CN104846082B - 一种皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒，可以快速检测19种皮蠹，至少包括20次用量以上的引物J1837/N2110试剂和基因条形码序列盘；引物J1837序列：5'‑TATAGCATTCCCACGAATAAATA‑3'，引物N2110序列：5'‑ATTTCGGTCAGTTAATAATATAG‑3'；所述基因条形码序列盘存有61条标准条码序列，详细序列为SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.61所示。本发明的皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒，是一种高效、准确、便捷的皮蠹科昆虫分子检测技术，可在分子水平将皮蠹科19种昆虫种类区分，能满足使用需求。
Description
技术领域
本发明涉及皮蠹科昆虫检测技术领域，具体涉及一种皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒。
背景技术
皮蠹科昆虫广泛分布于世界各地，主要侵害储藏的动植物材料，其种群食性杂，繁殖力强，可以忍耐环境中极低的湿度完成生活世代，造成储藏商品的数量、质量及市场价值相当大的损失和破坏。目前皮蠹科的种类鉴定研究仍主要集中于形态识别，传统的昆虫形态鉴定方法存在一定的局限性，必须以完整成虫作为形态学研究对象，近缘种、早期(卵、幼虫和蛹)形态结构与残缺的虫体均难于鉴定。随着分子生物学研究的起步，越来越多的技术可以被用于皮蠹科昆虫的种类鉴定。随着科技水平的提高，近年来不少人开始利用分子生物学手段对昆虫进行分子鉴定。分子生物学手段一般所需样品量较少，具有快速准确等优点，可以为仓储害虫的鉴定提供可靠的参考依据。昆虫的线粒体DNA(mtDNA)是一种闭合的双链环状遗传物质，稳定性高，大小一般为15.4～16.3kb，以高拷贝数目存在于线粒体内，进化速率较核更快，且为母系遗传，在遗传过程中不发生基因重组倒位易位等突变，这些特点使在昆虫近缘种的分类和种间鉴别等研究中有着十分重要的意义。此外，在昆虫新种甚至复合种的鉴定中也是非常重要的标记对象。马骏等(2009)根据斑皮蠹属序列设计引物，分别对黑斑皮蠹、谷斑皮蠹的总mtDNACOI基因进行扩增测序，并将二者的序列进行比对，发现二者序列的碱基差异明显，可以作为两种间的特异性标记序列，从而将黑斑皮蠹和谷斑皮蠹成功区分开。陈岩等(2010)针对不同种皮蠹害虫线粒体基因的位点多态性，设计了谷斑皮蠹的特异引物进行扩增，该引物可以将谷斑皮蠹的片段成功扩出，而和它外形相似的其他种皮蠹(黑斑皮蠹、花斑皮蠹、条斑皮蠹)则没有相应的扩增条带，从而将谷斑皮蠹与其区别开。刘聪等(2012)对黑斑皮蠹、花斑皮蠹部分mtDNACOI基因的部分序列进行比对，针对二者序列差异，选取限制性内切酶AflII对二者进行酶切，结果表明，黑斑皮蠹的序列可被限制酶切开，而花斑皮蠹因不具AflII酶酶切位点而不能被切开，从而将二者分开。Castalanelli等(2011)还将mtDNACOI序列与18SrDNA、Cytb基因结合研究了斑皮蠹近缘属的系统发生关系以及谷斑皮蠹、花斑皮蠹和未知斑皮蠹等6个种 的演化结构。
DNA条形码技术是利用一段或几段标准的、易扩增的、种间差异显著大于种内差异的DNA片段来鉴别物种的新技术，该概念最早由加拿大学者Hebert提出。与传统的分类鉴定技术相比，DNA条形码技术具有许多无可比拟的优点：(1)操作简单，对物种分类鉴定知识缺乏的人也可以通过标准技术流程对物种进行鉴定；(2)不受个体发育阶段和形态特征的限制，只要个体存在完整的目标DNA片段即可满足鉴定需求；(3)该技术可以作为传统分类学的辅助手段，帮助传统分类学家修正以往的分类结论，解决形态分类无法解决的难题。正是由于DNA条形码技术具有以上及其它很多优点，越来越多的研发人员加入了DNA条形码技术研究行列，使该领域成为生物学研究的热点之一(Hebert，2006)。但是关于皮蠹的基因条码快速检测技术研究，国内外相关的系统报道仍然不多。因此，建立准确可靠的皮蠹条形码检测技术，不仅对我国检疫部门具有重要的意义，更是对我国基因资源的补充，特别是皮蠹害虫资源的补充，为我国在争夺有限的资源方面能做出一定的贡献，同时也为皮蠹的分类鉴定提供新的方法。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明提出一种皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒，实现快速高效的检测皮蠹科昆虫。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒，可以快速检测19种皮蠹，至少包括基因条形码序列盘和20次用量以上的引物J1837/N2110试剂；引物J1837/N2110序列如下：
J1837序列：5'-TATAGCATTCCCACGAATAAATA-3'，
N2110序列：5'-ATTTCGGTCAGTTAATAATATAG-3'；
所述基因条形码序列盘存有61条标准条码序列，详细序列为SEQ ID NO.1到SEQID NO.61所示。
所述的皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒，还包括20次用量以上的下列试剂：Taqbuffer，MgCl2，dNTP mix，Taq DNA聚合酶，ddH2O，DNA标准样。
所述的19种皮蠹具体为：小圆皮蠹，标本圆皮蠹，地毯圆皮蠹，二星毛皮蠹，斯氏毛皮蠹，Attagenus woodroffei，黑毛皮蠹，短角褐毛皮蠹，鼠灰皮蠹，钩纹皮蠹，拟白腹皮蠹，火腿皮蠹，白腹皮蠹，秘鲁皮蠹，Dermestes szekessyi，赤毛皮 蠹，墨西哥斑皮蠹，谷斑皮蠹，黑斑皮蠹。
所述的皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒检测皮蠹科昆虫的方法，包括以下步骤：
1)DNA的制备：采用GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒提取待检测样品；
2)PCR反应体系与反应条件
PCR反应体系：总体积为50μL，其中含5μL 10×Taq buffer with KCl、2mmol/LMgCl2、200μmol/L dNTP mix、2U Taq DNA聚合酶、3μL DNA模板、引物各1μmol/L；
PCR反应程序：循环前94℃预变性2min；94℃变性1min、43℃退火温度1min，72℃延伸1.5min，进行30个循环；循环结束后72℃延伸5min，-20℃保存。混合8μL待测样品与2μL 6×Glycerol DNA loading Buffer上样，以DNA Marker DL100为分子量标记，室温下恒压120V，用3％琼脂糖凝胶电泳45min，0.5％μmol/L的EB染色，凝胶成像系统检测样品，拍照分析；
3)PCR结果判定
混合8μLPCR产物与2μL6×Glycerol DNA loading Buffer上样，以DNA MarkerDL100为分子量标记，室温下恒压120V，用3％琼脂糖凝胶电泳45min，0.5％μmol/L的EB染色，凝胶成像系统检测样品，拍照；照片显示皮蠹与标准DNA样品在528bp位置有清晰的扩增条带，即为目标条带；
4)RCR产物测序获得基因序列；
5)皮蠹科昆虫基因比对
将待测皮蠹测序得到的序列与基因条形码序列盘中标准基因条码序列进行比对，结果按一下方式运行：
A：与标准基因条码序列相似度100％，则认定其为该种类；
B：没有与任何标准条码序列相似度达100％，则将待测皮蠹基因序列按“无脊椎动物密码子”翻译为氨基酸，与标准基因条码序列所对应的氨基酸序列使用“P-distance模型”计算遗传距离，与未知种类皮蠹基因序列遗传距离小于2％的标准基因条码种类，即为目标种类；如果遗传距离都大于2％，判定未知皮蠹种类不在此19种皮蠹范围内。
有益效果：与现有技术相比，本发明的皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒，一 种高效、准确、便捷的皮蠹科昆虫分子检测技术，可在分子水平将皮蠹科19种昆虫种类区分，并具有如下特点(1)操作简单，对物种分类鉴定知识缺乏的人也可以通过标准技术流程对皮蠹科物种进行鉴定；(2)不受个体发育阶段和形态特征的限制，只要个体存在完整的目标DNA片段即可满足鉴定需求；(3)目标基因足够短，仅为356bp，降低了实验对标本质量的需求，扩增效率高；(4)种间变异大而种内变异小以区分不同物种；包含足够的系统进化信息以定位物种在分类系统中的位置。能满足使用需求。
