CN107267503A - 核酸和检测转基因水稻b1c893及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途 - Google Patents

核酸和检测转基因水稻b1c893及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了转基因水稻B1C893的旁侧序列核酸，其包括右旁侧序列核酸和/或左旁侧序列核酸；所述右旁侧序列核酸的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.1的片段；所述左旁侧序列核酸的序列为SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.9的片段。本发明还提供了与转基因水稻B1C893的旁侧序列核酸互补的核酸。本发明还提供了检测转基因水稻B1C893及其产品的方法、引物、探针、试剂盒、基因芯片和它们的用途。通过上述技术方案，本发明成功地实现了转基因水稻B1C893或者由B1C893通过各种育种方法产生的含有该核酸片段的水稻衍生系及其产品的检测。

Description

核酸和检测转基因水稻B1C893及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及核酸、检测转基因水稻及其产品的方法、引物对、探针、试剂盒、基因芯片和它们的用途。
背景技术
国际农业生物技术应用服务组织(International Service for the Acquisitionof Agri-biotech Applications,ISAAA)统计报告显示，2014年，全球转基因作物种植面积达到1.815亿公顷，比2013年的1.752亿公顷增长了3.6％；转基因作物在1995年至2014年间产生了多种重大效益:采用转基因技术使化学农药的使用率降低了37％，作物产量提高了22％，农民利润增加了68％(中国生物工程杂志，2015，35(1):1-14)。水稻(Oryza sativa L.)作为世界上最重要的粮食作物之一，人们对其遗传转化和育种利用等方面进行了深入细致的研究。自第1批转基因水稻植株1988年问世以来，含有各种优良性状，如抗虫、抗除草剂、抗菌、抗病毒或营养改良，的转基因水稻相继研发成功。但各国对转基因水稻的商业化生产态度谨慎，仅有1999年美国批准了2个抗除草剂转基因水稻品种LL62和LL06的商业化种植(Environmentalassessment for petition 98-329-01p.Determination of nonregulated status for ricegenetically engineered for glufosinate herbicide tolerance,1999)，2004年伊朗开始规模化种植抗虫转基因水稻(Global status of commercialized biotech/GMcrops:2005.ISAAA Brief No 34,2005)，2007年美国批准转重组人乳铁蛋白、溶菌酶、血清白蛋白3种基因的水稻在控制条件下种植(Finding of nosignificant impact and decision notice.Issuance of permits to grow geneticallyengineer rice producing recombinant human lactoferrin,lysozyme or serumalbumin,2007)。我国在水稻转基因研究领域取得了一系列重大成果，很多转基因水稻品种已被获准进行环境释放和生产性试验，2009年转Bt基因抗螟虫水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”获得生产应用安全证书，标志着我国转基因水稻具备了商业化生产的基本条件；2014年底“华恢1号”和“Bt汕优63”的生产应用安全证书获得延期，有效期至2019年。为了平衡贸易利益、满足公众关切、控制潜在风险、加强工商监管，许多国家相继建立了转基因生物及其产品的安全评价和标识制度。我国现行对于农业转基因生物的管理依据的是国务院2001年5月23日颁布的《农业转基因生物安全管理条例》，以及农业部2002年1月5日发布的《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》3个配套规章。为了实现对转基因生物及其产品的标识管理，保障转基因产品的有效监管和转基因产业的健康发展，对转基因检测技术的准确度和灵敏度提出了严格要求。
转基因植物中外源基因在染色体上插入位置的旁侧序列是转基因植物品系最重要的分子特征之一，是区别不同转化事件的唯一性标识，是建立转基因植物品系特异性检测方法的重要技术资料。如：王恒波等(转基因大豆GTS40-3-2转化事件特异性PCR检测.基因组学与应用生物学,2010,(06):1177-83)建立了抗草甘膦转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性PCR检测方法。翟志芳等(转基因玉米LY038转化事件的特异性检测.农业生物技术学报,2011,(03):577-82)采用修饰接头连接PCR获得了转基因玉米LY038的外源基因与玉米基因组之间的5'端侧翼序列，据此建立了转基因玉米LY038转化事件特异性定性检测方法。就水稻而言，谢家建等建立了转Xa21基因抗病水稻抗优97的特异性检测方法(转Xa21基因水稻抗优97特异性检测方法的建立.