CN104513863A - 基于dna条形码的烟草虫害检测方法 - Google Patents

基于dna条形码的烟草虫害检测方法 Download PDF

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CN104513863A CN201510029526.7A CN201510029526A CN104513863A CN 104513863 A CN104513863 A CN 104513863A CN 201510029526 A CN201510029526 A CN 201510029526A CN 104513863 A CN104513863 A CN 104513863A
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罗朝鹏
王燃
魏春阳
李锋
孟庆华
武明珠
张剑锋
王中
杨军
林福呈
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Abstract

一种基于DNA条形码的烟草虫害检测方法，是利用组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取可能含有害虫的烟草基因组DNA，使用动物特异性的DNA条形码（CO1基因）引物进行PCR扩增。如果样品中含有害虫，那么使用该引物就能够扩增出相应的目的条带，将特异性PCR产物克隆测序，并通过Blast验证其是否为虫子的DNA条形码基因。总之，根据PCR条带有无，判断样品中有无害虫；根据目的条带序列，判断是什么害虫。本发明在DNA水平上对烟草虫害进行检测，无论是活虫、死虫，还是处于任意生长发育阶段的虫体（虫卵、幼虫、蛹、成虫）都可进行检测，且适用于新鲜烟叶、初烤烟叶、复烤烟叶、仓贮烟叶、烟丝、卷烟等虫害的检测。