附图说明
图1是部分引物J1837/N2110PCR扩增结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒，可以快速检测19种皮蠹(如表1所示)，至少包括20次用量以上的引物J1837/N2110试剂和1个基因条形码序列盘；引物J1837/N2110序列如下：
J1837序列：5'-TATAGCATTCCCACGAATAAATA-3'，
N2110序列：5'-ATTTCGGTCAGTTAATAATATAG-3'。
基因条形码序列盘存有包括19种共计61条标准条码序列，详细序列见SEQ IDNO.1-61所示。
表1皮蠹种类名称
| 序号 | 中文名 | 拉丁名 |
| 1 | 小圆皮蠹 | Anthrenus verbasci |
| 2 | 标本圆皮蠹 | Anthrenus museorum |
| 3 | 地毯圆皮蠹 | Anthrenus scrophulariae |
| 4 | 二星毛皮蠹 | Attagenus pellio |
| 5 | 斯氏毛皮蠹 | Attagenus smirnovi |
| 6 | 毛皮蠹一种 | Attagenus woodroffei |
| 7 | 黑毛皮蠹 | Attagenus unicolor japonicus |
| 8 | 短角褐毛皮蠹 | Attagenus unicolor simulans |
| 9 | 鼠灰皮蠹 | Dermestes murins |
| 10 | 钩纹皮蠹 | Dermestes ater |
| 11 | 拟白腹皮蠹 | Dermestes frischii |
| 12 | 火腿皮蠹 | Dermestes lardarius |
| 13 | 白腹皮蠹 | Dermestes maculatus |
| 14 | 秘鲁皮蠹 | Dermestes peruvianus |
| 15 | 皮蠹一种 | Dermestes szekessyi |
| 16 | 赤毛皮蠹 | Dermestes tessellatocollis |
| 17 | 墨西哥斑皮蠹 | Trogoderma anthrenoides |
| 18 | 谷斑皮蠹 | Trogoderma granarium |
| 19 | 黑斑皮蠹 | Trogoderma glabrum |
优选的配套组分，还可以包括20次用量以上的下列试剂：Taq buffer，MgCl2，dNTPmix，Taq DNA聚合酶，ddH2O，DNA标准样。
实施例2
选取谷斑皮蠹、黑斑皮蠹、白腹皮蠹、小圆皮蠹、大谷蠹、四纹豆象、米象七份样品作为待检测样品。采用实施例1的试剂盒检测，步骤如下：
1)总DNA提取
DNA的提取采用GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒进行提取。具体过程如下：
直接剪取供试标本足和胸部30mg放入2mm试管，无水乙醇浸泡保存标本用无菌蒸馏水冲洗浸泡4～5次，弃水；干标本无菌蒸馏水浸泡3h后吸干水分。置于2mL离心管，MM400球磨仪中震荡碾磨(30次/s)30s，加入180μL Lysis Buffer、20μL Proteinase K，震荡混匀，常温过夜，55℃震荡温浴3-5h，12000rpm离心10min，取上清，加入200μL BindingBuffer和200μL无水乙醇，充分混匀，加入20μL磁珠，轻柔颠倒混匀10min。离心管置于磁力架，吸弃管内液体，保留磁珠，Wash Buffer I500uL颠倒混匀2min置于磁力架，弃去管内液体，Wash Buffer Ⅱ同样洗涤两次，离心管仍置于磁力架上，缓慢加入Wash Buffer Ⅲ，1min后移走管内液体。加入20μL Elution Buffer，55℃水浴10min洗脱磁珠上吸附的DNA，4℃储存备用。
2)序列扩增与测定
PCR反应体系：总体积为50μL，其中含5μL 10×Taq buffer with KCl、2mmol/LMgCl2、200μmol/L dNTP mix、2U Taq DNA聚合酶、3μL DNA模板、引物各1μmol/L；PCR反应程序：循环前94℃预变性2min；94℃变性1min、43℃退火温度1min，72℃延伸1.5min，进行30个循环；循环结束后72℃延伸5min，-20℃保存；混合8μL待测样品与2μL 6×Glycerol DNAloading Buffer上样，以DNA Marker DL100为分子量标记，室温下恒压120V，用3％琼脂糖凝胶电泳45min，0.5％μmol/L的EB染色，凝胶成像系统检测样品，拍照分析；电泳图，如图1所示，7个样品中、四种皮蠹、四纹豆象及阳性样品都扩增出356bp大小的条带，大谷蠹、米象未扩增出条带，排除的这两个种不在皮蠹科昆虫之内，符合实际，排除准确。扩增出条带的产物以PCR引物作为测序引物进行双向测序，由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
3)基因比对
利用现有的比对软件和计算机技术，未知种类皮蠹测序得到的序列结果与基因条形码序列盘中标准基因条码序列进行比较，结果按一下方式运行：
A：与标准基因条码序列相似度100％，则认定其为该种类；
B：没有与任何标准条码序列相似度达100％，则将未知种类皮蠹基因序列按“无脊椎动物密码子”翻译为氨基酸，与标准基因条码的氨基酸序列使用“P-distance模型”计算遗传距离，与未知种类皮蠹基因序列遗传距离小于2％的标准基因条码种类，即为目标种类；如果遗传距离都大于2％，说明未知皮蠹种类不在此19种皮蠹范围内。
所得5条序列依次输入基因条形码序列盘进行计算比对，结果如下：
1)谷斑皮蠹序列与序列盘中谷斑皮蠹标准条码基因相似度为100％，鉴定结果准确。
2)黑斑皮蠹序列与序列盘中黑斑皮蠹标准条码基因相似度为98％，与序列盘中黑斑皮蠹标准条码基因遗传距离0.6％，按结果认定规则认定为黑斑皮蠹，鉴定结果准确。
3)白腹皮蠹序列与序列盘中白腹皮蠹标准条码基因相似度为98％～100％，与序列盘中白腹皮蠹标准条码基因遗传距离0％～1.88％，按结果认定规则认定为白腹皮 蠹，鉴定结果准确。
4)小圆皮蠹序列与序列盘中小圆皮蠹标准条码基因相似度为100％，鉴定结果准确。
5)四纹豆象与序列盘中皮蠹标准条码基因遗传距离为43.7％～50.3％，远大于2％，按结果认定规则认定非19种皮蠹。
所有结果与供试的样本种类相符，结果符合要求，表明该试剂盒可以准确鉴定这4种皮蠹。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州市外来有害生物防控技术中心
<120> 一种皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒
<130> 100
<160> 63
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 356
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acaacaggaa taacaccaga acgtataccg ttatttgttt gatcagtagc aattactgcc 300
ctcctccttc ttttatcttt acctgttcta gcaggagcta ttactatact actaac 356
<210> 13
<211> 356
<212> DNA
<213> Anthrenus_verbasci（6）
<400> 13
gcattccctc gaataaacaa cataagattt tgacttcttc ctccttcatt atctctcctt 60
ctattaagaa gaatagtaga aagaggtgca ggaacaggtt gaactgtata tcctccactt 120
tcaagtaata ttgctcatgg aggagcatct gttgatttag ctatttttag tctccacttg 180
gcaggtattt cctcaatcct aggcgcagta aactttatta ccaccgccat taacatacga 240