中国植物病理学会2006年学术年会,中国湖南长沙)，中国水稻所的王渭霞等扩增出了转基因水稻科丰6号的旁侧序列，发明了基于这一旁侧序列的转化事件特异性检测方法并申请了专利(CN101824411A)。苏长青等测定了的转Cry1Ab/Cry1Ac融合基因水稻品系“Bt汕优63”的外源插入DNA全序列，建立了实时荧光定量PCR方法(转基因水稻Bt汕优63的整合结构和品系特异性定量PCR方法.农业生物技术学报,2011,19(3),434-441)。2013年，董立明等获得了转Bt-Pta-Bar基因玉米JL937的插入位点侧翼序列，并建立了特异性检测方法(转Bt-pta-bar基因玉米侧翼序列分析及特异性检测方法研究.玉米科学,2013,1(3):30-34)；蒋利平等获得了抗虫抗除草剂转基因水稻B2A68的侧翼序列，建立了特异性检测方法并申请了专利(转基因水稻B2A68事件特异性检测方法的建立.杂交水稻,2013,28(5):60-67.专利申请CN201310068126.8)。
利用密码子优化的Cry1Ca#基因和Bar基因共同转化水稻恢复系R893，可获得抗除草剂、抗虫的转基因水稻。既抗除草剂、又抗螟虫的转基因水稻不仅能减少农药的使用，并且能方便除草，在生产上具有广泛应用前景。本发明的发明人通过利用密码子优化的Cry1Ca#基因和Bar基因转化水稻，获得了一个转基因水稻新品系B1C893(抗虫抗除草剂转基因水稻B1C893的获得与鉴定.杂交水稻，2014，29(1):67-71.专利申请CN 201310305677.1)。由于外源基因的插入具有随机性，转基因水稻新品系B1C893的外源基因在基因组中插入位置并不清楚，因此难以实现对转基因水稻B1C893及其衍生品系的特异性检测。
发明内容
本发明的目的是实现对转基因水稻B1C893及其衍生品系的特异性检测。
转基因水稻新品系B1C893已经在文献中公开(抗虫抗除草剂转基因水稻B1C893的获得与鉴定.杂交水稻,2014，29(1):67-71)，可以通过向中国科学院亚热带农业生态研究所来函索取的方式获得。
水稻基因组大小一般认为有4.3亿bp。由于基因转化过程中外源基因的插入具有随机性，插入到水稻基因组某个固定位置的几率理论上有4.3亿分之一。但是，基因转化是一个不可以人为控制的复杂生物学过程，具有很大的技术难度，水稻转基因育种中获得的转化事件数量是有限的(一般不超过50个)，不可能重复出现一个极小概率的事件，外源基因实际上没有机会插入到水稻基因组的同一位置，每个独立的转化事件都具有唯一性，随之而来的外源基因序列与水稻基因组序列拼接而成的旁侧序列也具有唯一性。因此，旁侧序列的核酸是一种全新的核酸分子。本发明的发明人率先得到了转基因水稻B1C893外源基因旁侧序列的具体序列信息，由此建立的检测方法是检测转基因水稻品系B1C893及含有该核酸衍生系的水稻及其产品的特异性方法。
一方面，本发明提供了核酸，该核酸包括右旁侧序列核酸和/或左旁侧序列核酸；所述右旁侧序列核酸的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.1的片段，其中，所述SEQ ID NO.1的片段至少含有SEQ ID NO.1的第814-825位的序列；优选所述SEQ ID NO.1的片段至少含有SEQ ID NO.1的第799-840位的序列，更优选所述SEQ ID NO.1的片段至少含有SEQ ID NO.1的第789-850位序列，更进一步优选所述SEQ ID NO.1的片段至少含有SEQID NO.1的第779-860位的序列；所述左旁侧序列核酸的序列为SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.9的片段，所述SEQ ID NO.9的片段至少含有SEQ ID NO.9的第1877-1888位序列；优选所述SEQ ID NO.9的片段至少含有SEQ IDNO.9的第1862-1903位的序列，更优选所述SEQ ID NO.9的片段至少包括SEQ ID NO.9的第1852-1913位的序列，更进一步优选至少包括SEQ ID NO.9的第1842-1923位的序列。
另一方面，本发明还提供了一种核酸，其中，该核酸的序列与如上所述的核酸的序列互补。
另一方面，本发明还提供了一种引物，该引物为用作判断转基因水稻B1C893转化事件及含有该转基因事件产品的特异性引物，其中，该引物包括针对如上所述的核酸设计的特异性引物。
另一方面，本发明还提供了一种检测转基因水稻和转基因水稻产品的方法，该水稻样品为或来源为转基因水稻B1C893或者含有如上所述的核酸的转基因水稻B1C893的衍生系，其中，该方法包括：(1)使用如上所述的引物对取自待测水稻或水稻产品的核酸样品进行核酸扩增反应；(2)检验核酸扩增反应后的扩增子；其中，所述扩增子的序列与如上所述的核酸序列相同则指示所述待测水稻为或来源为所述转基因水稻B1C893或者为含有如上所述的核酸的衍生系；其中，所述扩增子只有1个且序列与上述序列相同时，指示该样品中外源基因是纯合态；所述扩增子有至少2个且其中1个的序列与上述序列相同、其中另1个的序列与NCBI登录号AP005406.3中所示序列或其互补序列或它们的片段序列相同时指示该样品中外源基因是杂合态。
另一方面，本发明还提供了一种探针，该探针为用作判断转基因水稻B1C893转化事件及含有该转基因事件产品的特异性核酸探针，其中，该探针包括针对如上所述的核酸设计的特异性核酸探针；优选地，所述特异性核酸探针包含SEQ ID NO.1的片段和/或SEQ ID NO.9的片段中至少11个连续核苷酸或其互补序列；更优选地，所述针对SEQ ID NO.1或其互补序列的、至少包含11个连续核苷酸的特异性核酸探针至少含有SEQ ID NO.1的第819-820位序列或其互补序列，所述针对SEQ ID NO.9或其互补序列的、至少包含11个连续核苷酸的特异性核酸探针至少含有SEQ ID NO.9的第1882-1883位序列或其互补序列。
