CN102586470B

CN102586470B - 玉米弯孢叶斑病菌pcr检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN102586470B
Application number: CN 201210108438
Authority: CN
Inventors: 刘铜; 侯巨梅; 左豫虎; 慕庆峰; 马柄辰
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Guizhou Yi hundred billion Biological Technology Co., Ltd.
Priority date: 2012-04-14
Filing date: 2012-04-14
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2032-04-14
Also published as: CN102586470A

Abstract

本发明涉及的是玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒及检测方法，这种玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒包含2套PCR反应体系，第一套反应体系包括由二条特异性引物SEQIDNO:1和SEQIDNO:3组成的第一对引物对，第二套反应体系包括由二条特异引物SEQIDNO:2和SEQIDNO:3组成的第二对引物对。本发明根据玉米弯孢叶斑病菌clg2p基因设计特异扩增引物，并构建玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒，应用于玉米弯孢叶斑病菌的分子检测，可准确、快速对玉米弯孢叶斑病原菌的分子鉴定，也可以用于叶斑型和坏死型等症状的玉米病苗是否由玉米弯孢叶斑病菌侵染所致，将在玉米弯孢叶斑病菌病原的鉴定和病害的田间监测中具有重大的应用前景。

Description

玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒及检测方法

一、技术领域：

本发明涉及的是生物技术领域中真菌病害检测技术，具体涉及的是玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒及检测方法。

二、背景技术：

玉米弯孢菌叶斑病是由玉米弯孢菌(Curvularia lunata (Wakker) Boed)引起的，在世界的大部分国家造成过重大危害。1996年，该病在中国造成严重的玉米损失，40％玉米产区被该病侵染。该病原主要危害玉米叶片，也可危害叶鞘和苞叶。病斑初为水浸状或淡黄色半透明小点，之后扩大为圆形、椭圆形、梭形或长条形病斑，病斑形状和大小因品种抗性分为3类：①抗病型病斑（R）：病斑小，1~2mm，圆形、椭圆形或不规则形，中央苍白色或淡褐色，边缘无褐色环带或环带很细，最外围具狭细的半透明晕圈；②中间型病斑（M）：病斑小，1~2mm，圆形、椭圆形、长条形或不规则形，中央苍白色或淡褐色，边缘有较明显的褐色环带，最外围具明显的褪绿晕圈；③感病型病斑（S）：病斑较大，长2~5mm，宽1~2mm，圆形、椭圆形、长条形或不规则形，中央苍白色或黄褐色有较宽的褐色环带，最外围具较宽的半透明黄色晕圈，有时多个斑点可沿叶脉纵向汇合而形成大斑，最大的可达10mm，甚至整叶枯死。潮湿条件下，病斑正反两面均可产生灰黑色霉状物，即病原菌的分生孢子梗和分生孢子。分生孢子梗单生或数根丛生，暗褐色，不分枝，有隔，顶部多呈屈膝状，大小70~270μm×2~4μm，顶端和侧面着生分生孢子。分生孢子淡褐色、灰褐色，棍棒形或椭圆形，少数呈“Y”型，向一端弯曲，多数分生孢子为3个隔膜4个细胞结构，中间两个细胞膨大，暗褐色，从基部向上数第三个细胞最大，两端细胞较小，大小为19~30μm×8~19μm，淡褐色，呈新月型。

目前在鉴定玉米弯孢叶斑病菌和由该病原所引起的病害主要是通过病原的分生孢子，分生孢子梗和在寄主上产生的病斑类型。上述的鉴定方法费时、费事，并且鉴定准确性不高。

三、发明内容：

本发明的一个目的是提供玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒用于解决现有的对玉米弯孢叶斑病菌检测和鉴定方法耗时长、不能及时监测和控制病原菌的传播的问题；本发明的另一个目的是提供玉米弯孢叶斑病菌PCR检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：这种玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒包含2套PCR反应体系，第一套反应体系包括由二条特异性引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3组成的第一对引物对，第二套反应体系包括由二条特异引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的第二对引物对，二对引物对引物序列和组合方式如下：

第一对：上游引物5`-ACGGAGGATGCGGTATGG-3` （SEQ ID NO:1）

下游引物5`-CCTCGGAATCGTGCTTTT-3` （SEQ ID NO:3）

第二对：上游引物5`-GGGGCTCGCAGGCTAATGT-3` （SEQ ID NO:2）

下游引物5`-CCTCGGAATCGTGCTTTT-3` （SEQ ID NO:3）

上述方案中每套反应体系还包含PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP和 Taq酶。

上述方案中第一套反应体系由以下组分组成：以1ml溶液计，100µl 10×PCR 反应缓冲液， 20 µl 浓度为10mM 的dNTP， 200单位Taq酶，浓度为10mM 10mM的第一对上、下游引物各40 µl ，余量为超纯水。

