CN105567827A - 一种同时检测异育银鲫多种寄生粘孢子虫的pcr方法 - Google Patents

一种同时检测异育银鲫多种寄生粘孢子虫的pcr方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种非疾病诊断目的同时检测异育银鲫多种寄生粘孢子虫的PCR方法。针对四种粘孢子虫的18S？rRNA、ITS1-5.8S-ITS2及28S？rRNA基因，经过比对、分析与筛选，最终得到四对特异性引物；然后将四对引物放在一个PCR反应体系中，优化反应的退火温度、反应试剂及引物之间的平衡浓度，建立直接从样品中一次检测四种粘孢子虫的PCR方法。该方法既可以早期阶段检测粘孢子虫，还可以对粘孢子虫混合感染情况进行分析，具有较高的特异性与灵敏性，操作简便，快速准确。

Description

一种同时检测异育银鲫多种寄生粘孢子虫的PCR方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种非疾病诊断目的同时检测异育银鲫多种寄生粘孢子虫的PCR方法。
背景技术
粘孢子虫(Myxosporeans)是一类世界分布的后生动物寄生虫，属于粘体动物门，除少数种类寄生于两栖类、爬行类、鸟类，甚至哺乳类外，大部分寄生于鱼类，其中部分种类能导致养殖鱼类重大病害的发生，造成严重的经济损失与生态污染。异育银鲫是我国重要的淡水经济养殖鱼类，近年来，随着新品系的成功培育及养殖技术的推广，其养殖规模不断扩大，但随之而来的病害也日趋严重，病害问题已成为制约异育银鲫产业健康发展的瓶颈因素。
洪湖碘泡虫、武汉单极虫、吴李碘泡虫、丑陋圆形碘泡虫是危害异育银鲫养殖最为严重的粘孢子虫。洪湖碘泡虫(Myxobolushonhuensis)是异育银鲫“喉孢子虫病”病原体，主要危害异育银鲫的苗种培育，其靶组织为鱼体咽部，病害爆发后在咽部形成肉眼可见的孢囊，鱼体主要症状为不食、游动迟缓、咽部肿胀、鳃盖外翻、眼球外凸、出血等，每年5-10月为流行季节，5-7月为病害高发期，感染率可达60％，最高死亡率可达100％；武汉单极虫(Thelohanelluswuhanensis)是异育银鲫“肤孢子虫病”病原体，主要危害异育银鲫的苗种培育，能与洪湖碘泡虫同期感染，其靶组织为鱼体体表，在体表形成肉眼可见的小孢囊，使鱼体消瘦，畸形，生长缓慢，甚至大规模死亡，对苗种培育造成巨大的经济损失；吴李碘泡虫(M.wulii)是“腹孢子虫病”病原体，主要寄生于鱼体的肝胰脏，形成肉眼可见的大孢囊，患病鱼表现为腹部膨大，内脏萎缩，肝胰脏组织结构被严重破坏，甚至被孢囊完全代替，最终导致鱼体的死亡；丑陋圆形碘泡虫(M.turpisrotundus)主要寄生于异育银鲫的鳃盖、鳃弓、口腔内外、鳍条等多个器官组织内，形成大小不一的肉眼可见孢囊，患病鱼死亡率不高，但严重影响商品鱼的经济价值。
粘孢子虫具有复杂的生活史，研究表明粘孢子虫在鱼体中的发育一般要经过营养体和成熟孢子(孢囊)阶段。在我国，粘孢子虫病的检测主要以显微镜下可见成熟孢子、肉眼可见孢囊为依据，而一旦粘孢子虫在鱼体内形成成熟的孢子或孢囊，没有任何有效药物能够渗入成熟孢子坚硬的几丁质外壳。因此，有必要建立一种简单快速的早期检测方法，在粘孢子虫的营养体阶段进行药物防治，有效地防控粘孢子虫病的病害。
在粘孢子虫的检测方面，以显微镜观察成熟孢子为基础的形态学检测方法，虽然操作简便，但存在检测滞后、费时费力、效率低、易于漏检等问题；以抗原与抗体反应为基础的免疫学检测方法，虽然具有灵敏性高、能进行早期检测的特点，但由于粘孢子虫生活史中存在期、属特异性抗原以及共同抗原，交叉反应严重，增加了种特异性检测的难度；以PCR技术为基础的分子生物学检测方法具有较高的特异性与灵敏性，已经被广泛运用于寄生虫的早期检测中。
多重PCR(multiplexPCR)是在普通PCR基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术，可用于同时检测多种病原体。该方法不仅能早期检测，灵敏性高，特异性强，而且同普通PCR方法相比具有省时省力、简单快速等优点。目前，国内外尚无同时对异育银鲫寄生的多种粘孢子虫进行早期检测的报道。
发明内容
鉴于异育银鲫寄生粘孢子虫早期检测方法的缺乏，本发明提供一种同时检测四种寄生于异育银鲫的粘孢子虫的PCR方法，该方法灵敏性高，特异性强，操作简单，有利于异育银鲫的养殖，能够产生显著的经济效益。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种非疾病诊断目的同时检测异育银鲫多种寄生粘孢子虫的PCR方法，包括以下步骤：
(1)DNA提取：剪取异育银鲫皮肤、鳃、咽及肝胰脏四个部位的部分组织，混合后置于研钵中，剪碎并加入液氮充分研磨，然后提取组织样品DNA；