acaacaggaa taacaccaga acgtataccg ttatttgttt gatcagtagc aattactgcc 300
ctcctccttc ttttatcttt acctgttcta gcaggagcta ttactatact actaac 356
<210> 14
<211> 356
<212> DNA
<213> Attagenus_pellio
<400> 14
gcattccctc gaataaacaa tataagattt tgattattac caccatcact ttcacttctt 60
ctaataagaa ggatagtgga aagaggagca ggaacgggat gaacagtcta tcccccatta 120
gctgctaata ttgctcatag aggggcttca gttgatctag caattttcag acttcattta 180
gcaggaatct catcaatttt aggagccgta aattttatta caactgctat taatatacgg 240
tccccaggaa taacagcaga ccaaatacct ctatttgttt gatcagttgc cattactgca 300
cttttattac ttctttcatt accagtatta gcaggagcaa ttacaatatt attaac 356
<210> 15
<211> 356
<212> DNA
<213> Attagenus_smirnovi
<400> 15
gcattcccac gaataaataa tataagattt tggttactac ccccctcctt aaccctgcta 60
ttaataagaa gaatggttga aagaggtgcg ggaacaggtt gaacagttta tccaccatta 120
gccgcaaata tcgctcatgg aggagcttca gtagacctag ccattttcag actacatcta 180
gcaggaatct catcaatttt aggagcagta aacttcatta ctacagctat taacataaaa 240
gccccaggaa taaaatgaga acaaatacca ctctttgttt gatctgtagt aattacagct 300
ttactgttac tattatcatt accagtactg gctggagcaa tcacaatact attaac 356
<210> 16
<211> 356
<212> DNA
<213> Attagenus_unicolor_simulans
<400> 16
gcattcccac gaataaataa tataagattc tgacttttac ccccttcttt atcacttctc 60
ttaataagaa gtatggtaga aagaggagct ggaacaggat gaacagtata tccacctcta 120
gcagctaatg tagctcatag aggagcctca gtagatttag caattttcag attacacttg 180
gctggaattt cctcaatcct tggagctgta aattttatta caacagctat taatatacga 240
tcaccaggaa taactgcaga acgaatacct ctatttgtat gatctgtagc aattactgca 300
cttttacttc tcctatccct tccagttcta gcgggagcaa tcactatatt attaac 356
<210> 17
<211> 356
<212> DNA
<213> Attagenus_unicolor_simulans（2）
<400> 17
gcattcccac gaataaataa tataagattc tgacttttac ccccttcttt atcacttctc 60
ttaataagaa gtatggtaga aagaggagct ggaacaggat gaacagtata tccacctcta 120
gcagctaatg tagctcatag aggagcctca gtagatttag caattttcag attacacttg 180
gctggaattt cctcaatcct tggagctgta aattttatta caacagctat taatatacga 240
tcaccaggaa taactgcaga acgaatacct ctatttgtat gatctgtagc aattactgca 300
cttttacttc tcctatccct tccagttcta gcgggagcaa tcactatatt attaac 356
<210> 18
<211> 356
<212> DNA
<213> Attagenus_woodroffei
<400> 18
gcgtttcctc gaataaataa tataaggttt tgacttttac ctccatcatt aagactcctt 60
ttaataagaa gaatagtaga aagtggggca ggaacaggat gaactgttta tcctccttta 120
gcgtctaaca ttgctcatgg tggtgcttca attgatttag ccatttttag gttacatctt 180
gcaggtattt catcaattct tggagcagta aattttattt ctacagctat taatatacga 240
tccccgggaa tatcaccaga aaaaataccc ctatttgtat gatcagtagc aattacagca 300
ttattacttc tcttatcact tccagttctt gctggtgcaa ttactatatt attaac 356
<210> 19
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_ater
<400> 19
gcattcccac gaataaataa tataagattc tgactacttc caccttcatt atctcttctt 60
ttaataagaa gaatagttga aagaggggca ggaactggat gaacagttta cccaccatta 120
tcagcaaata ttgctcatgg tggagcttct gttgatcttg ctattttcag attacatcta 180
gcaggtattt cctcaattct aggagctgtt aattttatta ctacagtaat taatatacga 240
tcaaagggaa taactcctga ccgaatacca ttatttgttt gatcagtagc aattactgcg 300
cttcttttac ttctctcact tcctgttctt gcaggagcta ttactatatt attaac 356
<210> 20
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_ater（2）
<400> 20
gcattcccac gaataaataa tataagattc tgactacttc caccttcatt atctcttctt 60
ttaataagaa gaatagttga aagaggggca ggaactggat gaacagttta cccaccatta 120
tcagcaaata ttgctcatgg tggagcttct gttgatcttg ctattttcag attacatcta 180
gcaggtattt cctcaattct aggagctgtt aattttatta ctacagtaat taatatacga 240
tcaaagggaa taactcctga ccgaatacca ttatttgttt gatcagtagc aattactgcg 300
cttcttttac ttctctcact tcctgttctt gcaggagcta ttactatatt attaac 356
<210> 21
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_ater（3）
<400> 21
gcattcccac gaataaataa tataagattc tgactacttc caccttcatt atctcttctt 60