上述方案中第二套反应体系由以下组分组成：以1ml溶液计，100µl 10×PCR 反应缓冲液， 20 µl 浓度为10mM 的dNTP， 200单位Taq酶，浓度为10mM 10mM的第二对上、下游引物各40 µl ，余量为超纯水。

上述方案中检测试剂盒还包括有说明书。

一种上述玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒PCR的检测方法，

一、用PCR检测试剂盒中第一套PCR反应体系, 对样品进行第一次PCR扩增，获得PCR扩增产物；

二、取测定步骤一获得的PCR扩增扩物用无菌水按1：50稀释，然后取1微升稀释产物作为扩增模板，以上述的PCR检测试剂盒中的第二套PCR反应体系，对所述样品进行第二次PCR扩增，获得PCR扩增产物；若产物中存在827bp 的DNA片段，则表明所述样品中有玉米弯孢叶斑病菌。

上述方案中样品是病原菌的分子孢子和病原菌菌丝的DNA提取物。

上述方案中样品是玉米叶片组织的DNA提取物。

一种玉米弯孢叶斑病菌PCR检测方法，该检测方法包括使用二对特异性引物对，其中第一对引物对由二条特异性引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3组成，其中第一对引物对由二条特异性引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成，其引物序列和组合方式如下：

第一对：上游引物5`-ACGGAGGATGCGGTATGG-3` （SEQ ID NO:1）

下游引物5`-CCTCGGAATCGTGCTTTT-3` （SEQ ID NO:3）

第二对：上游引物5`-GGGGCTCGCAGGCTAATGT-3` （SEQ ID NO:2）

下游引物5`-CCTCGGAATCGTGCTTTT-3` （SEQ ID NO:3）

有益效果：

1、本发明根据玉米弯孢叶斑病菌clg2p基因设计特异扩增引物，并构建玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒，应用于玉米弯孢叶斑病菌的分子检测。本试剂盒可准确、快速对玉米弯孢叶斑病原菌的分子鉴定，也可以用于叶斑型和坏死型等症状的玉米病苗是否由玉米弯孢叶斑病菌侵染所致，将在玉米弯孢叶斑病菌病原的鉴定和病害的田间监测中具有重大的应用前景。

2、准确性高

本发明根据玉米弯孢叶斑病菌clg2p 的特异位点设计引物，能够有效扩增该基因的特异片段，通过对弯孢属的其它种和相关的其它真菌、植物体和细菌菌株的DNA的扩增，结果发现本发明只有玉米弯孢叶斑病菌中才能扩增到片段，其检测方法准确率100%。

3、灵敏度高

传统的玉米弯孢叶斑病是通过病原产生的分生孢子，分生孢子梗和病害在寄主上产生的病斑类型进行鉴定，需要通过病原的分离、纯化和复杂的接种试验。在其过程需要病原物产生足够多的菌丝和分生孢子才能鉴定出来。本发明提供的检测试剂盒及检测方法能检测到10fg/µl的DNA, 可以说其灵敏度相当高。

4、实用强

玉米是世界重要的粮食作物，当前玉米弯孢叶斑病是一种世界性病害，在泰国、意大利、南斯拉夫、罗马尼亚、土耳其、墨西哥、匈牙利、澳大利亚、巴西和美国等国均有分布，给玉米产量带来了极大的损失。玉米弯孢叶斑病菌的快速检测将对病菌的田间监测和病害流行预测预报提供重要的依据，将具有重要的实际应用价值。

四、附图说明：

图1 显示了本发明实施例1中对玉米弯孢叶斑病菌的检测结果，图中泳道M为标准分子量大小，泳道1－8为玉米弯孢叶斑病菌菌丝体；泳道9－15其它病原菌。

图2显示了在本发明中对玉米弯孢叶斑病菌检测的敏感性结果，图中泳道M为标准分子量大小，泳道1–8的基因组浓度分别为100 ng/µl, 10 ng/µl,1 ng/µl, 100 pg/µl, 10 pg/µl, 1 pg/µl, 100 fg/µl, and10 fg/µl，泳道9为阴性对照。

