CN112941151B - 一种利用RNA-seq技术构建EST-SSR标记的方法与应用 - Google Patents
一种利用RNA-seq技术构建EST-SSR标记的方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种利用RNA‑seq技术构建EST‑SSR标记的方法与应用，包括如下步骤：利用RNA‑seq技术，构建RNA‑seq序列文库；将RNA‑seq序列文库中获得的片段进行组装，得到转录本；利用Misa软件对原生地样本转录本进行SSR预测和鉴定，得到SSR位点；设计SSR位点的引物，得到SSR引物对；利用blast软件将SSR引物对分别与入侵地样本转录本和原生地样本转录本进行序列相似比对，得到电子模拟PCR扩增片段，筛选片段大小不一致的标记，为EST‑SSR标记，最后进行PCR实验验证，分析这些标记在紫茎泽兰群体中的遗传多态性。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种利用RNA-seq技术构建EST-SSR标记的方法与应用。
背景技术
紫茎泽兰(Ageratina adenophora Spreng)属菊科泽兰属多年生亚灌木草本植物，原产于墨西哥等南美地区，上世纪40年代被作为观赏植物引入到欧洲，现在已成为一种世界性的恶性杂草，是典型的入侵植物，称作是植物界的“杀手”，造成了巨大的经济损失和生态环境破坏。在我国，紫茎泽兰已成为第一号入侵植物，在云南、贵州、四川、广西、西藏等地造成严重危害。因此，解析紫茎泽兰群体遗传多样性和遗传结构，以明确其入侵扩张的路线和途径，弄清其入侵定植分子机制，对有效防治和治理紫茎泽兰入侵具有重要意义。SSR等分子标记是开展植物群体遗传多样性和群体结构研究的不可或缺的重要工具。但目前，紫茎泽兰的分子生物学研究还比较薄弱，可用的分子标记资源比较少，现有技术利用紫茎泽兰的基因组探查序列开发了部分核基因组的SSR标记，但其多态性不太好，这限制了紫茎泽兰入侵机制研究的深入。
转录组测序(RNA-seq)技术是利用高通量测序技术对某一状态下的组织或者细胞中的RNA进行深度测序的技术，是一种在转录组水平上高通量、低成本分析基因表达差异的有效手段。同时，对于参考基因组未知的物种，RNA-seq技术也可以高效率、高通量、低成本地获得大量的转录本信息和资源。但是，到目前为止，现有技术中并未发现将RNA-seq技术应用于对紫茎泽兰的研究中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用RNA-seq技术构建EST-SSR标记的方法与应用。本发明构建得到的EST-SSR标记的方法，共鉴定得到1847个多态性紫茎泽兰的EST-SSR标记，是目前最大的紫茎泽兰的EST-SSR数据集。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利用RNA-seq技术构建EST-SSR标记的方法，包括如下步骤：
(1)利用RNA-seq技术，构建RNA-seq序列文库；
(2)将RNA-seq序列文库中获得的片段进行组装，得到转录本；
(3)利用Misa软件对原生地样本转录本进行SSR预测和鉴定，得到SSR位点；
(4)对步骤(3)得到的SSR位点设计引物，得到SSR引物对；
(5)利用blast软件将步骤(4)得到的SSR引物对分别与入侵地样本转录本和原生地样本转录本进行序列相似比对，得到电子模拟PCR扩增片段，筛选片段大小不一致的标记为EST-SSR标记；
步骤(2)所述的转录本包括原生地样本转录本和入侵地样本转录本。
作为优选，步骤(2)所述的组装利用Trinity软件进行。
作为优选，步骤(2)所述的组装时的参数设置为：rinity.pl-seqType fq-JM50G\-left sample1_1.clean.fastq\-right sample1_2.clean.fastq\-jaccard_clip-CPU 6-SS_lib_type FR。
作为优选，步骤(3)所述的原生地样本转录本为片段大小大于100bp的转录本。
作为优选，步骤(3)所述的得到SSR位点时的参数设置为：1个碱基的重复元件重复次数等于或者大于10次，2个碱基的重复元件重复次数6次及以上，3～6个碱基的重复元件重复次数在5次及以上；两个SSR位点间的距离不少于100bp。
作为优选，步骤(4)设计引物的软件为Primer3.0。
作为优选，步骤(5)所述的序列相似比对时的参数设置为：1e-5。
本发明还提供了一种所述的方法在构建紫茎泽兰EST-SSR标记中的应用。
作为优选，所述的紫茎泽兰EST-SSR标记应用于紫茎泽兰多态性分析中。
本发明提供了一种利用RNA-seq技术构建EST-SSR标记的方法与应用，本发明的方法具有以下优点：
(1)利用RNA-seq技术可以高通量获得大量的转录本信息，为未知的紫茎泽兰基因组提供了一种高效的序列资源和分子标记开发的手段，共鉴定得到1847个多态性紫茎泽兰的EST-SSR标记，是目前最大的紫茎泽兰的EST-SSR数据集；