ttaataagaa gaatagttga aagaggggca ggaactggat gaacagttta cccaccatta 120
tcagcaaata ttgctcatgg tggagcttct gttgatcttg ctattttcag attacatcta 180
gcaggtattt cctcaattct aggagctgtt aattttatta ctacagtaat taatatacga 240
tcaaagggaa taactcctga ccgaatacca ttatttgttt gatcagtagc aattactgcg 300
cttcttttac ttctctcact tcctgttctt gcaggagcta ttactatatt attaac 356
<210> 22
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_ater（4）
<400> 22
gcattcccac gaataaataa tataagattc tgactacttc caccttcatt atctcttctt 60
ttaataagaa gaatagttga aagaggggca ggaactggat gaacagttta cccaccatta 120
tcagcaaata ttgctcatgg tggagcttct gttgatcttg ctattttcag attacatcta 180
gcaggtattt cctcaattct aggagctgtt aattttatta ctacagtaat taatatacga 240
tcaaagggaa taactcctga ccgaatacca ttatttgttt gatcagtagc aattactgcg 300
cttcttttac ttctctcact tcctgttctt gcaggagcta ttactatact tctaac 356
<210> 23
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_ater（5）
<400> 23
gcattcccac gaataaataa tataagattc tgactacttc caccttcatt atctcttctt 60
ttaataagaa gaatagttga aagaggggca ggaactggat gaacagttta cccaccatta 120
tcagcaaata ttgctcatgg tggagcttct gttgatcttg ctattttcag attacatcta 180
gcaggtattt cctcaattct aggagctgtt aattttatta ctacagtaat taatatacga 240
tcaaagggaa taactcctga ccgaatacca ttatttgttt gatcagtagc aattactgcg 300
cttcttttac ttctctcact tcctgttctt gcaggagcta ttactatact tctaac 356
<210> 24
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_ater（6）
<400> 24
gcatttcctc gaataaataa tataagattc tgactacttc caccttcatt atctcttctt 60
ttaataagaa gaatagttga aagaggggca ggaactggat gaacagttta cccaccatta 120
tcagcaaata ttgctcatgg tggagcttct gttgatcttg ctattttcag attacatcta 180
gcaggtattt cctcaattct aggagctgtt aattttatta ctacagtaat taatatacga 240
tcaaagggaa taactcctga ccgaatacca ttatttgttt gatcagtagc aattactgcg 300
cttcttttac ttctctcact tcctgttctt gcaggagcta ttactatact tctaac 356
<210> 25
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_frischii
<400> 25
gcatttcctc gaataaataa tataagattt tgactccttc ctccatcatt atctctttta 60
ttaataagaa gaatagtaga aagaggagca ggaacaggat gaacagttta tcctcctcta 120
tcagctaata ttgctcatgg tggagcatca gttgatttag caatttttag attacatctt 180
gctggaattt cttcaattct tggtgcagtt aatttcatta ctacagtaat taatatacga 240
tctaagggaa taactcctga tcgaatacct ttatttgttt gatcagttgc tattactgct 300
cttcttcttt tattatctct tccagtactt gcaggtgcta ttactatact tctaac 356
<210> 26
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_frischii（2）
<400> 26
gcatttcctc gaataaataa tataagattt tgactccttc ctccatcatt atctctttta 60
ttaataagaa gaatagtaga aagaggagca ggaacaggat gaacagttta tcctcctcta 120
tcagctaata ttgctcatgg tggagcatca gttgatttag caatttttag attacatctt 180
gctggaattt cttcaattct tggtgcagtt aatttcatta ctacagtaat taatatacga 240
tctaagggaa taactcctga tcgaatacct ttatttgttt gatcagttgc tattactgct 300
cttcttcttt tattatctct tccagtactt gcaggtgcta ttactatact tctaac 356
<210> 27
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_frischii（3）
<400> 27
gcatttcctc gaataaataa tataagattt tgactccttc ctccatcatt atctctttta 60
ttaataagaa gaatagtaga aagaggagca ggaacaggat gaacagttta tcctcctcta 120
tcagctaata ttgctcatgg tggagcatca gttgatttag caatttttag attacatctt 180
gctggaattt cttcaattct tggtgcagtt aatttcatta ctacagtaat taatatacga 240
tctaagggaa taactcctga tcgaatacct ttatttgttt gatcagttgc tattactgct 300
cttcttcttt tattatctct tccagtactt gcaggtgcta ttactatact tctaac 356
<210> 28
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_lardarius
<400> 28
gcattcccac gaataaataa cataagattt tgacttctac ctccttcact atctttatta 60
ctgataagaa gaatagtaga aagaggagca ggaacagggt gaacagtata ccctccatta 120
tctgcaaata ttgcccatag aggagcttca gtagacctag ctatttttag attacattta 180
gcaggaattt cttctattct tggagcagta aattttatta caactgttat taatatacga 240