另一方面，本发明还提供了一种检测转基因水稻和转基因水稻产品的方法，该水稻样品为或来源为转基因水稻B1C893或者含有如上所述的核酸的转基因水稻B1C893的衍生系，其中，该方法包括：(1)使用如上所述的探针对取自待测水稻或水稻产品的核酸样品进行严谨核酸杂交反应；(2)检验所述探针与所述样品的结合；其中，探针与所述样品的严谨结合指示所述待测水稻为或来源为所述转基因水稻B1C893或者为含有如上所述的核酸的衍生系。
另一方面，本发明还提供了试剂盒和/或基因芯片，该试剂盒和/或基因芯片包括如上所述的引物和/或如上所述的探针。
再一方面，本发明还提供了如上所述的引物或/和如上所述的探针或/和如上所述的试剂盒和或基因芯片在检测转基因水稻B1C893或者含有如上所述的核酸的转基因水稻B1C893的水稻衍生系及其产品中的用途。
通过上述技术方案，本发明成功地实现了转基因水稻B1C893或者由B1C893通过各种育种方法产生的含有该核酸片段的衍生系及其产品的检测。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
一方面，本发明提供了核酸，该核酸包括右旁侧序列核酸和/或左旁侧序列核酸；所述右旁侧序列核酸的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.1的片段，其中，所述SEQ ID NO.1的片段至少含有SEQ ID NO.1的第814-825位的序列；优选所述SEQ ID NO.1的片段至少含有SEQ ID NO.1的第799-840位的序列，更优选所述SEQ ID NO.1的片段至少含有SEQ ID NO.1的第789-850位序列，更进一步优选所述SEQ ID NO.1的片段至少含有SEQID NO.1的第779-860位的序列；所述左旁侧序列核酸的序列为SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.9的片段，所述SEQ ID NO.9的片段至少含有SEQ ID NO.9的第1877-1888位序列；优选所述SEQ ID NO.9的片段至少含有SEQ IDNO.9的第1862-1903位的序列，更优选所述SEQ ID NO.9的片段至少包括SEQ ID NO.9的第1852-1913位的序列，更进一步优选至少包括SEQ ID NO.9的第1842-1923位的序列。
另一方面，本发明还提供了一种核酸，其中，该核酸的序列与如上所述的核酸的序列互补。
另一方面，本发明还提供了一种引物，该引物为用作判断转基因水稻B1C893转化事件及含有该转基因事件产品的特异性引物，其中，该引物包括针对如上所述的核酸设计的特异性引物。
其中，优选地，所述特异性引物包括针对SEQ ID No.1的第1-819位的区域设计的右侧上游引物和针对SEQ ID No.1的第820-2952位的区域设计的右侧下游引物。
其中，更优选地，所述右侧上游引物如SEQ ID NO.12所示，所述右侧下游引物如SEQ ID NO.13所示。
其中，对于所述右侧特异性引物包括SEQ ID NO.12所示的右侧上游引物和SEQ ID NO.13所示的右侧下游引物的情况，优选地，PCR扩增的条件包括退火温度为51-57℃。
其中，优选地，所述特异性引物包括针对SEQ ID No.9的第1-1882位的区域设计的左侧上游引物和针对SEQ ID No.9的第1883-2590位的区域设计的左侧下游引物。
其中，更优选地，所述左侧上游引物如SEQ ID NO.14所示，所述左侧下游引物如SEQ ID NO.15所示。
其中，对于所述左侧特异性引物包括SEQ ID NO.14所示的左侧上游引物和SEQ ID NO.15所示的左侧下游引物的情况，优选地，PCR扩增的条件包括退火温度为54-62℃。
另一方面，本发明还提供了引物对，该引物对包括右侧特异性引物对和/或左侧特异性引物对；所述右侧特异性引物对包括SEQ ID NO.12所示的右侧上游引物和SEQ ID NO.13所示的右侧下游引物；所述左侧特异性引物对包括SEQ ID NO.14所示的左侧上游引物和SEQ ID NO.15所示的左侧下游引物。
另一方面，本发明还提供了一种检测转基因水稻和转基因水稻产品的方法，该水稻样品为或来源为转基因水稻B1C893或者含有如上所述的核酸的转基因水稻B1C893的衍生系，其中，该方法包括：(1)使用如上所述的引物对取自待测水稻或水稻产品的核酸样品进行核酸扩增反应；(2)检验核酸扩增反应后的扩增子；其中，所述扩增子的序列与如上所述的核酸序列相同则指示所述待测水稻为或来源为所述转基因水稻B1C893或者为含有如上所述的核酸的衍生系；其中，所述扩增子只有1个且序列与上述序列相同时，指示该样品中外源基因是纯合态；所述扩增子有至少2个且其中1个的序列与上述序列相同、其中另1个的序列与NCBI登录号AP005406.3中所示序列或其互补序列或它们的片段序列相同时指示该样品中外源基因是杂合态。