(1)特异性DNA片段扩增：分别以丑陋圆形碘泡虫的18SrRNA、吴李碘泡虫与洪湖碘泡虫的ITS1-5.8S-ITS2、武汉单极虫的28SrRNA基因为分子靶标，各设计一对特异性引物，分别命名为Mt18SF/R、MwITSF/R、MhITSF/R、Tw28SF/R；将四对引物置于单个PCR反应体系中，同时扩增四种粘孢子虫的特异性基因片段；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测，根据PCR扩增产物的片段大小进行结果判定，其中：扩增出894bp条带的是丑陋圆形碘泡虫，590bp的是吴李碘泡虫，447bp的是洪湖碘泡虫，245bp的是武汉单极虫，
所述的四对特异性引物序列分别为：
Mt18SF：5’-ACCAGATATTTCGAGGAGTCGTTG-3’
Mt18SR：5’-TTCCACAACGTTGCTATATAGCCA-3’
MwITSF：5’-GCCGTACATGAATTGAGGCTTGAC-3’
MwITSR：5’-TGCTCACAACGTTAACTCGAACC-3’
MhITSF：5’-ACGACCAATATATGAAATTGTTTCTCGA-3’
MhITSR：5’-TTCATTCGTAAAAATGACCTCTACTTTATAC-3’
Tw28SF：5’-TTTGTAAAATTCTTAACGCTGGCTAA-3’
Tw28SR：5’-TCGAAACGCCAAAACTACGTCA-3’。
优选地，步骤(2)中的PCR反应体系为：
DNA扩增模板2μL、10×PCRBuffer2.5μL、25mMMg2+3.0μL、2.5mMdNTPs4μL、5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μL，Mt18SF/R各0.8μL、MwITSF/R各0.4μL、MhITSF/R各0.6μL、Tw28SF/R各0.4μL，灭菌ddH2O补足至25μL。
优选地，步骤(2)中的PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸70s，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
本发明的有益效果在于：
本发明以粘孢子虫的18SrRNA、ITS1-5.8S-ITS2及28SrRNA基因为分子靶标，具有较高的特异性与灵敏性，三种分子靶标各具特点，其中18SrRNA基因序列长度适中、信息充足，运用最为广泛；28SrRNA基因片段长，包含相对较多的变量，适合用于不同阶元的分析研究；ITS属于非编码序列，中间被5.8SrRNA基因分开，进化速度快，具有可变性，尤其适用于同属近缘物种的区别和鉴定。
本发明方法特异性强，灵敏性高，可以检测粘孢子虫的早期阶段；同时，与普通PCR检测方法相比，能够在单个PCR管中进行一次反应检测丑陋圆形碘泡虫、吴李碘泡虫、洪湖碘泡虫与武汉单极虫，省时省力，具有较大的经济效益。
附图说明
图1：四对引物平衡浓度的实验结果。图中的电泳带分别为：M：MarkerDL2000；1-12分别代表反应体系中四对引物的添加浓度：1：0.8、0.8、0.4、0.4μL；2：0.8、0.4、0.6、0.4μL；3：0.8、0.4、0.4、0.6μL；4：0.6、0.8、0.4、0.4μL；5：0.4、0.8、0.6、0.4μL；6：0.4、0.8、0.4、0.6μL；7：0.6、0.4、0.8、0.4μL；8：0.4、0.6、0.8、0.4μL；9：0.4、0.4、0.8、0.6μL；10：0.6、0.4、0.4、0.8μL；11：0.4、0.6、0.4、0.8μL；12：0.4、0.4、0.6、0.8μL(各引物工作浓度均为10μM；每组从左至右分别为：Mt18SF/R、MwITSF/R、MhITSF/R、Tw28SF/R)；1-12均以四种粘孢子虫混合DNA为模板。
图2：Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶平衡浓度的实验结果。图中的电泳带分别为：M：MarkerDL2000；1：2.0、2.0、0.2μL；2：3.0、2.0、0.3μL；3：4.0、2.0、0.4μL；4：2.0、3.0、0.3μL；5：3.0、3.0、0.4μL；6：4.0、3.0、0.2μL；7：2.0、4.0、0.4μL；8：3.0、4.0、0.2μL；9：4.0、4.0、0.3μL(每组从左至右分别是Mg2+(25mM)、dNTPs(2.5mM)、TaqDNA聚合酶(5U/μL))；1-9均以四种粘孢子虫混合DNA为模板。