tcaaaaggaa taactcctga ccgaatacca ctattcgttt gatcagtagc tattactgca 300
cttcttcttc ttttatcatt acctgttcta gctggagcaa tcactatatt attaac 356
<210> 29
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_lardarius（2）
<400> 29
gcattccccc gaataaataa cataagattt tgacttctac ctccttcact atctttatta 60
ctgataagaa gaatagtaga aagaggagca ggaacagggt gaacagtata ccctccatta 120
tctgcaaata ttgcccatag aggagcttca gtagacctag ctatttttag attacattta 180
gcaggaattt cttctattct tggagcagta aattttatta caactgttat taatatacga 240
tcaaaaggaa taactcctga ccgaatacca ctattcgttt gatcagtagc tattactgca 300
cttcttcttc ttttatcatt acctgttcta gctggagcaa tcactatact tctcac 356
<210> 30
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_lardarius（3）
<400> 30
gcattccccc gaataaataa cataagattt tgacttctac ctccttcact atctttatta 60
ctgataagaa gaatagtaga aagaggagca ggaacagggt gaacagtata ccctccatta 120
tctgcaaata ttgcccatag aggagcttca gtagacctag ctatttttag attacattta 180
gcaggaattt cttctattct tggagcagta aattttatta caactgttat taatatacga 240
tcaaaaggaa taactcctga ccgaatacca ctattcgttt gatcagtagc tattactgca 300
cttcttcttc ttttatcatt acctgttcta gctggagcaa tcactatact tctcac 356
<210> 31
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_lardarius（4）
<400> 31
gcattccccc gaataaataa cataagattt tgacttctac ctccttcact atctttatta 60
ctgataagaa gaatagtaga aagaggagca ggaacagggt gaacagtata ccctccatta 120
tctgcaaata ttgcccatag aggagcttca gtagacctag ctatttttag attacattta 180
gcaggaattt cttctattct tggagcagta aattttatta caactgttat taatatacga 240
tcaaaaggaa taactcctga ccgaatacca ctattcgttt gatcagtagc tattactgca 300
cttcttcttc ttttatcatt acctgttcta gctggagcaa tcactatact tctcac 356
<210> 32
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_maculatus
<400> 32
gcatttcccc gaataaataa tataagattt tgacttcttc caccatcttt atctctttta 60
ttaataagaa gaatggtaga aagaggagca ggaacaggat gaacagttta tccaccccta 120
tcagctaata ttgcacatgg aggagcttct gttgatttag caatttttag attacatctt 180
gcaggaattt cttcaattct tggagcagta aactttatta ctacagtaat taatatacga 240
tcaaaaggaa taactcctga tcgaatacct ttatttgttt gatcagtagc aattactgct 300
ttactactac ttttatctct accagttctt gctggagcaa ttacaatatt actaac 356
<210> 33
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_maculatus（2）
<400> 33
gcattcccac gaataaataa tataagattc tgacttcttc caccatcttt atctctttta 60
ttaataagaa gaatggtaga aagaggagca ggaacaggat gaacagttta tccacctcta 120
tcagctaata ttgcacatgg aggagcttct gttgatttag caatttttag attacatctt 180
gcaggaatct cttcaattct tggagcagta aattttatta ctacagtaat taatatacga 240
tcaaagggaa taactcctga tcgaatacca ttatttgttt gatcagtagc aattactgct 300
ttacttcttc tattatctct accagttctt gctggtgcaa ttactatatt attaac 356
<210> 34
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_maculatus（3）
<400> 34
gcattcccac gaataaataa tataagattc tgacttcttc caccatcttt atctctttta 60
ttaataagaa gaatggtaga aagaggagca ggaacaggat gaacagttta tccacctcta 120
tcagctaata ttgcacatgg aggagcttct gttgatttag caatttttag attacatctt 180
gcaggaatct cttcaattct tggagcagta aattttatta ctacagtaat taatatacga 240
tcaaagggaa taactcctga tcgaataccc ttatttgtct gatcagtagc aattactgct 300
ttacttcttc tattatctct accagttctt gctggtgcaa ttacaatatt attaac 356
<210> 35
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_maculatus（4）
<400> 35
gcattcccac gaataaataa tataagattc tgacttcttc caccatcttt atctctttta 60
ttaataagaa gaatggtaga aagaggagca ggaacaggat gaacagttta tccacctcta 120
tcagctaata ttgcacatgg aggagcttct gttgatttag caatttttag attacatctt 180
gcaggaatct cttcaattct tggagcagta aattttatta ctacagtaat taatatacga 240
tcaaagggaa taactcctga tcgaatacca ttatttgttt gatcagtagc aattactgct 300
ttacttcttc tattatctct accagttctt gctggtgcaa ttacaatatt attaac 356
<210> 36
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_maculatus（5）