Description

基于DNA条形码的烟草虫害检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种可准确地检测烟草虫害的基于DNA条形码的检测方法。
背景技术
烟草在加工、储藏和销售等过程中均易遭受害虫破坏，害虫/虫尸混入烟叶和卷烟产品中，会降低烟叶及烟丝的品质，劣化卷烟的吸味。据调查，全国贮烟害虫每年导致的烟叶重量损失率大约为1.64％，烟叶损失总量大约为62.3万担。目前烟草行业对烟草虫害的检测主要分为肉眼检查和信息素诱集检测。前者受人为因素影响太大，准确度不高；后者只能诱集到活的成虫，对死虫、虫卵、幼虫或虫蛹等无效，这些虫源“污染”同样会给烟叶贮存和卷烟生产带来危害。
2003年，加拿大分类学家Paul Hebert提出了DNA条形码的概念，它是基因组DNA中的一个特殊的小片段基因序列，相当于物种的基因身份证，通过它可以区分不同的物种，其中线粒体CO1基因作为动物DNA条形码应用相当广泛。Paul Herbert等人利用CO1基因研究了动物界的11个门，13320个物种，除了刺胞动物门以外，CO1都能够很好地区分其它门的物种。
由于烟草属于植物界，因此利用CO1条形码基因的特异性引物无法从烟草基因组DNA中扩增出相应的目的条带。如果烟草中混有虫体的话，提取的烟草基因组DNA中就会含有虫体的DNA，使用CO1引物进行PCR扩增时，就能够扩增出动物的DNA条形码基因。
发明内容
本发明的目的是针对烟草行业现行的烟草虫害检测方法的缺陷与不足，提供了一种科学准确的分子生物学检测方法——基于DNA条形码的烟草虫害检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种基于DNA条形码的烟草虫害检测方法，是利用组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取可能含有害虫的烟草基因组DNA，使用动物特异性的DNA条形码（CO1基因）引物进行PCR扩增；如果样品中含有害虫，那么使用CO1特异性引物就能够扩增出相应的目的条带，将特异性PCR产物克隆测序，并通过Blast验证其是否为虫子的DNA条形码基因，即根据PCR条带有无，判断样品中有无害虫；根据目的条带序列，判断是什么害虫，具体步骤如下：
（1）收集有害虫的烟草样品，每份样品在不同位置取样三次，即三个生物学重复；
（2）将各样品分别放入研钵中，倒入20 ml液氮研磨，使用组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；
（3）使用超微量分光光度计Thermo NanoDrop 2000测定各样品基因组DNA的浓度和纯度；
（4）利用动物特异性的CO1条形码基因引物（上游引物5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，下游引物5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’）进行PCR扩增；
（5）将特异性的PCR产物胶回收，并与T载体连接，转化感受态细胞，每份样品随机挑取10个单克隆进行测序；
（6）测序结果通过Blast比对，以确定是否为虫子的CO1条形码基因。
步骤（1）中以无任何虫害的烟草样品作为阴性对照。
步骤（4）中，PCR反应体系如下（以50 μL反应体系为例）：
反应物 体积 终浓度
DNA模板 Variable As required
10×TransTaq HiFi BufferⅠ 5 μL 1×
2.5 mM dNTPs 4 μL 0.2 mM
TransTaq HiFi DNA Polymerase 0.5～1 μL 2.5～5 units
上游引物（10 μM） 1～2 μL 0.2～0.4 μM
下游引物（10 μM） 1～2 μL 0.2～0.4 μM
ddH2O Variable —
总体积 50 μL —
PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共运行35个循环；最后72℃延伸10 min；4℃保存。
如果PCR扩增出700 bp左右的特异性条带，将该目的条带胶回收，与T载体连接，转化感受态细胞，随机挑取10个单克隆进行测序。
步骤（6）中，将测序结果在NCBI网站上进行Blast比对，如果与数据库中某个虫子的CO1条形码基因序列的相似度在95%以上，则表明待测的烟草样品中含有虫子，同时还可以确定虫子是哪个物种。
该检测方法与现行的肉眼检查和信息素诱集检测方法相比，只要待测样品中含有虫体，无论是活虫、死虫，还是处于任意生长发育阶段的虫体（虫卵、幼虫、蛹、成虫）都能够快速准确地检测出来，而且通过DNA条形码序列比对还可以鉴定出虫子是哪个物种。
附图说明
图1是本方法的检测流程图；
图2是待测样品1 PCR扩增后的电泳图；
图中1：有害虫的初烤烟叶样品，2：完全无害虫的初烤烟叶样品，M：Trans2K DNA Marker。
图3是待测样品1特异性的PCR产物克隆测序后的Blast比对结果；
图中：*Lasioderma serricorne：烟草甲；Identities：序列相似度。
图4是待测样品2 PCR扩增后的电泳图；
图中：1：有害虫的仓贮烟叶样品，2：完全无害虫的仓贮烟叶样品，M：Trans2K DNA Marker。
图5是待测样品2特异性的PCR产物克隆测序后的Blast比对结果；
图中：*Ephestia elutella：烟草粉螟；Identities：序列相似度。
图6是待测样品3 PCR扩增后的电泳图；
图中：1：有害虫的仓贮烟叶样品，2：完全无害虫的仓贮烟叶样品，M：Trans2K DNA Marker。
图7是待测样品3特异性的PCR产物克隆测序后序列1的Blast比对结果；
图中：*Lasioderma serricorne：烟草甲；Identities：序列相似度。
图8是待测样品3特异性的PCR产物克隆测序后序列2的Blast比对结果；
图中：*Ephestia elutella：烟草粉螟；Identities：序列相似度。
图9是待测样品3特异性的PCR产物克隆测序后序列3的Blast比对结果；
图中：* Attagenus smirnovi：黑皮蠹；Identities：序列相似度。
具体实施方式
下面结合附图和具体实例对本发明做进一步的详细说明，本发明并不局限于以下实施例。
实施例1
（1）收集待测的烟草样品
收集有害虫的和完全无害虫的初烤烟叶（把烟）样品（待测样品1），后者作为阴性对照。每份待测样品在不同位置取样三次，即三个生物学重复。
（2）提取待测样品1的基因组DNA
将各样品分别放入研钵中，倒入20 mL液氮研磨，按照组织/细胞基因组DNA提取试剂盒说明书提取待测样品的基因组DNA。
