CN108411018A - 一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量pcr检测引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量pcr检测引物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测引物。本发明还公开了一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明提供的引物、试剂盒及检测方法在检测洪湖碘泡虫上灵敏度高、特异性强、重复性好、快速简便，最低可检测302个拷贝，不仅能从感染鱼的组织中检测出洪湖碘泡虫，也能从周年发病池塘的水样、泥样等环境样品中检测出洪湖碘泡虫，实现对养殖环境中的洪湖碘泡虫全生活史发育阶段时空动态的定量监测。本发明提供的引物、试剂盒及检测方法为鲫“喉孢子虫病”的早期快速诊断、监测、流行病学调查、苗种的产地检疫、“喉孢子虫病”发生的风险评估与预警、药效的评价及制定合理防控对策均可提供技术支撑。

Description

一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测引物、试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明涉及鱼类寄生虫检测领域，具体涉及一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测引物、检测试剂盒及检测方法。
背景技术
粘体动物(Myxozoa)是一类主要寄生于鱼类、少部分寄生于两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类的后生动物寄生虫。据文献资料记载，寄生于异育银鲫的粘孢子虫种类超过40种，能导致病害的有10多种。异育银鲫是中国科学院水生生物研究所的鱼类育种专家于1976～1981年研制成功的一种鲫鱼养殖新对象它是利用天然雌核发育的方正银鲫为母本，以兴国红鲤为父本，经人工授精繁育的子代。因其具有生长快、易饲养、抗逆性强肉质鲜美等优点，是我国重要的鲫鱼养殖品种。近年来，伴随着大规模集约化养殖的发展，异育银鲫粘孢子虫病害也日趋严重，不仅影响异育银鲫苗种培育，还危害成鱼养殖，给异育银鲫养殖业带来较大创伤。
粘孢子虫具有复杂的生活史，其宿主包括鱼和底栖无脊椎动物，如水蚯蚓。研究表明，粘孢子虫生活史主要分为两个阶段(1)无性生殖阶段：粘孢子虫在宿主鱼体内无性生殖形成营养体，然后通过血液移行到靶器官发育成熟形成成熟孢子，孢子成熟后脱落或随着鱼体死亡、鱼体粪便、尿液排入水中沉到水底被底泥中水蚯蚓吞食(2)有性生殖阶段：成熟孢子在水蚯蚓体内行有性生殖发育、移行、并以放射孢子虫的形式释放到水中，水中的放射孢子虫又通过皮肤、鳃等器官感染宿主鱼并在体内发育成熟进入下一个生活史。
洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)是危害鲫的重要病原体，也是危害异育银鲫最为严重的粘孢子虫。因其主要感染异育银鲫的咽喉部，俗称“喉孢子虫”。感染早期，鱼体无明显症状，随着感染程度加深，洪湖碘泡虫在鱼体咽部形成肉眼可见的孢囊，甚至取代整个咽部。目前我国对“喉孢子虫病”尚无有效的预防和治疗措施，主要原因是当今对该病的诊断以肉眼可见孢囊为标准，而孢囊形成后已是发病末期，药物难以进入几丁质的壳瓣，无法起到杀死虫子的效果。但当孢子虫在鱼体内处于营养体以及在水中处于放射孢子虫阶段往往是药物敏感期，从而达到预防的目的。因此，发展一种洪湖碘泡虫的早期检测方法检测鱼体内处于营养期的孢子、水体中的放射孢子和底泥中的孢子丰度尤为重要，以期为洪湖碘泡虫的早期诊断和病害防控奠定理论基础。
目前关于洪湖碘泡虫的检测方法，主要有形态学方法、免疫学方法和聚合酶链式反应(PCR)分子生物学方法。形态学方法通过常规肉眼观察、光学显微镜或电镜检查成熟孢子；免疫学方法利用制备的抗体对粘孢子虫病原体进行检测；分子生物学方法根据粘孢子虫核糖体基因(rDNA)序列设计特异性引物，并对待测DNA模板进行PCR扩增，测序分析扩增片段，再与相应的基因序列进行比对，得出检测结果。虽然这些方法都能达到检测的目的，但仍有一些不足，比如，漏诊率高，易出现假阳性，操作繁琐，易污染，敏感性相对较低，耗时长等，最重要是无法对病原丰度进行定量。
实时荧光定量PCR技术(rea1-time fluorescent quantitative PCR，Q-PCR)是一种在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。目前已广泛应用于分子生物学研究，医学研究，临床疾病诊断，动物疾病检测等领域中，具有特异性强、重复性好、敏感性高、操作简便、耗时短和无污染等优点，已成为目前核酸定量检测的首选方法。