<400> 36
gcattcccac gaataaataa tataagattc tgacttcttc caccatcttt atctctttta 60
ttaataagaa gaatggtaga aagaggagca ggaacaggat gaacagttta tccacctcta 120
tcagctaata ttgcacatgg aggagcttct gttgatttag caatttttag attacatctt 180
gcaggaatct cttcaattct tggagcagta aattttatta ctacagtaat taatatacga 240
tcaaagggaa taactcctga tcgaatacca ttatttgttt gatcagtagc aattactgct 300
ttacttcttc tattatctct accagttctt gctggtgcaa ttactatatt attaac 356
<210> 37
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_maculatus（6）
<400> 37
gcattcccac gaataaataa tataagattc tgacttcttc caccatcttt atctctttta 60
ttaataagaa gaatggtaga aagaggagca ggaacaggat gaacagttta tccacctcta 120
tcagctaata ttgcacatgg aggagcttct gttgatttag caatttttag attacatctt 180
gcaggaatct cttcaattct tggagcagta aattttatta ctacagtaat taatatacga 240
tcaaagggaa taactcctga tcgaataccc ttatttgtct gatcagtagc aattactgct 300
ttacttcttc tattatctct accagttctt gctggtgcaa ttacaatatt attaac 356
<210> 38
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_murinus
<400> 38
gcattccctc gaataaataa tataagattc tgacttctac caccgtcact ttctcttctt 60
ctaataagaa gaatagtaga aagaggagca ggtacaggat gaacagttta tccgccatta 120
tctgcaaata ttgcccatgg aggagcatca gttgatctag ctatttttag actacattta 180
gcaggaatct cttcaattct aggagctgta aattttatta caacagtaat caatatacga 240
tcaaaaggaa taactcctga tcgaataccc ttatttgtat gatcagtagc aattactgct 300
ctgcttctac tactatcttt acctgttctt gcaggagcaa tcacaatact acttac 356
<210> 39
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_peruvianus
<400> 39
gcattcccac gaataaataa tataagattc tgattattac caccttcact ttcattatta 60
ctaataagaa gaatagttga aagaggagct ggaacaggat gaacagtata tcctccacta 120
tcagctaata ttgcccatgg aggagcatca gtagatttag ctatttttag acttcattta 180
gctggaattt cttctattct tggtgcagta aattttatta ctacagtaat taatatacga 240
tcaaaaggaa taacaccaga tcgaatacct ttatttgttt gatctgtagc aattacagca 300
ttacttcttc ttctttctct tcctgttctt gccggagcaa ttactatatt attaac 356
<210> 40
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_szekessyi
<400> 40
gcatttcctc gaataaataa tataagattc tgacttttac ctccctcact ttctctttta 60
ttaataagaa gaatagtaga aagaggagca ggaacaggct gaacagttta tcctccatta 120
tctgcaaata ttgctcatgg aggagcttca gttgatttag ctatttttag attacatctt 180
gcaggaattt cttctattct tggagcagtt aattttatta caactgtaat taatatacga 240
tcaaagggaa taactccaga tcgaatacca ttatttgttt gatcagtagc tattactgca 300
ttactattac ttctttcact tccagttctt gctggagcaa ttactatact attaac 356
<210> 41
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_szekessyi（2）
<400> 41
gcatttcctc gaataaataa tataagattc tgacttttac ctccctcact ttctctttta 60
ttaataagaa gaatagtaga aagaggagca ggaacaggct gaacagttta tcctccatta 120
tctgcaaata ttgctcatgg aggagcttca gttgatttag ctatttttag attacatctt 180
gcaggaattt cttctattct tggagcagtt aattttatta caactgtaat taatatacga 240
tcaaagggaa taactccaga tcgaatacca ttatttgttt gatcagtagc tattactgca 300
ttactattac ttctttcact tccagttctt gctggagcaa ttactatact attaac 356
<210> 42
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_szekessyi（3）
<400> 42
gcatttcctc gaataaataa tataagattc tgacttttac ctccctcact ttctctttta 60
ttaataagaa gaatagtaga aagaggagca ggaacaggct gaacagttta tcctccatta 120
tctgcaaata ttgctcatgg aggagcttca gttgatttag ctatttttag attacatctt 180
gcaggaattt cttctattct tggagcagtt aattttatta caactgtaat taatatacga 240
tcaaagggaa taactccaga tcgaatacca ttatttgttt gatcagtagc tattactgca 300
ttactattac ttctttcact tccagttctt gctggagcaa ttactatact attaac 356
<210> 43
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_szekessyi（4）
<400> 43
gcatttcctc gaataaataa tataagattc tgacttttac ctccctcact ttctctttta 60
ttaataagaa gaatagtaga aagaggagca ggaacaggct gaacagttta tcctccatta 120
