnnnnnttgt cttcctaaga ccgcttggcctccgactt 58
<210> 288 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 288 gaacgacatg gctacga 17

Claims (10)

1.用于DNA档案建库的引物组，其扩增位点和引物对如下：
STR位点及对应的特异性引物：
Figure FDA0002810794580000011
Figure FDA0002810794580000021
Figure FDA0002810794580000031
Figure FDA0002810794580000041
33个全球人群常见常染色体SNP位点及其特异性引物序列：
Figure FDA0002810794580000042
Figure FDA0002810794580000051
28个东亚人群常见Y染色体SNP位点及其特异性引物序列：
Figure FDA0002810794580000052
Figure FDA0002810794580000061
线粒体高突变区及其特异性引物：
线粒体高突变区 正向引物序列 编号 反射引物序列 编号 HVS-II TGCATTTGGTATTTTCGTCTGG 279 GCAGAGATGTGTTTAAGTGCTGTG 280 HVS-III GAACCCTAACACCAGCCTAACC 281 TTGTTTATGGGGTGATGTGAGC 282 HVS-I TCAACAACCGCTATGTATTTCG 283 GGGATATTGATTTCACGGAGGAT 284
。
2.一种基于二代测序的个体识别试剂盒，包括样本处理液、PCR反应混合液、引物混合物、标签序列引物、核酸纯化磁珠、洗脱液，其特征在于：所述引物混合物中含有权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的个体识别试剂盒，其特征在于：所述样本处理液的组分包括：无核酸酶水、TE缓冲液、10～50μg/mL糖原、10mM～50mM KCl的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的个体识别试剂盒，其特征在于：所述标签序列引物结构由通用序列互补序列、8～22个碱基的index序列以及测序接头序列组成。
5.根据权利要求4所述的个体识别试剂盒，其特征在于：不同index标签之间，至少有2个碱基的差异，GC含量20～70％。
6.一种个体识别方法，包括如下操作：
使用样本处理液对样本进行处理，得到样本液；
多重PCR和NGS文库制备：使用权利要求1所述的引物组进行多重PCR，纯化得到NGS文库；
测序模板制备及高通量测序；
基因分型与个体识别：根据测序结果，确定样本或样本间的亲权概率、亲缘关系亲权指数、非父排除率或个体识别率。
7.根据权利要求6所述的一种个体识别方法，其特征在于：多重PCR的体系为：
6μL样本液或DNA模板、12.5μL的2×PCR反应混合液、4μL的引物混合物、2.5μL标签序列引物、总体积25μL。
8.根据权利要求7所述的一种个体识别方法，其特征在于：多重PCR的程序为：95℃，5min，1个循环；98℃，10s，60℃，1-3min，72℃，30s，16-24个循环；72℃，5min，1个循环；4℃，保持。
9.根据权利要求6～8任一项所述的一种个体识别方法，其特征在于：所述样本选自血片滤纸、FTA卡、血液、咽拭子。
10.根据权利要求6～8任一项所述的一种个体识别方法，其特征在于：所述样本处理液的组分包括：无核酸酶水、TE缓冲液、10～50μg/mL糖原、10mM～50mM KCl的至少一种。
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