五、具体实施方式：

这种玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒包含2套PCR反应体系及说明书，第一套反应体系由以下组分组成：以1ml溶液计，100µl 10×PCR 反应缓冲液， 20 µl 浓度为10mM 的dNTP， 200单位Taq酶，浓度为10mM 10mM的第一对上、下游引物各40 µl ，余量为超纯水；第二套反应体系由以下组分组成：以1ml溶液计，100µl 10×PCR 反应缓冲液， 20 µl 浓度为10mM 的dNTP， 200单位Taq酶，浓度为10mM 10mM的第二对上、下游引物各40 µl ，余量为超纯水。

其中第一对引物对的引物序列和组合方式如下：

第一对：上游引物5`-ACGGAGGATGCGGTATGG-3` （SEQ ID NO:1）

下游引物5`-CCTCGGAATCGTGCTTTT-3` （SEQ ID NO:3）

其中第二对引物对的引物序列和组合方式如下：

第二对：上游引物5`-GGGGCTCGCAGGCTAATGT-3` （SEQ ID NO:2）

下游引物5`-CCTCGGAATCGTGCTTTT-3` （SEQ ID NO:3）

上述玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒PCR的检测方法，

一、用PCR检测试剂盒中第一套PCR反应体系, 对样品进行第一次PCR扩增，获得PCR扩增产物；样品可采用病原菌的分子孢子和病原菌菌丝的DNA提取物或者玉米叶片组织的DNA提取物。DNA提取物可用市售的DNA提取试剂盒或其他常规的DNA提取方法获得；

本发明的玉米弯孢叶斑病菌(Curvularia lunata (Wakker) Boed) 检测试剂盒属于农作物防病治病和植物检疫范畴。根据玉米弯孢叶斑病菌clg2p 的特异位点设计三条特异引物：5`-ACGGAGGATGCGGTATGG-3` （SEQ ID NO: 1），5`-GGGGCTCGCAGGCTAATGT-3` （SEQ ID NO: 2），5`-CCTCGGAATCGTGCTTTT-3` （SEQ ID NO: 3）。利用上述三条引物组成两对引物对构成两套PCR检测反应体系。

在上述检测方法中，首先在PCR检测试剂盒所附说明书的条件或是由本领域技术人员根据常规实验确定的条件下，用本发明所述的三条特异性引物构成的二对引物对依次对样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。然后，用常规方法，如凝胶电泳（如琼脂糖凝胶电泳）测定步骤2获得的PCR扩增产物的大小。如果可以的话，还可以采用更为精确的测定方法，如对产物进行测序等。如果显示上述扩增出了具有预计827bp长度的条带，则表明所述样品中有玉米弯孢叶斑病菌。

下面结合具体实施例子，进一步阐述本发明。这些实验例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook«分子克隆实验指南»第2版（1989）；«DNA克隆» 第Ⅰ和Ⅱ卷（D.N. Glover编辑1985）。或者可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例 1 、检测玉米弯孢叶斑病菌菌丝

1)检测试剂盒

设计如下所示的玉米弯孢叶斑病菌的三条特异性引物组成二对引物对：

第一对：上游引物5`-ACGGAGGATGCGGTATGG-3` （SEQ ID NO: 1）

下游引物 5`-CCTCGGAATCGTGCTTTT-3` （SEQ ID NO: 3）

第二对：上游引物5`-GGGGCTCGCAGGCTAATGT-3` （SEQ ID NO: 2）

下游引物5`-CCTCGGAATCGTGCTTTT-3` （SEQ ID NO: 3）

用DNA合成仪合成上述序列。

配制试剂盒2套PCR反应体系：第一套反应体系由以下组分组成：以1ml溶液计，100µl 10×PCR 反应缓冲液， 20 µl 浓度为10mM 的dNTP， 200单位Taq酶，浓度为10mM 10mM的第一对上、下游引物各40 µl ，余量为超纯水；第二套反应体系由以下组分组成：以1ml溶液计，100µl 10×PCR 反应缓冲液， 20 µl 浓度为10mM 的dNTP， 200单位Taq酶，浓度为10mM 10mM的第二对上、下游引物各40 µl ，余量为超纯水。

2)检测方法

一、从玉米弯孢叶斑病菌菌丝中提取DNA:

将用蒸馏水冲洗干净的新鲜菌丝，用吸水纸吸干水后；将菌丝用液氮研磨后迅速转入1.5mL的离心管内；加入预热30min（温度65℃）的CTAB提取液600μL，65℃水浴30 min，每隔10 min摇匀一次，然后向离心管内加入500μL酚：氯仿：异戊醇（三者之间比例为25：24：1），轻抽10min， 4℃，12000rpm离心10min; 取上清，加入500μL提前预冷的异丙醇，充分混匀冰浴中沉淀30min；4℃，8000rpm离心10min，弃上清，待沉淀风干后，向沉淀中加入水，待沉淀溶解后取1µl直接用于PCR反应。

二、PCR检测

取1µl 溶解液，加入第一套反应体系24µl ，得到溶液总体积为25µl。进行PCR扩增程序为：95°C变性5min，进入循环，94°C 变性20S，55°C 退火30S，72°C延伸 1 min ，共30个循环。最后72°C 延伸10 min; 获得的PCR扩增扩物用无菌水按1：50稀释，然后取1微升稀释产物作为扩增模板，加入第一套反应体系24µl，得到溶液总体积为25µl。进行PCR扩增程序为：95°C变性5min，进入循环，94°C 变性20S，55°C 退火30S，72°C延伸 1 min ，共30个循环。最后72°C 延伸10 min。

扩增反应的电泳检测：取8µl 第二次扩增后的溶液，在1.0的琼脂糖凝胶于1×TAE中电泳，电压5V/cm，电泳30分钟后在紫外灯下观察检测结果。结果显示827bp有一条谱带（如图1所示），其它病原菌没有条带。

实施例 2 、检测玉米叶斑型叶片中的弯孢叶斑病菌

1）检测试剂盒：采用与实施例1一样的反应体系。

2）检测方法：

一、从产叶斑的玉米叶片中提取病原DNA:

将发病玉米叶片用蒸馏水冲洗干净，用吸水纸吸干水后；将叶片用液氮研磨后迅速转入1.5mL的离心管内；加入预热30min（65℃）的CTAB提取液600μL，65℃水浴30 min，每隔10 min摇匀一次，然后向离心管内加入500μL氯仿：异戊醇（24：1），轻抽10min， 4℃，12000rpm离心10min; 取上清，然后再加与上清液体积相同的氯仿：异戊醇（24：1），轻抽10min，4℃，12000rpm离心10min; 取上清；上清液加入2/3体积的提前预冷的异丙醇，充分混匀冰浴中沉淀30min；4℃，8000rpm离心10min，弃上清，待沉淀风干后，向沉淀中加入水，待沉淀溶解后取1µl直接用于PCR反应。

二、PCR检测采用与实施例1一样的方法。

实施例 3 、检测玉米坏死型叶片中的弯孢叶斑病菌

1）检测试剂盒：采用与实施例1一样的反应体系。

2）检测方法：

一、从玉米坏死型叶片中提取病原DNA:

将坏死型玉米叶片用蒸馏水冲洗干净，用吸水纸吸干水后；将叶片用液氮研磨后迅速转入1.5mL的离心管内；加入预热30min（65℃）的CTAB提取液600μL，65℃水浴30 min，每隔10 min摇匀一次，然后向离心管内加入500μL氯仿：异戊醇（24：1），轻抽10min， 4℃，12000rpm离心10min; 取上清，然后再加与上清液体积相同的氯仿：异戊醇（24：1），轻抽10min，4℃，12000rpm离心10min; 取上清；上清液加入2/3体积的提前预冷的90%乙醇，充分混匀冰浴中沉淀30min；4℃，8000rpm离心10min，弃上清，待沉淀风干后，向沉淀中加入水，待沉淀溶解后取1µl直接用于PCR反应。

二、PCR检测采用与实施例1一样的方法。

图2显示了在本发明中对玉米弯孢叶斑病菌检测的敏感性结果。

本发明的引物可用任何已知的方法产生，例如Matteucci等人[J. Am. Chem. Soc.(1981)103:3185]的三酯合成方法或Urdea等人[Proc.Natl. Acad. Sci. USA(1983)80:7461]的方法，或用市售的自动寡核酸合成仪合成。另外，还可以根据偏好选择引物的化学特征。对于某些应用，DNA或RNA是合适的。对于其它的应用，还可以加入修饰，例如骨架修饰，如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯，改变RNA亲和力，增加核酶抗性等[例如参见Agrawal和Iyer(1995) Curr Opin Biotechnol 6:12-19; Agrawal (1996) TIBTECH 14:376-387]；还可采用类似物如肽核酸[例如参见Corey (1997) TIBTECH 15: 224-229; Buchardt等人（1993）TIBTECH 11: 384-386]。