tctgcaaata ttgctcatgg aggagcttca gttgatttag ctatttttag attacatctt 180
gcaggaattt cttctattct tggagcagtt aattttatta caactgtaat taatatacga 240
tcaaagggaa taactccaga tcgaatacca ttatttgttt gatcagtagc tattactgca 300
ttactattac ttctttcact tccagttctt gctggagcaa ttactatact attaac 356
<210> 44
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_szekessyi（5）
<400> 44
gcatttcctc gaataaataa tataagattc tgacttttac ctccctcact ttctctttta 60
ttaataagaa gaatagtaga aagaggagca ggaacaggct gaacagttta tcctccatta 120
tctgcaaata ttgctcatgg aggagcttca gttgatttag ctatttttag attacatctt 180
gcaggaattt cttctattct tggagcagtt aattttatta caactgtaat taatatacga 240
tcaaagggaa taactccaga tcgaatacca ttatttgttt gatcagtagc tattactgca 300
ttactattac ttctttcact tccagttctt gctggagcaa ttactatact attaac 356
<210> 45
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_tessellatocollis
<400> 45
gcattccctc gaataaataa tataagattc tgattattac caccttcact ttcattatta 60
ctaataagaa gaatagttga aagaggagct ggaacaggat gaacagtata tcctccacta 120
tcagctaata ttgcccatgg aggagcatca gtagatttag ctatttttag acttcattta 180
gctggaattt cttctattct tggtgcagta aattttatta ctacagtaat taatatacga 240
tcaaaaggaa taacaccaga tcgaatacct ttatttgttt gatctgtagc aattacagca 300
ttacttcttc ttctttctct tcctgttctt gccggagcaa ttacaatatt attaac 356
<210> 46
<211> 356
<212> DNA
<213> Dermestes_tessellatocollis（2）
<400> 46
gcattccctc gaataaataa tataagattc tgattattac caccttcact ttcattatta 60
ctaataagaa gaatagttga aagaggagct ggaacaggat gaacagtata tcctccacta 120
tcagctaata ttgcccatgg aggagcatca gtagatttag ctatttttag acttcattta 180
gctggaattt cttctattct tggtgcagta aattttatta ctacagtaat taatatacga 240
tcaaaaggaa taacaccaga tcgaatacct ttatttgttt gatctgtagc aattacagca 300
ttacttcttc ttctttctct tcctgttctt gccggagcaa ttacaatatt attaac 356
<210> 47
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<212> DNA
<213> Trogoderma_anthrenoides
<400> 47
gcattcccac gaataaataa tataagattt tgattactcc caccatccct atcattatta 60
ctagctagaa gaatagtaga aagaggagca ggaaccggat gaacagtgta ccccccacta 120
tcatcaaata ttgctcacgg aggagcatcc gtagacttag ctattttcag actccatcta 180
gcaggaatct catcaatcct aggagcagta aacttcatca ctacagctat taatatacga 240
acaacgggaa taactcctga acgaatacct ctattcgtat gatcagtagc tattacagca 300
ctcctattgc ttctatccct accagtatta gcaggagcta ttacaatact attaac 356
<210> 48
<211> 356
<212> DNA
<213> Trogoderma_anthrenoides（2）
<400> 48
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ctagctagaa gaatagtaga aagaggagca ggaaccggat gaacagtgta ccccccacta 120
tcatcaaata ttgctcacgg aggagcatcc gtagacttag ctattttcag actccatcta 180
gcaggaatct catcaatcct aggagcagta aacttcatca ctacagctat taatatacga 240
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ctcctattgc ttctatccct accagtatta gcaggagcta ttacaatact attaac 356
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<211> 356
<212> DNA
<213> Trogoderma_anthrenoides（3）
<400> 49
gcattcccac gaataaataa tataagattt tgattactcc caccatccct atcattatta 60
ctagctagaa gaatagtaga aagaggagca ggaaccggat gaacagtgta ccccccacta 120
tcatcaaata ttgctcacgg aggagcatcc gtagacttag ctattttcag actccatcta 180
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<212> DNA
<213> Trogoderma_glabrum
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<212> DNA
<213> Trogoderma_glabrum（2）
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ttaacaagaa gaattgtaga aaaaggagca ggaactggat gaacagtata cccaccatta 120
tctgcaaata ttgctcacgc aggagcgtct gtagatctag caatttttag attacatcta 180
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actactggta taaccccaga acgaatacct ttatttgtct gatcagtagc aattacagca 300
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<213> Trogoderma_granarium