图3：不同反应退火温度的实验结果。图中的电泳带分别为：M：MarkerDL2000；1-6分别代表反应退火温度为55、56、57、58、59、60℃；7：空白对照。
图4：四重PCR特异性实验结果。a：丑陋圆形碘泡虫；b：吴李碘泡虫；c：洪湖碘泡虫；d：武汉单极虫。图中的电泳带分别为：M：MarkerDL2000；1：a，b，c，d；2：a，b，c；3：a，b，d；4：b，c，d；5：a，b；6：a，c；7：a，d；8：b，c；9：b，d；10：c，d混合DNA；11：a；12：b；13：c；14：d；15-19分别为：倪李碘泡虫、龟壳单极虫、吉陶单极虫、山东碘泡虫、野鲤碘泡虫DNA；20：健康异育银鲫DNA；21：空白对照。
图5：四重PCR灵敏性实验结果。图中的电泳带分别为：M：MarkerDL2000；1-7：分别为1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6ng/μL四种粘孢子虫混合DNA；8：空白对照。
图6：四重PCR鉴定实际样品实验结果。图中的电泳带分别为：M：MarkerDL2000；1-10分别为10尾异育银鲫组织样品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实验材料：洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫、丑陋圆形碘泡虫、武汉单极虫、龟壳单极虫、倪李碘泡虫、吉陶单极虫、山东碘泡虫、野鲤碘泡虫及异育银鲫组织样品由本实验室自行采集与保存。
主要试剂：动物组织基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，MarkerDL2000、6×LoadingBuffer、10×PCRBuffer、dNTPMixture、TaqDNA聚合酶等均购自TaKaRa公司，引物由武汉奥科鼎盛生物科技有限公司合成。
实施例1四重PCR方法的建立
1.引物的筛选
针对四种目的粘孢子虫的18SrRNA、ITS1-5.8S-ITS2、28SrRNA三个基因的碱基序列(如序列表SEQIDNO：9/10/11/12所示)，分别进行同源性比较与筛选，最终得到四对特异性引物，且每对引物扩增的特异性片段长度不同，易于区分。引物具体信息如下：
2.四重PCR反应体系的确定
以四种目的粘孢子虫的混合DNA为模板，优化四对引物的反应浓度(图1)，反应试剂Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶之间的平衡浓度(图2)，以及反应退火温度(图3)，最终确立扩增反应为：
PCR反应体系(25μL)：DNA模板2μL、10×PCRBuffer2.5μL、Mg2+(25mM)3.0μL、dNTPs(2.5mM)4μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，引物对：Mt18SF/R各0.8μL、MwITSF/R各0.4μL、MhITSF/R各0.6μL、Tw28SF/R各0.4μL，灭菌ddH2O补足至25μL。
PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸70s，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
取5μL的PCR扩增产物，进行凝胶电泳，根据目的条带大小的不同判定结果：电泳扩增出894bp条带的是丑陋圆形碘泡虫，590bp的是吴李碘泡虫，447bp的是洪湖碘泡虫，245bp的是武汉单极虫。将阳性条带切胶回收后送测序，扩增条带与目的基因序列一致。
实施例2四重PCR方法的评价
1.四重PCR方法的特异性检测
以实验室保存的四种目的粘孢子虫的DNA作为阳性模板，用四对特异性引物同时对其进行PCR扩增，检验各引物对靶基因扩增的特异性及相互之间有无干扰作用；同时以本实验室保存的龟壳单极虫、倪李碘泡虫、吉陶单极虫、山东碘泡虫、野鲤碘泡虫及健康异育银鲫DNA模板为阴性对照，结果如图4所示。
结果显示：四对引物依次能扩增出894、590、447、245bp大小的目的条带，对靶基因的扩增特异性良好，无非特异性条带产生，且各引物之间互不干扰，而其他5种对照粘孢子虫及健康鲫鱼DNA模板没有扩增出任何条带。结果表明本发明筛选的特异性引物可以特异性地扩增出四种寄生于异育银鲫的粘孢子虫DNA。
2.四重PCR方法的灵敏性检测