（3）检测基因组DNA的浓度和纯度
使用Thermo NanoDrop 2000测定基因组DNA的浓度和纯度。当A260/A280=1.8～2.0，表示DNA纯度较高。
（4）PCR引物合成
上游引物5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；
下游引物5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
（5）PCR反应体系与条件
PCR反应体系为50 μL：DNA模板2 μL，上下游引物各2 μL（10 μM），dNTPs 4 μL（10 mM），10×Buffer 5 μL，HiFi酶（5 units/μL）1 μL，ddH2O 34 μL。
PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共运行35个循环；最后72℃延伸10 min；4℃保存。
（6）PCR产物克隆测序
1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图2所示，有害虫的初烤烟叶样品在700 bp附近有清晰特异的目的条带，而完全无害虫的初烤烟叶样品没有扩增出条带。胶回收目的条带，并与T载体连接，转化感受态细胞，每份样品随机挑取10个单克隆进行测序。
（7）PCR测序结果分析
如图3所示，将测序结果在NCBI网站上进行Blast比对，结果显示随机挑取的10个单克隆中目标序列的长度均为660 bp（参见序列表中检测样品1），与烟草甲（Lasioderma serricorne）线粒体CO1基因的相似度达99%。这表明PCR扩增出来的目标条带为烟草甲的CO1条形码基因，该初烤烟叶样品中含有害虫烟草甲。
实施例2
（1）收集待测的烟草样品
收集有害虫的和完全无害虫的仓贮烟叶（片烟）样品（待测样品2），后者作为阴性对照。每份待测样品在不同位置取样三次，即三个生物学重复。
（2）提取待测样品2的基因组DNA（同实施例1）
（3）检测基因组DNA的浓度和纯度（同实施例1）
（4）PCR引物合成（同实施例1）
（5）PCR反应体系与条件（同实施例1）
（6）PCR产物克隆测序
如图4所示，有害虫的仓贮烟叶样品在700 bp附近有清晰特异的目的条带，而完全无害虫的仓贮烟叶样品没有扩增出条带。胶回收目的条带，并与T载体连接，转化感受态细胞，每份样品随机挑取10个单克隆进行测序。
（7）PCR测序结果分析
如图5所示，将测序结果在NCBI网站上进行Blast比对，结果显示随机挑取的10个单克隆中目标序列的长度均为658 bp（参见序列表中检测样品2），与烟草粉螟（Ephestia elutella）线粒体CO1基因的相似度达99%。这表明PCR扩增出来的目标条带为烟草粉螟的CO1条形码基因，该仓贮烟叶样品中含有害虫烟草粉螟。
实施例3
（1）收集待测的烟草样品
收集有害虫的和完全无害虫的仓贮烟叶（片烟）样品（待测样品3），后者作为阴性对照。每份待测样品在不同位置取样三次，即三个生物学重复。
（2）提取待测样品3的基因组DNA（同实施例1）
（3）检测基因组DNA的浓度和纯度（同实施例1）
（4）PCR引物合成（同实施例1）
（5）PCR反应体系与条件（同实施例1）
（6）PCR产物克隆测序
如图6所示，有害虫的仓贮烟叶样品在700 bp附近有特异的目的条带，而完全无害虫的仓贮烟叶样品没有扩增出条带。胶回收目的条带，并与T载体连接，转化感受态细胞，每份样品随机挑取10个单克隆进行测序。
（7）PCR测序结果分析
如图7～9所示，将测序结果在NCBI网站上进行Blast比对，结果显示随机挑取的10个单克隆中有5条目标序列的长度为660 bp（参见序列表中检测样品3序列1），与烟草甲（Lasioderma serricorne）线粒体CO1基因的相似度达99%；有3条目标序列的长度为658 bp（参见序列表中检测样品3序列2），与烟草粉螟（Ephestia elutella）线粒体CO1基因的相似度达99%；有2条目标序列的长度为658 bp（参见序列表中检测样品3序列3），与黑皮蠹（Attagenus smirnovi）线粒体CO1基因的相似度达99%。这表明PCR扩增出来的目标条带中分别包含烟草甲、烟草粉螟和黑皮蠹的CO1条形码基因，该仓贮烟叶样品中含有上述三种害虫。
本发明的特点：
（1）可以检测出烟草或烟草制品中是否含有害虫，甚至可以检测出含有几种害虫；
（2）可以鉴定检测出的害虫是哪些物种；
（3）仅需小块虫体组织即可进行鉴定，只要能够从零散的虫体碎片中提取出较完整的DNA，就能够通过DNA条形码进行鉴定；
（4）不受害虫生长发育阶段的限制。DNA条形码是从基因水平对害虫进行检测鉴定，无论害虫处于哪个生长发育阶段（虫卵、幼虫、虫蛹和成虫）都可以被检测出来。
序列表
在有害虫的初烤烟叶样品中（待测样品1），PCR扩增出的目标序列：
AATAATTTCT CATATTATTA GACAAGAAAG AGGAAATAAA GAATCATTCG GAACTTTAGG TATAATCTAT GCAATAATAT CTATTGGTTT ATTAGGATTT ATTGTATGAG CTCATCATAT GTTTACAGTT GGTATGGATG TTGATACTCG AGCTTATTTT ACAGCTGCTA CAATAATTAT TGCTATTCCA ACTGGAATTA AGGTATTTAG TTGATTAGCT ACATTACATG GATGTCAATT AAATTATTCA GTTTCTTTAT TATGAGCATT AGGATTTGTA TTCTTGTTTA CTGTAGGAGG ATTAACTGGT GTGGTTTTAG CAAATTCTTC AATTGATATT ATTCTTCATG ATACTTATTA TGTAGTACCT CATTTTCACT ATGTGTTATC AATAGGGGCA GTATTTGCAA TTATAGGAGG CTTAATTCAT TGGTTTCCTT TGTTTACAGG ATTAAGTTTA AATTACAAAT ATTTAAAGAT TCAGTTCTTA ATTATATTTA TTGGAGTAAA TTTAACTTTT TTTCCTCAGC ATTTATTAGG ATTAAGAGGA ATACCTCGTC GATATTCTGA TTATCCAGAT GCTTATTTAT TTTGAAATAT TGTATCTTCA ATTGGTTCTA TAATAAGATT AATAAGAATT TTAATTTTCA TTTTTATTAT
在有害虫的仓贮烟叶样品中（待测样品2），PCR扩增出的目标序列：