(2)基于Blast序列比对，将开发的SSR引物对在原生地样本和入侵地样本转录本进行电子模拟PCR扩增，筛选其中的差异标记，获得了在入侵地和原生地间具有多态性的SSR标记。采用这个方法克服了SSR标记开发过程中，多态性标记比例低，验证工作量大，费时费力，而且成本高的问题，大大了提高了效率和开发多态性SSR标记的比例，也减轻了工作量，提供了效率，节约了成本；
(3)随机挑选了20对EST-SSR标记进行了实验验证，结果表明它们具有较高的多态性，证明了本方法的可行性和可操作性。
附图说明
图1为24份不同地区紫茎泽兰电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1RNA提取
以采自墨西哥城的M-2紫茎泽兰作为原生地样本，以采自云南腾冲YN-3的紫茎泽兰为入侵地样本。取各自幼嫩叶片采用天根生化科技(北京)有限公司提供的植物总RNA提取试剂盒分别提取其RNA，得到原生地样本RNA和入侵地样本RNA。
实施例2RNA-seq测序及数据分析
将上述提取得到的原生地样本RNA和入侵地样本RNA经质检合格后，利用RNA-seq技术进行测序，构建RNA-seq测序文库。RNA-seq测序文库的构建为由华大基因提供。
经过测序，原生地样本M-2得到了43,825,786条clean reads，入侵地样本YN-3获得了46,296,674条clean reads。再利用Trinity(trinityrnaseq_r2012-10-05)软件进行denovo组装拼接，分别组装得到各自的转绿本。所述组装参数设置为rinity.pl-seqTypefq-JM50G\-left sample1_1.clean.fastq\-right sample1_2.clean.fastq\-jaccard_clip-CPU6-SS_lib_type FR。
其中原生地样本M-2转录本中大于100bp的转录本有105662个，入侵地样本YN-3转录本中大于100bp的转录本有105596个。
实施例3原生地样本转录本SSR位点的鉴定及引物设计
利用Misa软件，将原生地样本M-2转录本中大于100bp的转录本作为序列资源，进行SSR位点的预测和鉴定。参数设置为1个碱基的重复元件重复次数等于或者大于10次；2个碱基的重复元件重复次数6次及以上；3～6个碱基的重复元件重复次数在5次及以上，两个SSR位点间的距离不少于100bp。
经过鉴定，在转录本中发现的SSR位点有11658个，总共发现13387个SSR位点，其中1个碱基重复的位点有6506个，3个碱基重复的有3963个，2个碱基重复的有2588个，4～6个碱基重复的SSR位点比较少，数目分别只有250，34和46个。
利用Primer3.0工具对这些SSR位点进行引物设计，其中2519个SSR位点可设计引物，开发成SSR标记，并得到2519对引物对。
实施例4紫茎泽兰多态性SSR位点的筛选
将上述获得的2519对引物，合并整理成fasta格式的一个文本文件，作为探查序列。以实施例2组装得到的入侵地样本YN-3大于100bp的转录本作为库文件，利用blast软件中的blastn算法将引物对序列与转录本序列进行相似性比对，参数设置为：1e-5。根据获得比对结果，将一个标记上、下游引物比对到的同一个转录本的正反位置上的挑选出来，并统计长度，得到电子模拟PCR扩增产物片段大小。比较每个引物对在入侵地样本转录本和原生地样本转录本中模拟扩增片段的大小，筛选其中片段大小不一致的标记，作为多态性EST-SSR标记，结果共鉴定得到了1847个多态性的紫茎泽兰的EST-SSR标记。
实施例5紫茎泽兰多态性SSR位点的验证
从实施例4得到的1847个多态性的紫茎泽兰的EST-SSR标记中随机选取20个，合成其引物序列。所述引物序列的合成是由上海生工合成的，将其合成的20对引物分别命名为EST_SSR1到EST_SSR20，20对引物见表1，引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.40。选取24份来自不同地区的紫茎泽兰材料，材料选择见表2，取其幼嫩叶片采用CTAB方法提取其基因组DNA；然后利用20对引物进行PCR扩增。
表1 20对引物
表2 24份紫茎泽兰的材料信息及其地理来源
PCR反应体系为：2×PCR Mix Buffer 10.0μl，SSR上游引物Forward primer(10μM)1.0μl，SSR下游引物Reverse primer(10μM)1.0μl，模板DNA(100ng)1.0μl，ddH2O补齐至20μL。
PCR反应程序采用Touch-Down程序：
(1)94℃，2min；
(2)[94℃，45s；60℃，45s(-1.0℃/cycle)；72℃，45s]10个循环；
(3)20×(94℃，45s；50℃，45s；72℃，45s)；
(4)72℃，5min。
所述的-1.0℃/cycle为每循环一次减少1度；所述的20×为20个循环。
最后扩增得到的产物4℃保存。
将PCR扩增得到的产物采用2％的琼脂糖电泳检测，PCR扩增产物上样量为8μL，分子量标准(即Mark)为由宝生物工程(大连)有限公司提供的DL2000，缓冲溶液为1×TAE，在120V恒压条件下电泳1h，染色，照相记录结果，结果见图1。
图1表明20对SSR标记在24份不同地区的紫茎泽兰材料中均表现出多态性。证明了本方法的可行性和可操作性。