另一方面，本发明还提供了一种探针，该探针为用作判断转基因水稻B1C893转化事件及含有该转基因事件产品的特异性核酸探针，其中，该探针包括针对如上所述的核酸设计的特异性核酸探针；优选地，所述特异性核酸探针包含SEQ ID NO.1的片段和/或SEQ ID NO.9的片段中至少11个连续核苷酸或其互补序列；更优选地，所述针对SEQ ID NO.1或其互补序列的、至少包含11个连续核苷酸的特异性核酸探针至少含有SEQ ID NO.1的第819-820位序列或其互补序列，所述针对SEQ ID NO.9或其互补序列的、至少包含11个连续核苷酸的特异性核酸探针至少含有SEQ ID NO.9的第1882-1883位序列或其互补序列。
另一方面，本发明还提供了一种检测转基因水稻和转基因水稻产品的方法，该水稻样品为或来源为转基因水稻B1C893或者含有如上所述的核酸的转基因水稻B1C893的衍生系，其中，该方法包括：(1)使用如上所述的探针对取自待测水稻或水稻产品的核酸样品进行严谨核酸杂交反应；(2)检验所述探针与所述样品的结合；其中，探针与所述样品的严谨结合指示所述待测水稻为或来源为所述转基因水稻B1C893或者为含有如上所述的核酸的衍生系。
另一方面，本发明还提供了试剂盒和/或基因芯片，该试剂盒和/或基因芯片包括如上所述的引物和/或如上所述的探针。
其中，所述试剂盒还可以包括阳性对照核酸，所述阳性对照核酸为如上所述的右旁侧序列核酸和/或左旁侧序列核酸或与它们序列互补的核酸。其中，所述试剂盒还可以包括dNTPs、PCR缓冲液和耐高温DNA聚合酶。
再一方面，本发明还提供了如上所述的引物或/和如上所述的探针或/和如上所述的试剂盒和/或基因芯片在检测转基因水稻B1C893或者含有如上所述的核酸的转基因水稻B1C893的水稻衍生系及其产品中的用途。
转基因水稻B1C893所用载体中包括Cry1Ca#基因表达框序列和Bar基因表达框序列。本发明采用常规方法提取植物基因组DNA。利用hiTail-PCR和LD-PCR的方法，扩增、分离并延伸得到外源基因插入位点的右旁侧序列，如SEQ ID NO.1所示，长度2952bp。利用LD-PCR方法扩增得到的外源基因插入位点的左旁侧序列，如SEQ ID NO.9所示，长度2590bp。
通过分析SEQ ID NO.1发现，其中第1至第819位序列与所用载体右边界上游序列完全一致，说明是外源基因序列，第820至第2952位序列与已发表的水稻基因组第8号染色体上序列(NCBI登录号：AP005406.3)的第17502至第19633位反向互补，说明是受体水稻R893自身的基因组序列。通过分析SEQ ID NO.9发现，其第1至第1882位序列与水稻第8号染色体上的发表序列(NCBI登录号为AP005406.3)反向互补，说明该段序列来源于受体R893的基因组序列，第1883至第2590位与载体左边界及终止子、Bar基因序列及35S启动子部分序列完全相同，说明该段序列来自外源基因。
根据T-DNA右旁侧序列(SEQ ID NO.1)设计特异性引物对，其中一条引物根据SEQ ID NO.1中第1至第819位序列设计，即是按照T-DNA右边界上游区域序列设计，另一条引物根据第820至第2952位序列设计，即按照插入位点处的水稻基因组序列设计。即该引物对能特异性的扩增出具有部分外源基因序列和水稻基因组第8号染色体上的AP005406.3序列的部分序列。优选的，本发明采用的正向引物为RB-F，序列如SEQ ID NO.12所示(5'-TGAGCTTGGATCAGATTGTCG-3')，反向引物为RB-R，序列如SEQID NO.13所示(5'-TTCCTCTACCTGTAGGCTG-3')，利用该引物对进行特异性PCR检测，只有转基因水稻B1C893或者具有SEQ ID NO.1序列的衍生品系能获得长度为376bp的特异条带。引物对RB-F/RB-R对样品中转基因水稻B1C893的成分的检测限度达到0.1％。
根据T-DNA左旁侧序列(SEQ ID NO.9)设计特异性引物对，其中一条引物根据SEQ ID NO.9中第1至第1882位序列设计，即参照插入位点处的水稻基因组序列设计，另一条引物根据第1883至第2590位序列设计，即按照T-DNA左边界上游序列设计。优选的，本发明采用的正向引物为LB2-F，序列如SEQ ID NO.14所示(5'-TTTCTTTCAGTTTCACCACCCA-3')，反向引物为LB2-R，序列如SEQ ID NO.15所示(5'-GCCCGTCACCGAGATTTG-3')，利用该引物对进行特异性PCR检测，只有转基因水稻B1C893或者具有SEQ ID NO.9序列的衍生品系能获得长度为536bp的特异条带。引物对LB2-F/LB2-R对样品中转基因水稻B1C893的成分的检测限度达到0.1％。
本发明首次获得了转基因水稻品系B1C893的插入外源基因的左、右旁侧序列，并且利用这两个旁侧序列建立了灵敏度高、特异性强的转基因水稻B1C893的品系特异性定性PCR检测方法和核酸探针杂交检测方法。本发明所建立的转基因水稻B1C893特异性检测方法可以进一步应用于特异性检测试剂盒和基因芯片的开发，以对转基因活体(植株、种子)、产品、提取物进行转基因成分的定性检测和纯/杂合体判别，通过标准含量样品的设置，还可实现定量检测和定量检测试剂盒和基因芯片的开发。
以下，通过实施例进一步详细说明本发明，下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂所建议的条件。
实施例1：本实施例说明获得右旁侧序列的过程。