AACATTATAT TTTATATTTG GAATTTGATC TGGAATAGTA GGTACTTCCT TAAGTTTATT AATTCGTGCT GAATTAGGAA CCCCAGGATC TTTAATTGGA GATGATCTAA TTTATAATAC TATTGTAACT GGCCATGCTT TTATTATAAT TTTTTTAATA GTTATACCAA TTATAATTGG AGGATTTGGA AATTGATTAG TTCCTTTAAT ATTAGGAGCT CCTGATATAG CTTTCCCCGG AATAAATAAT ATAAGATTTT GACTTCTTCC CCCTTCTTTA AGTTTATTAA TTTCAAGATC TATTGTAGAA AATGGTGCTG GAACTGGATG AACTGTATAC CCCCCACTTT CATCTAATAT CGCCCATAGA GGAAGCTCTG TAGATTTAGC TATTTTCTCC CTTCATTTAG CTGGTATTTC ATCAATTTTA GGTGCAATTA AATTTATTAC AACTATTATT AATATAAAAT TAAATGGAAT AATATTTGAT CAAATACCTT TATTTGTTTG AGCAGTTGGT ATTACAGCAT TACTCCTTCT CCTTTCCCTT CCTGTACTAG CTGGAGCTAT TACAATATTA TTAACAGATC GTAATCTTAA CACATCTTTC TTTGATCCTG CTGGAGGAGG AGATCCTATT CTTTATCAAC ACTTATTT
在有害虫的仓贮烟叶样品中（待测样品3），PCR扩增出的目标序列：
序列1：
AATAATTTCT CATATTATTA GACAAGAAAG AGGAAATAAA GAATCATTCG GAACTTTAGG TATAATCTAT GCAATAATAT CTATTGGTTT ATTAGGATTT ATTGTATGAG CTCATCATAT GTTTACAGTT GGTATGGATG TTGATACTCG AGCTTATTTT ACAGCTGCTT CAATAATTAT TGCTATTCCA ACTGGAATTA AGGTATTTAG TTGATTAGCT ACATTACATG GATGTCAATT AAATTATTCA GTTTCTTTAT TATGAGCATT AGGATTTGTA TTCTTGTTTA CTGTAGGAGG ATTAACTGGT GTGGTTTTAG CAAATTCTTC AATTGATATT ATTCTTCATG ATACTTATTA TGTAGTACCT CATTTTCACT ATGTGTTATC AATAGGGGCA GTATTTGCAA TTATAGGAGG CTTAATTCAT TGGTTTCCTT TGTTTACAGG ATTAAGTTTA AATTACAAAT ATTTAAAGAT TCAGTTCTTA ATTATATTTA TTGGAGTAAA TTTAACTTTT TTTCCTCAGC ATTTATTAGG ATTAAGAGGA ATACCTCGTC GATATTCTGA TTATCCAGAT GCTTATTTAT TTTGAAATAT TGTATCTTCA ATTGGTTCTA TAATAAGATT AATAAGAAAT TTAATTTTCA TTTTTATTAT
序列2：
AACATTATAA TTTATATTTG GAATTTGATC TGGAATAGTA GGTACTTCCT TAAGTTTATT AATTCGTGCT GAATTAGGAA CCCCAGGATC TTTAATTGGA GATGATCTAA TTTATAATAC TATTGTAACT GGCCATGCTT TTATTATAAT TTTTTTAATA GTTATACCAA TTATAATTGG AGGATTTGGA AATTGATTAG TTCCTTTAAT ATTAGGAGCT CCTGATATAG CTTTCCCCGG AATAAATAAT ATAAGATTTT GACTTCTTCC CCCTTCTTTA AGTTTATTAA TTTCAAGATC TATTGTAGAA AATGGTGCTG GAACTGGATG AACTGTATAC CCCCCACTTT CATCTAATAT CGCCCATAGA GGAAGCTCTG TAGATTTAGC TATTTTCTCC CTTCATTTAG CTGGTATTTC ATCAATTTTA GGTGCAATTA AATTTATTAC AACTATTATT AATATAAAAT TAAATGGAAT AATATTTGAT CAAATACCTT TATTTGTTTG AGCAGTTGGT ATTACAGCAT TACTCCTTCT CCTTTCCCTT CCTGTACTAG CTGGAGCTAT TACAATATTA TTAACAGATC GTAATCTTAA CACATCTTTC TTTGATCCTG CTGGAGGAGG AGATCCTATT CATTATCAAC ACTTATTT
序列3：
AACCCTTAAT TTCATTTTTG GCGCCTGAGC AGGAATAGTA GGAACATCTC TAAGAATACT AATCCGAACC GAACTGGGAA ATACAGGATC ATTAATTGGT GATGATCAAA TCTTTAATGT AATTGTAACA GCTCATGCAT TTGTAATAAT TTTCTTTATA GTTATACCTA TTATAATCGG AGGATTTGGT AATTGACTAG TACCCTAAAT GTTAGGGGCT CCAGATATAG CATTCCCACG AATAAATAAT ATAAGATTTT GGTTACTAGC CCCCTCCTTA ACCCTGCTAT TAATAAGAAG AATGGTTGAA AGAGGTGCGG GAACAGGTTG AACAGTTTAT CCACCATTAG CCGCAAATAT CGCTCATGGA GGAGCTTCAG TAGACCTAGC CAAATTCAGA CTACATCTAG CAGGAATCTC ATCAATTTTA GGAGCAGTAA ACTTCATTAC TACAGCTATT AACATAAAAG CCCCAGGAAT AAAATGAGAA CAAATACCAC TCTTTGTTTG ATCTGTAGTA ATTACAGCTT TACTGTTACT ATTATCATTA CCAGTACTGG CTGGAGCAAT CACAATACTA TTAACAGATC GAAACATTAA TACATCATTT TTTGATCCAT CAGGAGGAGG AGACCCAATC TTATATCAAC ACCTATTC
序列表
<110>中国烟草总公司郑州烟草研究院
<120>基于DNA条形码的烟草虫害检测方法
<160>5
 