因此，针对以上问题，建立一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测方法能够实现对鱼体内的营养期阶段、水体中的放射孢子和底泥中的孢子的丰度进行快速、准确的检测，以期为洪湖碘泡虫病害的有效防控提供重要的技术支持。
发明内容
发明目的：针对以上问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种洪湖碘泡虫的ITS序列。
发明还要解决的技术问题是提供一种洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)的实时荧光定量PCR检测引物。
本发明还要解决的技术问题是提供一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒。
本发明还要解决的技术问题是提供洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒在洪湖碘泡虫的检测方面的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测方法。
技术方案：为了解决现有技术存在的问题，本发明采用以下技术方案：
一种洪湖碘泡虫的ITS序列，所述ITS序列如SEQ ID NO：6所示。
一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测引物，所述检测引物基于洪湖碘泡虫的ITS序列设计获得，所述检测引物包含正向引物HH-F和反向引物HH-R，引物序列如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示，
HH-F：5'CCACGTTTGTCAGAGTGATTGC3'；
HH-R：5'GGTCGTATATTCACTGTCCGACT 3'。
一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒具体包括以下组分：
组分 工作液浓度
HH-F 10μM
HH-R 10μM
Real-time PCR Mix 2×
阳性标准品 --
阴性对照物(DD.H2O) --
其中，所述阳性标准品是含有洪湖碘泡虫基因片段的重组质粒。该基因片段序列为：CCACGTTTGTCAGAGTGATTGCGGTATGTGATAATTGTTTACAATTATTATATATAATCTGGCAACTTTGCATACACTTTGGTTTTCGTAAGACAATCACATAAAGTTAGCATCGAGAGCAATGGAATATTATTGATCATTGTGTGTTCATCAAGTCGGACAGTGAATATACGACC，序列长度为176bp，序列如SEQ ID NO:3所示。
由于粘孢子虫rDNA基因序列包含18SrDNA、ITS-5.8SrDNA、28SrDNA三个部分，ITS序列位于核糖体DNA序列中的一段内转录间隔区序列，ITS序列不同于其两端的大小亚基基因，ITS区不加入成熟的核糖体，功能上不受限制，受到的选择压力较小，导致其在核苷酸长度和序列上出现了很大的变异，特别适合作为种间分类鉴定的分子标记。因此，选择ITS区域基因序列为靶标序列设计实时荧光定量PCR引物。
其中，所述阳性标准品构建过程如下：
(1)洪湖碘泡虫和吴李碘泡虫DNA获得：采用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue试剂盒按照说明书步骤提取洪湖碘泡虫DNA、吴李碘泡虫DNA，于－20℃保存。
(2)洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫ITS序列获取：分别以提取的洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫DNA作为模板，使用粘孢子虫18S通用上游引物F(SEQ ID NO：4)18r-v:CGTAACAAGGTTTCCGTAG)和28S通用下游引物R(SEQ ID NO：5)R(Myxo28S1F-V:CACTTCACTCGCAGTTACT)进行常规PCR扩增；将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫目的条带DNA；分别将目的条带DNA与PMD‐18T载体连接，并将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞；将转化大肠杆菌DH5α成功的菌落纯化培养，PCR鉴定和筛选阳性克隆；将PCR鉴定成功的克隆菌液测序和序列拼接得到洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫ITS序列；
(3)实时荧光定量PCR引物设计：比对分析洪湖碘泡虫与吴李碘泡虫ITS序列，找出洪湖碘泡虫特异的ITS区域序列，将该区域序列作为靶标序列设计实时荧光定量PCR引物；引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
(4)洪湖碘泡虫阳性标准品的获得：将提取的洪湖碘泡虫DNA作为模板进行常规PCR扩增；扩增结束后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收目的基因；将目的基因与PMD‐18T载体连接，并将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞；将转化成功的DH5α大肠杆菌菌落纯化培养和PCR鉴定；将PCR鉴定成功的菌液测序，测序分析和序列比对正确后，用质粒小提试剂盒对转化成功的DH5α大肠杆菌菌液提取重组质粒；测定重组质粒浓度；验证获得良好的重复性和稳定性的重组质粒，即得到洪湖碘泡虫的阳性标准品。
其中，作为优选，步骤(2)中的PCR扩增体系为：10×PCR Buffer MIX12.5μL，上游引物F(10μM)1μL，下游引物R(10μM)1μL，DNA 1μL，灭菌ddH2O补加至25μL；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性50s，54℃退火50s，72℃2min，35个循环，最后72℃延伸10min。
其中，作为优选，步骤(2)和步骤(4)中的目的基因与PMD-18T载体分子按照分子比5：1比例进行连接。
其中，步骤(3)中利用Primer5.0根据实时荧光定量PCR引物设计原则设计引物，oligo6.0分析引物二级结构，将设计得到的引物利用Blast再次比对分析，确保引物特异性。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物由武汉擎科生物技术有限公司合成。
其中，作为优选，步骤(4)PCR扩增体系为10×PCR Buffer MIX12.5μL，正向引物HH-F(10μM)0.8μL，反向引物HH-R(10μM)0.8μL，洪湖碘泡虫DNA模板2μL，灭菌ddH2O补加至25μL；扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共循环30次，72℃后延伸5min。
其中，作为优选，步骤(4)中将提取后的质粒在Nano Drop 2000上测得260nm/280nm比值(满足在1.8-2.0)和浓度后并换算为拷贝数，10倍倍比稀释，取连续5个或5个以上不同梯度浓度的重组质粒在优化的反应条件下进行实时荧光定量PCR反应，在5个或5个以上不同梯度浓度重组质粒满足扩增效率在90％-105％之间，组内和组间重复性试验的变异系数均小于2％的条件情况下，将这5个或5个以上不同梯度浓度的重组质粒作为阳性标准品。
本发明内容还包括所述的一种用于检测洪湖碘泡虫的试剂盒在绒螯蟹肝胞虫检测方面的应用。
本发明内容还包括一种洪湖碘泡虫的检测方法，所述检测方法是实时荧光定量PCR方法。
其中，所述检测方法包括以下步骤：
(1)以洪湖碘泡虫DNA为待检品，分别以待检样品和阳性标准品作为模板，在包含HH-F、HH-R引物和荧光染料Real-time PCR Mix的优化反应条件中同时进行实时荧光定量PCR扩增，每个DNA浓度重复3次，以双蒸水作阴性对照；
(2)PCR扩增过程中，荧光定量PCR仪会根据阳性标准品扩增产物的荧光信号到达设定域值所经历的循环数生成相应的Ct值，将重复多次生成的Ct值取平均值得到△Ct值，以阳性标准品浓度的对数值为横坐标，△Ct值为纵坐标建立标准曲线，根据待检品△Ct值在标准曲线上的位置确定待检品中洪湖碘泡虫DNA的初始浓度。
进一步地，所述实时荧光定量PCR扩增结果判定方法为：待检品△Ct值为0，阴性对照无△Ct值，表示样品中不含洪湖碘泡虫；待检品△Ct值小于或等于35，阴性对照无△Ct值，表示样品中含有洪湖碘泡虫；待检品△Ct值大于35且小于40，阴性对照无△Ct值，则对该待检品重复检测，重复检测结果无△Ct值则该样品中不含洪湖碘泡虫，重复检测如果得到相同的实验结果则该样品中含有洪湖碘泡虫。
本发明的内容还包括对采用的荧光定量PCR反应体系和反应程序的建立与优化：