分别将四种粘孢子虫DNA经10倍倍比稀释，各得到7个不同浓度的DNA(1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6ng/μL)，再分别将稀释后相同浓度的DNA进行混合，以混合DNA作为模板，用上述优化后的PCR体系及反应对其进行扩增，以灭菌ddH2O为模板作为空白对照，结果如图5所示。
结果显示：Mt18SF/R(丑陋圆形碘泡虫)、MwITSF/R(吴李碘泡虫)、MhITSF/R(洪湖碘泡虫)均可检测到10-3ng(1pg)虫体DNA，Tw28SF/R可检测到10-5ng(0.01pg)武汉单极虫虫体DNA。
实施例3四重PCR方法的应用
利用建立的四重PCR方法，对2015年7月采自湖北省武汉市东西湖区养殖池塘的10尾异育银鲫(体长3.0-5.7cm)进行粘孢子虫的检测与种类鉴定。
1.组织样品DNA的提取：
分别剪取鱼体皮肤、鳃、咽及肝胰脏四个部位的部分组织，共约50mg，混合在一起，置于研钵中，剪碎并加入液氮充分研磨，然后采用动物组织基因组DNA提取试剂盒(商业途径购买)提取样品的总DNA。
2.DNA片段的扩增：
按照上述优化后的反应体系与条件，对提取的样品总DNA进行PCR扩增。
3.结果判定：
取5μL的PCR扩增产物，进行凝胶电泳，根据目的条带大小的不同判定结果：电泳扩增出894bp条带的是丑陋圆形碘泡虫，590bp的是吴李碘泡虫，447bp的是洪湖碘泡虫，245bp的是武汉单极虫。
结果显示(图6)：894bp条带大体相同的位置出现了2条特异性条带(泳道4，6)，均为丑陋圆形碘泡虫；594bp条带大体相同的位置出现了3条特异性条带(泳道4，9，10)，均为吴李碘泡虫；447bp条带大体相同的位置出现了6条特异性条带(泳道2，4，5，7，8，10)，均为洪湖碘泡虫；245bp条带大体相同的位置出现了2条特异性条带(泳道4，10)，均为武汉单极虫。

Claims (4)

1.一种非疾病诊断目的同时检测异育银鲫多种寄生粘孢子虫的PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)DNA提取：剪取异育银鲫皮肤、鳃、咽及肝胰脏四个部位的部分组织，混合后置于研钵中，剪碎并加入液氮充分研磨，然后提取组织样品DNA；
(2)特异性DNA片段扩增：分别以丑陋圆形碘泡虫的18SrRNA、吴李碘泡虫与洪湖碘泡虫的ITS1-5.8S-ITS2、武汉单极虫的28SrRNA基因为分子靶标，各设计一对特异性引物，分别命名为Mt18SF/R、MwITSF/R、MhITSF/R、Tw28SF/R；将四对引物置于单个PCR反应体系中，同时扩增四种粘孢子虫的特异性基因片段；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测，根据PCR扩增产物的片段大小进行结果判定，其中：扩增出894bp条带的是丑陋圆形碘泡虫，590bp的是吴李碘泡虫，447bp的是洪湖碘泡虫，245bp的是武汉单极虫，
所述的四对特异性引物序列分别为：
Mt18SF：5’-ACCAGATATTTCGAGGAGTCGTTG-3’
Mt18SR：5’-TTCCACAACGTTGCTATATAGCCA-3’
MwITSF：5’-GCCGTACATGAATTGAGGCTTGAC-3’
MwITSR：5’-TGCTCACAACGTTAACTCGAACC-3’
MhITSF：5’-ACGACCAATATATGAAATTGTTTCTCGA-3’
MhITSR：5’-TTCATTCGTAAAAATGACCTCTACTTTATAC-3’
Tw28SF：5’-TTTGTAAAATTCTTAACGCTGGCTAA-3’
Tw28SR：5’-TCGAAACGCCAAAACTACGTCA-3’。
2.根据权利要求1所述的PCR方法，其特征在于：步骤(2)中的PCR反应体系为：
DNA扩增模板2μL、10×PCRBuffer2.5μL、25mMMg2+3.0μL、2.5mMdNTPs4μL、5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μL，Mt18SF/R各0.8μL、MwITSF/R各0.4μL、MhITSF/R各0.6μL、Tw28SF/R各0.4μL，灭菌ddH2O补足至25μL。
3.根据权利要求1所述的PCR方法，其特征在于：步骤(2)中的PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸70s，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
4.权利要求1中所述的四对特异性引物用于制备同时检测异育银鲫多种寄生粘孢子虫的PCR检测试剂盒的用途。
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