<210>1
<211>660
<212>DNA
<213>样品1中烟草甲
<400>1
AATAATTTCT CATATTATTA GACAAGAAAG AGGAAATAAA GAATCATTCG GAACTTTAGG TATAATCTAT GCAATAATAT CTATTGGTTT ATTAGGATTT ATTGTATGAG CTCATCATAT GTTTACAGTT GGTATGGATG TTGATACTCG AGCTTATTTT ACAGCTGCTA CAATAATTAT TGCTATTCCA ACTGGAATTA AGGTATTTAG TTGATTAGCT ACATTACATG GATGTCAATT AAATTATTCA GTTTCTTTAT TATGAGCATT AGGATTTGTA TTCTTGTTTA CTGTAGGAGG ATTAACTGGT GTGGTTTTAG CAAATTCTTC AATTGATATT ATTCTTCATG ATACTTATTA TGTAGTACCT CATTTTCACT ATGTGTTATC AATAGGGGCA GTATTTGCAA TTATAGGAGG CTTAATTCAT TGGTTTCCTT TGTTTACAGG ATTAAGTTTA AATTACAAAT ATTTAAAGAT TCAGTTCTTA ATTATATTTA TTGGAGTAAA TTTAACTTTT TTTCCTCAGC ATTTATTAGG ATTAAGAGGA ATACCTCGTC GATATTCTGA TTATCCAGAT GCTTATTTAT TTTGAAATAT TGTATCTTCA ATTGGTTCTA TAATAAGATT AATAAGAATT TTAATTTTCA TTTTTATTAT
 