首先，通过hiTail-PCR扩增得到转基因水稻B1C893的部分右旁侧序列，如SEQ ID NO.2所示，全长1059bp。hiTail-PCR所用特异性嵌套引物依据植物表达载体pC3300-Cry1Ca的T-DNA序列右边界(RB)上游lacZ基因序列设计。植物表达载体pC3300-Cry1Ca的资料参考专利(专利文献CN201310305677.1)。hiTail-PCR方法参考文献(High-efficiency thermalasymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.2007,BioTechniques,43(5):649-456)，其中：所述引物包括长随机引物LAD1～LAD4，通用引物AC1，特异性嵌套引物Rb-0b、Rb-1b和Rb-2b(引物序列见表1)。hiTail-PCR扩增获得1059bp长的片段。
通过BLAST分析发现，SEQ ID NO.2中第1至第122位核苷酸序列与所用载体右边界序列完全一致，第123至第1059位序列与水稻基因组第8号染色体上序列(AP005406.3)的第18694至第19633位反向互补。
其次，根据获得的水稻基因组序列信息(NCBI登录号AP005406.3)设计引物对RBG-F/RBG-R，序列分别如SEQ ID NO.3(5'-TGACCTGCTAATTATCTCTC-3')和SEQ ID NO.4所示(5'-GCCAGCAATGCACCTGATGAA-3')，利用引物对RBG-F/RBG-R扩增得到1259bp的右旁侧受体基因组延伸序列，如SEQ ID NO.5所示，该序列与NCBI数据库所公布的水稻基因组序列(NCBI登录号AP005406.3)反向互补。
根据载体pC3300-Cry1Ca右边界上游序列信息设计引物对RBV-F/RBV-R，序列分别如SEQ ID NO.6(5'-TTCGCTGGTTGGTGTCCGTTAG-3')和SEQ ID NO.7(5'-GATCCAAGCTCAAGCTGCTCTAGC-3')所示；利用引物对RBV-F/RBV-R扩增得到764bp的右旁侧的载体延伸序列，如SEQ ID NO.8所示，该序列与载体pC3300-Cry1Ca右边界上游的部分序列完全一致。
分析SEQ ID No.2、SEQ ID No.5和SEQ ID No.8序列，发现SEQ ID No.2分别与其它两者有63bp和67bp的序列重复，将3次扩增获得的序列SEQID No.2、SEQ ID No.5和SEQ ID No.8拼接得到右旁侧序列SEQ ID No.1，该序列全长2952bp，包含第1至第819位的外源基因序列(载体序列)与第820至第2952位的水稻基因组序列。
本实施例的详细操作如下：
CTAB法(王关林等，植物基因工程，北京：科学出版社，2009)提取DNA。取2.0μL DNA用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用微量紫外分光光度计测定DNA浓度。
参照Liu等(Liu et al.,2007,BioTechniques,43(5):649-456)的方法进行hiTail-PCR分离T-DNA右旁侧序列。hiTail-PCR第1级反应使用4条长随机引物(LAD1～LAD4)与特异性嵌套引物Rb-0b组合，以转基因水稻B1C893基因组DNA为模板进行PCR扩增，非转基因水稻R893作为对照。第1级PCR扩增反应产物稀释40倍用作第2级Tail-PCR反应的模板，第2级反应的引物组合为AC1/RB-1b。将第2级反应产物稀释10倍用作第3级反应的模板，引物组合为AC1/RB-2b。第二级和第三级反应的扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离。所用引物序列见表1，扩增程序见表2。
表1：hiTail-PCR所用引物
表2：hiTail-PCR扩增程序
利用hiTAIL-PCR扩增所获得的序列(SEQ ID No.2)设计引物RBG-F，参考水稻基因组序列(NCBI登录号AP005406.3)设计引物RBG-R，引物序列如下表。根据载体pC3300-Cry1Ca右边界上游序列信息设计引物对RBV-F/RBV-R，引物序列如下表。利用引物对RBG-F/RBG-R和引物对RBV-F/RBV-R分别PCR扩增转基因水稻B1C893，扩增体系为：20μL PCR反应体系中包括1×PCR Buffer，200μM dNTPs，1μM正向引物和1μM反向引物，0.5U Taq DNA聚合酶和20ng DNA模板。PCR扩增程序为：95℃5min；34个循环(94℃45s，退火30s，72℃1min)；72℃10min。
表3：用于右边界序列延伸的引物
用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，切下相应的特异性条带，用大连宝生物凝胶回收试剂盒回收特异片段，并克隆到pMD19-T simplevector，挑选阳性克隆送深圳华大基因公司测序。序列比较分析运用NCBI的BLAST软件进行。
根据T-DNA右边界的载体序列设计的3个嵌套的特异性引物(RB-0b、RB-1b和RB-2b)跟随机引物LAD4组合时，在转基因水稻B1C893中扩增出特异性条带。对随机引物LAD4扩增出的第三级PCR产物进行回收、克隆和测序得到1059bp的右边界融合序列，序列如SEQ ID No.2所示。该序列的特征为：第1至第122位与载体序列完全匹配，第123至第1059位为水稻基因组第8号染色体上的序列。利用RBG-F/RBG-R引物对扩增得到1259bp序列，序列如SEQ ID No.5所示，与水稻第8号染色体序列反向互补；利用引物对RBV-F/RBV-R扩增得到764bp的序列，如SEQ ID No.8所示，与载体pC3300-Cry1Ca右边界上游序列完全一致。分析SEQ ID No.2、SEQ ID No.5和SEQ ID No.8序列，发现SEQ ID No.2与两者之分别间有63bp和67bp的序列重复。将SEQ ID No.2、SEQ ID No.5和SEQ ID No.8的序列相拼接得到转基因水稻B1C893右旁侧序列，序列如SEQ ID No.1所示，该序列的特征为：第1至第819位为插入水稻中的外源基因序列(载体序列)，第820至第2952位为水稻基因组序列，与已公布的水稻第8号染色体上序列反向互补。