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ctagctagaa gaatagtaga aacaggagcc ggaaccggat gaactgttta tccaccttta 120
tccgccaaca ttgcccacag cggagcatca gtcgacctag caatcttcag cttacaccta 180
gcaggaatct cctcaatcct aggagcagta aactttatta caacagcaat taacatacga 240
accacaggaa taactcccga acgaataccc ttattcgtat gatcagtagc aatcaccgcc 300
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<213> Trogoderma_granarium（10）
<400> 53
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<213> Trogoderma_granarium（2）
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<213> Trogoderma_granarium（3）
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<213> Trogoderma_granarium（4）
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<213> Trogoderma_granarium（5）
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<213> Trogoderma_granarium（6）
<400> 58
gcatttccac gaataaacaa cataagattt tgactcctcc ccccttctct atctcttctt 60
ctagctagaa gaatagtaga aacaggagcc ggaaccggat gaactgttta tccaccttta 120
tccgccaaca ttgcccacag cggagcatca gtcgacctag caatcttcag cttacaccta 180
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<213> Trogoderma_granarium（7）
<400> 59
gcattcccac gaataaataa cataagattt tgactcctcc ccccttctct atctcttctt 60
ctagctagaa gaatagtaga aacaggagcc ggaaccggat gaactgttta tccaccttta 120
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<213> Trogoderma_granarium（8）
<400> 60
gcattcccac gaataaataa cataagattt tgactcctcc ccccttctct atctcttctt 60
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ctcctcctcc tgctgtccct ccccgtccta gcaggagcta tcactatatt attaac 356
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<211> 356
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<213> Trogoderma_granarium（9）
<400> 61
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ctcctcctcc tgctgtccct ccccgtccta gcaggagcta tcactatact tctaac 356
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> J1837序列
<400> 62
tatagcattc ccacgaataa ata 23
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> N2110序列
<400> 63
atttcggtca gttaataata tag 23
Claims (4)
1.一种皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒，可以快速检测19种皮蠹，其特征在于：至少包括基因条形码序列盘和20次用量以上的引物J1837 /N2110试剂；引物J1837 /N2110序列如下：
J1837序列：5'-TATAGCATTCCCACGAATAAATA-3'，
N2110序列：5'-ATTTCGGTCAGTTAATAATATAG-3'；
所述基因条形码序列盘存有61条标准条码序列，详细序列为SEQ ID NO.1到SEQ IDNO.61所示。
2.根据权利要求1所述的皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒，其特征在于：还包括20次用量以上的下列试剂：Taq buffer，MgCl2，dNTP mix，Taq DNA 聚合酶，ddH2O，DNA标准样。
3.根据权利要求2所述的皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒，其特征在于：所述的19种皮蠹具体为：小圆皮蠹，标本圆皮蠹，地毯圆皮蠹，二星毛皮蠹，斯氏毛皮蠹，Attagenus woodroffei，黑毛皮蠹，短角褐毛皮蠹，鼠灰皮蠹，钩纹皮蠹，拟白腹皮蠹，火腿皮蠹，白腹皮蠹，秘鲁皮蠹，Dermestes szekessyi，赤毛皮蠹，墨西哥斑皮蠹，谷斑皮蠹，黑斑皮蠹。
4.权利要求1所述的皮蠹科昆虫基因条形码检测试剂盒检测皮蠹科昆虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）DNA的制备：采用GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA 磁珠提取试剂盒提取待检测样品；
2）PCR反应体系与反应条件
PCR反应体系：总体积为50 µL，其中含5 µL 10×Taq buffer with KCl、2 mmol/LMgCl2、200 µmol/L dNTP mix、2 U Taq DNA 聚合酶、3 µL DNA模板、引物各1 µmol/L；
PCR反应程序：循环前94℃预变性2 min；94℃变性1 min、43℃退火温度1min，72℃延伸1.5min，进行30个循环；循环结束后72℃延伸5 min，-20℃保存；混合8 µL待测样品与2 µL6×Glycerol DNA loading Buffer上样，以DNA Marker DL100为分子量标记，室温下恒压120 V，用3 %琼脂糖凝胶电泳45 min，0.5% µmol/L的EB染色，凝胶成像系统检测样品，拍照分析；
3）PCR结果判定
混合8 µLPCR产物与2 µL 6×Glycerol DNA loading Buffer上样，以DNA MarkerDL100为分子量标记，室温下恒压120 V，用3 %琼脂糖凝胶电泳45 min，0.5% µmol/L的EB染色，凝胶成像系统检测样品，拍照；照片显示皮蠹与标准DNA样品在356bp位置有清晰的扩增条带，即为目标条带；
4）RCR产物测序获得基因序列；
5）皮蠹科昆虫基因比对
将待测皮蠹测序得到的序列与基因条形码序列盘中标准基因条码序列进行比对，结果按以下方式运行：
A：与标准基因条码序列相似度100%，则认定其为该种类；
B：没有与任何标准条码序列相似度达100%，则将待测皮蠹基因序列按“无脊椎动物密码子”翻译为氨基酸，与标准基因条码序列所对应的氨基酸序列使用“P-distance模型”计算遗传距离，与未知种类皮蠹基因序列遗传距离小于2%的标准基因条码种类，即为目标种类；如果遗传距离都大于2%，判定未知皮蠹种类不在此19种皮蠹范围内。
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