由以上实施例可知，本发明提供了一种利用RNA-seq技术构建EST-SSR标记的方法与应用。本发明利用RNA-seq技术可以高通量获得大量的转录本信息，为未知的紫茎泽兰基因组提供了一种高效的序列资源和分子标记开发的手段，共鉴定得到1847个多态性紫茎泽兰的EST-SSR标记，是目前最大的紫茎泽兰的EST-SSR数据集。然后基于Blast序列比对，将开发的SSR引物对在原生地样本和入侵地样本转录本进行电子模拟PCR扩增，筛选其中的差异标记，获得了在入侵地和原生地间具有多态性的SSR标记。采用这个方法克服了SSR标记开发过程中，多态性标记比例低，验证工作量大，费时费力，而且成本高的问题，大大了提高了效率和开发多态性SSR标记的比例，也减轻了工作量，提供了效率，节约了成本。随机挑选了20对EST-SSR标记进行了实验验证，结果表明它们具有较高的多态性，证明了本方法的可行性和可操作性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 西北农林科技大学
陕西省农产品质量安全中心
<120> 一种利用RNA-seq技术构建EST-SSR标记的方法与应用
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tagccctttg aacctacgaa 20
<210> 2
<211> 20
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<211> 22
<212> DNA
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<211> 20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 38
cgaccaactt cctccagatt 20
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ctgtctgtct ccacccaa 18
<210> 40
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cttcaccgcc atctcat 17
Claims (9)
1.一种利用RNA-seq技术构建紫茎泽兰EST-SSR标记的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）利用RNA-seq技术，构建RNA-seq序列文库；
（2）将RNA-seq序列文库中获得的片段进行组装，得到转录本；
（3）利用Misa软件对原生地样本转录本进行SSR预测和鉴定，得到SSR位点；
（4）对步骤（3）得到的SSR位点设计引物，得到SSR引物对；
（5）利用blast软件将步骤（4）得到的SSR引物对分别与入侵地样本转录本和原生地样本转录本进行序列相似比对，得到电子模拟PCR扩增片段，筛选片段大小不一致的标记，为EST-SSR标记；扩增所述EST-SSR标记的引物序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.40所示；
步骤（2）所述的转录本包括原生地样本转录本和入侵地样本转录本；
所述原生地样本转录本为墨西哥城的M-2紫茎泽兰；
所述入侵地样本转录本为云南腾冲YN-3的紫茎泽兰。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的组装利用Trinity软件进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的组装时的参数设置为：rinity.pl-seqType fq-JM 50G\-left sample1_1.clean.fastq\-right sample1_2.clean.fastq\ -jaccard_clip-CPU 6-SS_lib_type FR。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述的原生地样本转录本为片段大小大于100bp的转录本。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述的得到SSR位点时的参数设置为：1个碱基的重复元件重复次数等于或者大于10次，2个碱基的重复元件重复次数6次及以上，3~6个碱基的重复元件重复次数在5次及以上；两个SSR位点间的距离不少于100bp。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（4）设计引物的软件为Primer3.0。
7.根据权利要求1~6任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（5）所述的序列相似比对时的参数设置为：1e-5。
8.权利要求1~7任意一项所述的方法在构建紫茎泽兰EST-SSR标记中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的紫茎泽兰EST-SSR标记应用于紫茎泽兰多态性分析中。
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