实施例2：本实施例说明获得左旁侧序列的过程。
根据测序所得的右旁侧序列以及已公布的水稻第8号染色体上的序列设计正向引物LB1-F，序列如SEQ ID NO.10所示(5'-GGCATGTTCGTTATCGACCTCTT-3')，根据载体pC3300-Cry1Ca序列设计反向引物LB1-R，序列如SEQ ID NO.11所示(5'-GTCTGCACCATCGTCAACCACTA-3')，用该引物对扩增获得转基因水稻B1C893的左旁侧序列，如SEQ ID NO.9所示，长度为2590bp。通过分析SEQ ID NO.9发现，获得的序列第1至第1882位与水稻基因组第8号染色体序列(NCBI登录号AP005406.3)反向互补，第1883位至第2590位与载体pC3300-Cry1Ca的CaMV 35S终止子部分序列完全相同。外源基因插入水稻第8号染色体第25981位，外源基因的插入使水稻基因组缺失45个碱基(水稻第8号染色体第25982-26026位(该序列的NCBI登录号为AP014964.1)或NCBI登陆号为AP005406.3序列的19634-19678位)。根据外源基因插入位点的DNA序列分析发现，转基因水稻B1C893中外源基因插入位点上游第140bp处存在转录区域(OS08T0100300-01，http://ensembl.gramene.org/Oryza_sativa/Transcript/)，该转录区域不编码蛋白质，但是DNA能翻译成ncRNA(Non-coding RNA，非编码RNA)；ncRNA虽然不翻译成蛋白质，但对生物具有重要的调控功能；外源基因插入位点下游第248bp处存在蛋白编码区(OS08T0100400-01，http://ensembl.gramene.org/Oryza_sativa/Transcript/)，该编码区编码蛋白为Os08g0100400，该蛋白功能为锌离子结合区(http://www.uniprot.org/uniprot/C7J5F7)。
本实施例的详细操作如下：
DNA提取采用与实施例1相同的方法进行。
长链PCR用于扩增水稻基因组中的长片段。本实例中用于扩增转基因水稻B1C893的外源插入载体的T-DNA左旁侧序列。引物序列见表4。LD-PCR扩增体系为：20μL PCR反应体系中包括1×PCR Buffer，200μMdNTPs，1μM正向引物LB1-F和1μM反向引物LB1-R，0.5U Taq DNA聚合酶和20ng DNA模板。LD-PCR扩增程序为：95℃5min；94℃变性45s，56℃30s，72℃2min，34个循环；72℃10min。
表4：用于LD-PCR的引物
采用与实施例1相同的方法进行PCR产物的克隆和测序。
利用引物对LB1-F/LB1-R进行LD-PCR扩增，获得序列如SEQ ID NO.9所示，长度2590bp。其中：第1至第1882位为水稻基因组序列，第1883位至第2590位为外源基因序列(载体序列)。
实施例3：本实施例说明基于右旁侧序列和左旁侧序列的B1C893转化事件特异性检测方法。
转基因水稻品系B1C893的外源插入片段的右旁侧序列的定性PCR检测方法，其中，所述PCR反应中的两条引物组合为T-DNA右边界的旁侧序列的特异性引物对：一条引物依据SEQ ID NO.1中第1至第819位序列设计，另一条引物依据SEQ ID NO.1中第820至第2952位序列设计。
具体地，所述特异性引物对如下：
正向引物RB-F，依据SEQ ID NO.1中第1至第819位序列设计，序列如SEQ ID NO.12所示(5'-TGAGCTTGGATCAGATTGTCG-3')；
反向引物RB-R，依据SEQ ID NO.1中第819至第2952位序列设计，序列如SEQ ID NO.13所示(5'-TTCCTCTACCTGTAGGCTG-3')；
利用上述引物对进行PCR扩增，转基因水稻品系B1C893能获得长度为376bp的目的片段，其序列与SEQ ID NO.1的片段序列相同，非转基因水稻及非该转化事件的转基因水稻不能获得大小、序列与目的片段相同的目的片段。
转基因水稻品系B1C893的外源插入片段的左旁侧序列的定性PCR检测方法，其中：所述PCR反应中的两条引物组合为外源基因插入位点处左旁侧序列的特异性引物对：一条引物依据SEQ ID NO.9中第1至第1882位序列设计，即左旁侧序列中的水稻基因组序列；另一条引物依据SEQ ID NO.9中第1883至第2590位序列设计，即左旁侧序列中的外源基因序列。
具体地，所述特异性引物对如下：
正向引物LB2-F，依据SEQ ID NO.9中第1至第1882位序列设计，序列如SEQ ID NO.14所示(5'-TTTCTTTCAGTTTCACCACCCA-3')；
反向引物LB2-R，依据SEQ ID NO.9第1883至第2590位序列设计，序列如SEQ ID NO.15所示(5'-GCCCGTCACCGAGATTTG-3')；
利用上述引物对进行扩增，转基因水稻品系B1C893能获得长度为536bp的目的片段，其序列与SEQ ID NO.9的片段序列相同，非转基因水稻及非该转化事件的转基因水稻不能获得大小、序列与目的片段相同的目的片段。
本实施例的详细操作如下：