<210>2
<211>658
<212>DNA
<213>样品2中烟草粉螟
<400>2
 
AACATTATAT TTTATATTTG GAATTTGATC TGGAATAGTA GGTACTTCCT TAAGTTTATT AATTCGTGCT GAATTAGGAA CCCCAGGATC TTTAATTGGA GATGATCTAA TTTATAATAC TATTGTAACT GGCCATGCTT TTATTATAAT TTTTTTAATA GTTATACCAA TTATAATTGG AGGATTTGGA AATTGATTAG TTCCTTTAAT ATTAGGAGCT CCTGATATAG CTTTCCCCGG AATAAATAAT ATAAGATTTT GACTTCTTCC CCCTTCTTTA AGTTTATTAA TTTCAAGATC TATTGTAGAA AATGGTGCTG GAACTGGATG AACTGTATAC CCCCCACTTT CATCTAATAT CGCCCATAGA GGAAGCTCTG TAGATTTAGC TATTTTCTCC CTTCATTTAG CTGGTATTTC ATCAATTTTA GGTGCAATTA AATTTATTAC AACTATTATT AATATAAAAT TAAATGGAAT AATATTTGAT CAAATACCTT TATTTGTTTG AGCAGTTGGT ATTACAGCAT TACTCCTTCT CCTTTCCCTT CCTGTACTAG CTGGAGCTAT TACAATATTA TTAACAGATC GTAATCTTAA CACATCTTTC TTTGATCCTG CTGGAGGAGG AGATCCTATT CTTTATCAAC ACTTATTT
 
<210>3
<211>660
<212>DNA
<213>样品3中烟草甲
<400>3
AATAATTTCT CATATTATTA GACAAGAAAG AGGAAATAAA GAATCATTCG GAACTTTAGG TATAATCTAT GCAATAATAT CTATTGGTTT ATTAGGATTT ATTGTATGAG CTCATCATAT GTTTACAGTT GGTATGGATG TTGATACTCG AGCTTATTTT ACAGCTGCTT CAATAATTAT TGCTATTCCA ACTGGAATTA AGGTATTTAG TTGATTAGCT ACATTACATG GATGTCAATT AAATTATTCA GTTTCTTTAT TATGAGCATT AGGATTTGTA TTCTTGTTTA CTGTAGGAGG ATTAACTGGT GTGGTTTTAG CAAATTCTTC AATTGATATT ATTCTTCATG ATACTTATTA TGTAGTACCT CATTTTCACT ATGTGTTATC AATAGGGGCA GTATTTGCAA TTATAGGAGG CTTAATTCAT TGGTTTCCTT TGTTTACAGG ATTAAGTTTA AATTACAAAT ATTTAAAGAT TCAGTTCTTA ATTATATTTA TTGGAGTAAA TTTAACTTTT TTTCCTCAGC ATTTATTAGG ATTAAGAGGA ATACCTCGTC GATATTCTGA TTATCCAGAT GCTTATTTAT TTTGAAATAT TGTATCTTCA ATTGGTTCTA TAATAAGATT AATAAGAAAT TTAATTTTCA TTTTTATTAT
 
<210>4
<211>658
<212>DNA
<213>样品3中烟草粉螟
<400>4
AACATTATAA TTTATATTTG GAATTTGATC TGGAATAGTA GGTACTTCCT TAAGTTTATT AATTCGTGCT GAATTAGGAA CCCCAGGATC TTTAATTGGA GATGATCTAA TTTATAATAC TATTGTAACT GGCCATGCTT TTATTATAAT TTTTTTAATA GTTATACCAA TTATAATTGG AGGATTTGGA AATTGATTAG TTCCTTTAAT ATTAGGAGCT CCTGATATAG CTTTCCCCGG AATAAATAAT ATAAGATTTT GACTTCTTCC CCCTTCTTTA AGTTTATTAA TTTCAAGATC TATTGTAGAA AATGGTGCTG GAACTGGATG AACTGTATAC CCCCCACTTT CATCTAATAT CGCCCATAGA GGAAGCTCTG TAGATTTAGC TATTTTCTCC CTTCATTTAG CTGGTATTTC ATCAATTTTA GGTGCAATTA AATTTATTAC AACTATTATT AATATAAAAT TAAATGGAAT AATATTTGAT CAAATACCTT TATTTGTTTG AGCAGTTGGT ATTACAGCAT TACTCCTTCT CCTTTCCCTT CCTGTACTAG CTGGAGCTAT TACAATATTA TTAACAGATC GTAATCTTAA CACATCTTTC TTTGATCCTG CTGGAGGAGG AGATCCTATT CATTATCAAC ACTTATTT
 