本发明中所用的术语“PCR”或“聚合酶链反应”指一种过程或技术（如美国专利No.4,683,195(1987年7月28日授权）中所述的那样。通常，需要获得感兴趣区域两端或其外延的序列信息，从而可以设计寡核苷酸引物；这些引物应与待扩增模板相反链的序列相同或相似。两个引物的5`端核苷酸可以与扩增材料的两端恰好重合。PCR技术可用来扩增全部基因组DNA中的、从全细胞RNA、噬菌体或质粒序列等转录获得的cDNA中的特定RNA序列、特定DNA序列。见Mullis等，Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263(1987); Erlich 编辑，PCR Technology (Stockton Press, NY, 1989)。

聚合酶链反应技术是本领域技术人员熟知的一种检测少量靶核酸的手段。类似试验在Mullis 等人[Meth. Enzymol. (1987) 155: 335-350]; 美国专利4，683，195和4，683，202中有所描述。用两个引物核苷酸与靶核酸杂交，并用为引导反应。引物可包含不与扩增靶序列（或其互补序列）杂交的序列，以帮助双链体的稳定性，或例如可插入一个简便的限制性位点。为了检测出靶核酸的存在，特异性引物的选择是至关重要的。

本领域技术人员能够根据熟知的技术合适的选择本发明试剂盒中的PCR反应体系。在本发明的一个较佳实施方案中，所述反应体系还可包含PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP和Taq酶等。PCR 缓冲液可以由本领域技术人员根据公知技术来确定，例如可以是100mM Tris HCl(pH8.3); 500 Mm KCl; 1.0% Triton X-100。在一个更佳的实施方案中，所述每套反应体系由以下组分组成：以1ml溶液计，100µl 10×PCR 反应缓冲液， 20 µl 浓度为10mM 的dNTP， 200单位Taq酶，每对特异性引物对上、下游引物各40 µl ，余量为超纯水。

序列表1

<110> 黑龙江八一农垦大学

<120> 玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒及检测方法

<160> 3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ACGGAGGATG CGGTATGG 18

序列表2

<110> 黑龙江八一农垦大学

<120> 玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒及检测方法

<160> 3

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

GGGGCTCGCA GGCTAATGT 19

序列表3

<110> 黑龙江八一农垦大学

<120> 玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒及检测方法

<160> 3

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

CCTCGGAATC GTGCTTTT 18

Claims

1.一种玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒，其特征在于：所述玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒包含2套PCR反应体系，第一套反应体系包括由二条特异性引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3组成的第一对引物对，第二套反应体系包括由二条特异引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的第二对引物对，二对引物对引物序列和组合方式如下：

第一对：上游引物5`-ACGGAGGATGCGGTATGG-3` （SEQ ID NO:1）

下游引物5`-CCTCGGAATCGTGCTTTT-3` （SEQ ID NO:3）

第二对：上游引物5`-GGGGCTCGCAGGCTAATGT-3` （SEQ ID NO:2）

下游引物5`-CCTCGGAATCGTGCTTTT-3` （SEQ ID NO:3）；

第一套反应体系由以下组分组成：以1ml溶液计，100µl 10×PCR 反应缓冲液， 20 µl 浓度为10mM 的dNTP， 200单位Taq酶，浓度均为10mM 的第一对上、下游引物各40 µl ，余量为超纯水；

第二套反应体系由以下组分组成：以1ml溶液计，100µl 10×PCR 反应缓冲液， 20 µl 浓度为10mM 的dNTP， 200单位Taq酶，浓度均为10mM 的第二对上、下游引物各40 µl ，余量为超纯水。

2.根据权利要求1所述的玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒还包括有说明书。

3.一种权利要求1或2所述的玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于：该方法包括以下步骤，

一、用所述玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒中第一套PCR反应体系, 对样品进行第一次PCR扩增，获得PCR扩增产物；所述的样品是病原菌的分子孢子和病原菌菌丝的DNA提取物，或所述的样品是玉米叶片组织的DNA提取物；

二、取测定步骤一获得的PCR扩增产物用无菌水按1：50稀释，然后取1微升稀释产物作为扩增模板，以所述玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒中的第二套PCR反应体系，对所述样品进行第二次PCR扩增，获得PCR扩增产物；若产物中存在827bp 的DNA片段，则表明所述样品中有玉米弯孢叶斑病菌。