DNA提取采用与实施例1相同的方法进行。
根据实施例1和2中获得的转基因水稻的右旁侧序列和左旁侧序列，分别依据其水稻基因组序列部分和外源基因序列(载体序列)部分设计特异性引物对，引物序列见表5。PCR反应体系为：20μL PCR反应体系中包括1×PCR Buffer，200μM dNTPs，1μM特异引物对，0.5U Taq DNA聚合酶和20ng DNA模板。扩增程序为：95℃5min；94℃30s，退火30s，72℃1min，34个循环；72℃10min。利用1.0％的琼脂糖凝胶电泳进行产物分析。
表5：转基因水稻品系B1C893的T-DNA左右边界侧的事件特异性检测引物对
采用与实施例1相同的方法进行PCR产物的克隆和测序。
利用引物对RB-F/RB-R进行PCR扩增，仅在转基因水稻B1C893中得到376bp的目的片段，而在其他转基因水稻品系和对照品种中均未得到扩增产物；引物对RB-F/RB-R适宜的退火温度范围为51-57℃。
利用引物对LB2-F/LB2-R进行PCR扩增，仅在转基因水稻B1C893中得到长度为536bp的特异条带，而在其他转基因水稻品系和对照品种中均未得到扩增产物；引物对LB2-F/LB2-R适宜的退火温度范围为54-62℃。
其中，转基因水稻品种B1C893作为检测样品(杂交水稻,2014,29(1):67-71)，转基因对照材料为BRd88、B2A68、EB7001S、B88S(杂交水稻,2013,28(1):63-67)，非转基因对照为R893(杂交水稻,2010,25(5):15-16)、7001S(安擞农业科学,1994,22(1):11-15)、吉梗88(吉林农业科学,2006,31(5):22-23)、D68(杂交水稻,1998,13(3):6-7)。上述水稻均已经在各自的文献中公开，可以通过向中国科学院亚热带农业生态研究所来函索取的方式获得，中国科学院亚热带农业生态研究所保证从本发明的申请日起二十年内向公众发放上述水稻。
实施例4：本实施例用于说明基于左/右旁侧序列的B1C893事件特异性检测方法的检出限或灵敏度。
取待测样品提取和测定DNA含量，按照一定的梯度或比例稀释DNA样品；依据实施例3的方法对待测样品进行PCR扩增；设置定量分子量标记对固定体积的PCR扩增反应液进行电泳，使用如Image Lab 3.0的软件对电泳图谱进行定量分析，依据不同泳道内目标条带的相对亮度计算DNA含量，计算检出限。
本实施的详细操作如下：
采用与实施例1相同的方法进行DNA提取。
将转基因水稻B1C893基因组DNA与非转基因水稻R893基因组DNA均稀释至100ng/μL，并按照不同的比例混合配成转基因水稻DNA相对含量为100％、20％、5％、1％、0.5％、0.1％(v/v)的样品。
根据实施例3的方法，基于左、右旁侧序列的定性PCR灵敏度检测，按优化后的退火温度对样品进行PCR扩增，分别测定特异性检测引物对RB-F/RB-R和LB2-F/LB2-R的检测限度。
利用引物对RB-F/RB-R和LB2-F/LB2-R进行PCR扩增，当转基因DNA成分为0.1％时特异性引物对仍能分别检测出376bp或536bp的特异性条带，说明在常规PCR条件下转基因品系B1C893特异性检测引物最低检测限度至少可达0.1％，完全能够满足欧盟要求转基因产品含量达到0.9％就要求标识的检测灵敏度要求。
实施例5：本实施例说明基于左、右旁侧序列的多重PCR检测方法。
依据SEQ ID NO.1中第1至第819位序列设计1个特异性引物，依据SEQ ID NO.1中第820至第2952位序列设计1个特异性引物，获得右旁侧序列的1个特异性引物对；依据SEQ ID NO.9中第1至第1882位序列设计1个特异性引物，依据SEQ ID NO.9中第1883至第2590位序列设计1个特异性引物，获得左旁侧序列的1个特异性引物对；以这2个特异性引物对同时扩增转基因水稻基因组DNA，同时获得左、右边界的2条目标特异带。
具体地，以特异性引物LB2-F、LB2-R、RB-F和RB-R对待测样品DNA进行PCR扩增，转基因水稻B1C893扩增获得536bp和376bp的2条目的片段，其它所有水稻不能获得条带或者不能获得上述相同大小的目标条带。
实施例6
本实施例用于说明基于左、右旁侧序列的3引物PCR法检测B1C893或含有该转化事件的水稻及其产品中外源基因的杂合性和纯合性的方法。
依据右旁侧序列SEQ ID NO.1中第1至第819位序列设计1个特异性引物，依据右旁侧序列SEQ ID NO.1中第820至第2952位序列设计1个特异性引物，依据左旁侧序列SEQ ID NO.9中第1至第1882位序列设计1个特异性引物。针对待测核酸样品，用上述3类引物进行PCR反应，其中，纯合体得到序列为右旁侧序列或右旁侧序列的片段的单个扩增子，杂合体得到1个序列为右旁侧序列或右旁侧序列的片段的扩增子和1个来源于不含该转化事件的核酸模板产生的扩增子(序列如NCBI登录号AP005406.3中所示序列或其互补序列的片段)，不含该转化事件的核酸样品得到1个来源于不含该转化事件的模板产生的扩增子(序列如NCBI登录号AP005406.3中所示序列或其互补序列的片段)。
依据右旁侧序列SEQ ID NO.1中第1至第819位序列设计的引物为SEQID NO.12所示序列的核酸，依据右旁侧序列SEQ ID NO.1中第820至第2952位序列设计的引物为SEQ ID NO.13所示序列的核酸，依据左旁侧序列SEQ ID NO.9中第1至第1882位序列设计的引物为SEQ ID NO.14所示序列的核酸。针对待测核酸样品，用上述3条引物进行PCR反应，其中，纯合体得到序列为右旁侧序列的片段的单个扩增子，长度376bp；杂合体得到1个序列为右旁侧序列的片段、长度为376bp的扩增子和另外1个来源于序列如NCBI登录号AP005406.3中所示序列的互补序列的片段，长度为636bp；不含该转化事件的核酸样品得到1个序列如NCBI登录号AP005406.3中所示序列的互补序列的片段，长度为636bp。