<210>5
<211>658
<212>DNA
<213>样品3中黑皮蠹
<400>5
AACCCTTAAT TTCATTTTTG GCGCCTGAGC AGGAATAGTA GGAACATCTC TAAGAATACT AATCCGAACC GAACTGGGAA ATACAGGATC ATTAATTGGT GATGATCAAA TCTTTAATGT AATTGTAACA GCTCATGCAT TTGTAATAAT TTTCTTTATA GTTATACCTA TTATAATCGG AGGATTTGGT AATTGACTAG TACCCTAAAT GTTAGGGGCT CCAGATATAG CATTCCCACG AATAAATAAT ATAAGATTTT GGTTACTAGC CCCCTCCTTA ACCCTGCTAT TAATAAGAAG AATGGTTGAA AGAGGTGCGG GAACAGGTTG AACAGTTTAT CCACCATTAG CCGCAAATAT CGCTCATGGA GGAGCTTCAG TAGACCTAGC CAAATTCAGA CTACATCTAG CAGGAATCTC ATCAATTTTA GGAGCAGTAA ACTTCATTAC TACAGCTATT AACATAAAAG CCCCAGGAAT AAAATGAGAA CAAATACCAC TCTTTGTTTG ATCTGTAGTA ATTACAGCTT TACTGTTACT ATTATCATTA CCAGTACTGG CTGGAGCAAT CACAATACTA TTAACAGATC GAAACATTAA TACATCATTT TTTGATCCAT CAGGAGGAGG AGACCCAATC TTATATCAAC ACCTATTC
 

Claims (6)

1.一种基于DNA条形码的烟草虫害检测方法，其特征在于：该检测方法是利用组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取可能含有害虫的烟草基因组DNA，使用动物特异性的DNA条形码（CO1基因）引物进行PCR扩增；如果样品中含有害虫，那么使用CO1特异性引物就能够扩增出相应的目的条带，将特异性PCR产物克隆测序，并通过Blast验证其是否为虫子的DNA条形码基因，即根据PCR条带有无，判断样品中有无害虫；根据目的条带序列，判断是什么害虫。
2.根据权利要求1所述的基于DNA条形码的烟草虫害检测方法，其特征在于：该检测方法的具体步骤如下：
（1）收集有害虫的烟草样品，每份样品在不同位置取样三次，即三个生物学重复；
（2）将各样品分别放入研钵中，倒入20 ml液氮研磨，使用组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；
（3）测定各样品基因组DNA的浓度和纯度；
（4）利用动物特异性的CO1条形码基因引物，上游引物5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，下游引物5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’进行PCR扩增；
（5）将特异性的PCR产物胶回收，并与T载体连接，转化感受态细胞，每份样品随机挑取10个单克隆进行测序；
（6）测序结果通过Blast比对，以确定是否为虫子的CO1条形码基因。
3.根据权利要求2所述的基于DNA条形码的烟草虫害检测方法，其特征在于：步骤（1）中以无任何虫害的烟草样品作为阴性对照。
4.根据权利要求2所述的基于DNA条形码的烟草虫害检测方法，其特征在于：步骤（4）中，PCR反应体系如下（以50 μL反应体系为例）：
PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共运行35个循环；最后72℃延伸10 min；4℃保存。
5.根据权利要求2所述的基于DNA条形码的烟草虫害检测方法，其特征在于：在步骤（5）中，如果PCR扩增出700 bp左右的特异性条带，将该目的条带胶回收，与T载体连接，转化感受态细胞，随机挑取10个单克隆进行测序。
6.根据权利要求2所述的基于DNA条形码的烟草虫害检测方法，其特征在于：步骤（6）中，将测序结果在NCBI网站上进行Blast比对，如果与数据库中某个虫子的CO1条形码基因序列的相似度在95%以上，则表明待测的烟草样品中含有虫子，同时还可以确定虫子是哪个物种。
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