依据上述原理，可以针对左旁侧序列设计引物进行三引物法检测，还可以针对左或右旁侧序列的互补序列设计引物进行三引物法检测，以判别纯合态、杂合态和非该转化事件的样品。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.核酸，该核酸包括右旁侧序列核酸和/或左旁侧序列核酸；其特征在于，
所述右旁侧序列核酸的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.1的片段，其中，所述SEQ ID NO.1的片段至少含有SEQ ID NO.1的第814-825位的序列；优选所述SEQ ID NO.1的片段至少含有SEQ ID NO.1的第799-840位的序列，更优选所述SEQ ID NO.1的片段至少含有SEQ ID NO.1的第789-850位序列，更进一步优选所述SEQ ID NO.1的片段至少含有SEQ IDNO.1的第779-860位的序列；
所述左旁侧序列核酸的序列为SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.9的片段，其中，所述SEQ ID NO.9的片段至少含有SEQ ID NO.9的第1877-1888位序列；优选所述SEQ ID NO.9的片段至少含有SEQ ID NO.9的第1862-1903位的序列，更优选所述SEQ ID NO.9的片段至少包括SEQ ID NO.9的第1852-1913位的序列，更进一步优选至少包括SEQ ID NO.9的第1842-1923位的序列。
2.核酸，其特征在于，该核酸的序列与权利要求1所述的核酸的序列互补。
3.引物，该引物为用作判断转基因水稻B1C893转化事件及含有该转基因事件产品的特异性引物，其特征在于，该引物包括针对权利要求1或2所述的核酸设计的特异性引物。
4.根据权利要求3所述的引物，其中，所述引物包括针对SEQ ID No.1的第1-819位的区域设计的右侧上游引物和针对SEQ ID No.1的第820-2952位的区域设计的右侧下游引物；
优选地，所述右侧上游引物如SEQ ID NO.12所示，所述右侧下游引物如SEQ ID NO.13所示。
5.根据权利要求3所述的引物，其中，所述特异性核酸引物包括针对SEQ ID No.9的第1-1882位的区域设计的左侧上游引物和针对SEQ ID No.9的第1883-2590位的区域设计的左侧下游引物；
优选地，所述左侧上游引物如SEQ ID NO.14所示，所述左侧下游引物如SEQ ID NO.15所示。
6.检测转基因水稻和转基因水稻产品的方法，该水稻样品为或来源为转基因水稻B1C893或者含有权利要求1或2所述的核酸的转基因水稻B1C893的衍生系，其特征在于，该方法包括：
(1)使用权利要求3-5中任意一项所述的引物对取自待测水稻或水稻产品的核酸样品进行核酸扩增反应；
(2)检验核酸扩增反应后的扩增子；
其中，所述扩增子的序列与权利要求1或2所述的核酸序列相同则指示所述待测水稻为或来源为所述转基因水稻B1C893或者为含有权利要求1或2所述的核酸的衍生系；
其中，所述扩增子只有1个且序列与权利要求1或2所述的核酸或其片段序列相同时，指示该样品中外源基因是纯合态；所述扩增子有至少2个且其中1个的序列与权利要求1或2所述的核酸或其片段序列相同、其中另1个的序列与NCBI登录号AP005406.3中所示序列或其互补序列或它们的片段序列相同时指示该样品中外源基因是杂合态。
7.探针，该探针为用作判断转基因水稻B1C893转化事件及含有该转基因事件产品的特异性核酸探针，其特征在于，该探针包括针对权利要求1或2所述的核酸设计的特异性核酸探针；优选地，所述特异性核酸探针包含SEQ ID NO.1的片段和/或SEQ ID NO.9的片段中至少11个连续核苷酸或其互补序列；更优选地，所述针对SEQ ID NO.1或其互补序列的、至少包含11个连续核苷酸的特异性核酸探针至少含有SEQ ID NO.1的第819-820位序列或其互补序列，所述针对SEQ ID NO.9或其互补序列的、至少包含11个连续核苷酸的特异性核酸探针至少含有SEQ ID NO.9的第1882-1883位序列或其互补序列。
8.检测转基因水稻和转基因水稻产品的方法，该水稻样品为或来源为转基因水稻B1C893或者含有权利要求1或2所述的核酸的转基因水稻B1C893的衍生系，其特征在于，该方法包括：
(1)使用权利要求7所述的探针对取自待测水稻或水稻产品的核酸样品进行严谨核酸杂交反应；
(2)检验所述探针与所述样品的结合；
其中，探针与所述样品的严谨结合指示所述待测水稻为或来源为所述转基因水稻B1C893或者为含有权利要求1或2所述的核酸的衍生系。
9.试剂盒和/或基因芯片，其特征在于，该试剂盒和/或基因芯片包括权利要求3-5中任意一项所述的引物或/和权利要求7所述的探针。
10.权利要求3-5中任意一项所述的引物或/和权利要求7所述的探针或/和权利要求9所述的试剂盒和/或基因芯片在检测转基因水稻B1C893或者含有权利要求1或2所述的核酸的转基因水稻B1C893的水稻衍生系及其产品中的用途。
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