1)建立20μL反应体系：Real-time PCR Mix 10.0μL；正向引物HH-F(10μM)0.8μL；反向引物HH-R(10μM)0.8μL；阳性重组质粒DNA模板1.0μL；ddH2O7.4μL。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性12s；55℃退火20s，72℃延伸20s，75.5℃收集荧光5s，40个循环；溶解曲线温度、时间设置为65℃5s，95℃5min。
2)反应体系优化：根据所设计引物的Tm设定退火温度分别为55℃和58℃，引物用量(10μM)0.8μL和1μL，重组质粒用量1μL和2μL。以获得扩增效率高、稳定性好，无特异性扩增的反应条件为判定标准对反应条件的退火温度、引物的用量和重组质粒的用量进行优化。有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：
1、本发明首次获得了洪湖碘泡虫的ITS序列，并为洪湖碘泡虫实时荧光定量PCR检测提供了一对特异性专用检测引物。
2、本发明提供的检测方法与洪湖碘泡虫其他常规检测方法，如显微镜观察法和常规PCR法相比，具有操作程序简单、检测快速的特点；可用于操作程序化，直接应用于生产实践中，使检测效率得到很大的提高。
3、本发明提供的引物、试剂盒及检测方法不仅能评价鱼体中洪湖碘泡虫的寄生情况，而且还可用于水体、泥土中洪湖碘泡虫的检测。对洪湖碘泡虫不仅起着定性作用而且还有定量作用，同时可以避免假阳性。为快速准确检测洪湖碘泡虫提供保证，为洪湖碘泡虫的早期诊断和病害防控积累资料，并未后续资料奠定基础。
4、本发明提供的引物、试剂盒及检测方法在检测洪湖碘泡虫上灵敏度高、特异性强、重复性好、快速简便，最低可检测302个拷贝，不仅能从鲫鱼的喉部组织中检测出洪湖碘泡虫，也能从周年发病池塘的水样、泥样等环境样品中检测出洪湖碘泡虫，实现对于洪湖碘泡虫在水域环境中整个生活史过程的监测和洪湖碘泡虫在养殖环境中时空动态分布的定量监测。本发明提供的引物、试剂盒及检测方法为洪湖碘泡虫病害的早期快速诊断、监测、流行病学调查和制定合理防控对策研究提供有效手段和参考资料。
附图说明
图1为洪湖碘泡虫与吴李碘泡虫的ITS序列比对图(黑框部分为洪湖碘泡虫HH-F上游引物序列和HH-R下游引物反向互补序列)；
图2为PCR扩增产物电泳图(M：DL2000marker，1：洪湖碘泡虫基因组DNA，2：阴性对照(ddH2O))；
图3为重组质粒PCR鉴定图(M：DL 2000Marker1，1：重组质粒PCR结果，2：阴性对照(ddH2O))；
图4为测序结果图(黑色部分为插入目的片段序列，灰色部分为连接有目片段的PMD-18T载体序列)；
图5为实时荧光定量PCR标准曲线(逐级稀释的重组质粒(标准品扩增产物)(3.02×106～3.02×102拷贝/μL)；
图6为实时荧光定量PCR溶解曲线图；
图7为实时荧光定量PCR特异性试验图(1：阴性对照ddH2O，2-3依次为：洪湖碘泡虫基因组DNA、吴李碘泡虫基因组DNA)；
图8为实时荧光定量PCR扩增曲线图(1：阴性对照ddH2O，2～6：逐级稀释的重组质粒(标准品扩增产物)(3.02×106～3.02×102拷贝/μL)；
图9为逐级稀释的重组质粒常规PCR扩增产物电泳图(M：DL2000marker，1～5：3.02×106～3.02×102拷贝/μL；6：阴性对照ddH2O)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例是为了对本发明作进一步详细说明，并非对发明的限制。
实施例1
一、实验材料
1、洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫悬液
洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)、吴李碘泡虫(Myxobolus wulii)悬液由中国科学院水生生物研究所健康养殖实验室提供。
2、主要试剂与设备
试剂:DL marker 2000，pMD-18T载体，大肠杆菌DH5α感受态细胞、QIAGEN DNeasyBlood&Tissue试剂盒(武汉百腾瑞达生物科技有限公司，货号：69504)、EZNA Water DNAKit(武汉百腾瑞达生物科技有限公司，货号：D5525-01)、EZNA Soil DNA Kit(武汉百腾瑞达生物科技有限公司，货号：D5625)、Real-time PCR Mix(武汉佰蕾真生物科技有限公司，货号：1708882AP)、ddH2O(武汉百腾瑞达生物科技有限公司，货号：BTH9988)。
设备：伯乐T100PCR仪、Nano Drop 2000、Bio-rad CFX956荧光定量PCR仪。
二、实验方法
1、洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫DNA提取
分别将保存于75％酒精中的洪湖碘泡虫包囊样品和吴李碘泡虫包囊样品取出，于吸水纸上室温放置20min使乙醇挥发，用剪刀分别将包囊充分剪碎后移入EP管中，采用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue试剂盒按照说明书步骤提取DNA，于－20℃保存。
2、洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫ITS序列获得
(1)分别将提取的洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫DNA作为模板，分别使用粘孢子虫18S通用上游引物F(SEQ ID NO：4)18r-v:CGTAACAAGGTTTCCGTAG)和28S通用下游引物R(SEQ IDNO：5)R(Myxo28S1F-V:CACTTCACTCGCAGTTACT)进行常规PCR扩增。PCR扩增的体系为：10×PCR Buffer MIX12.5μL，上游引物F(10μM)1μL，下游引物R(10μM)1μL，DNA 1μL，灭菌ddH2O补加至25μL；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性50s，54℃退火50s，72℃2min，35个循环，最后72℃延伸10min。
(2)分别将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫目的基因。
(3)分别将回收的目的基因与pMD18-T载体分子按照分子比5：1比例进行连接，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞。
(4)分别将转化大肠杆菌DH5α成功的菌落进行纯化培养，分别采用PCR鉴定和筛选得到阳性克隆。PCR鉴定的扩增体系为：10×PCR Buffer MIX12.5μL，上游引物F(10μM)1μL，下游引物R(10μM)1μL，DNA模板1μL，灭菌ddH2O补加至25μL；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性50s，54℃退火50s，72℃2min，35个循环，最后72℃延伸10min。
(5)分别将阳性克隆菌液送往武汉擎科生物技术有限公司进行测序和序列拼接，因此，得到洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫ITS序列。洪湖碘泡虫ITS序列参见序列表SEQ ID NO：6，吴李碘泡虫ITS序列参见序列表SEQ ID NO：7。
3、洪湖碘泡虫实时荧光定量PCR引物设计
为了设计出针对洪湖碘泡虫的特异性引物，首先对洪湖碘泡虫与吴李碘泡虫的ITS序列进行比对分析(见图1)，寻找出洪湖碘泡虫特异的ITS区域，选定该区域作为引物设计的靶序列。然后利用Primer5.0根据实时荧光定量PCR引物设计原则设计引物，oligo6.0分析引物二级结构。最后将设计得到的引物利用Blast再次进行比对分析，确保引物特异性。引物由武汉擎科生物技术有限公司合成。设计的引物序列如下：
正向引物为HH-F：5'CCACGTTTGTCAGAGTGATTGC3'；
反向引物为HH-R：5'GGTCGTATATTCACTGCGACT 3'。
4、含有洪湖碘泡虫基因片段的重组质粒的构建
(1)常规PCR扩增：以提取的洪湖碘泡虫DNA为模板进行常规PCR扩增。采用25μL反应体系：10×PCR Buffer MIX12.5μL，正向引物HH-F(10μM)0.8μL，反向引物HH-R(10μM)0.8μL，DNA模板2μL，灭菌ddH2O补加至25μL；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共循环30次，72℃后延伸5min。扩增结束后取5μLPCR扩增反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，得到约为176bp基因片段的条带。
(2)使用琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒回收目的基因，将基因片段与pMD18-T载体分子按照分子比5：1的比例连接，并转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。
(3)对转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞成功的菌落进行纯化培养和PCR鉴定。PCR鉴定的反应体系为：10×PCR Buffer MIX12.5μL，正向引物HH-F(10μM)0.8μL，反向引物HH-R(10μM)0.8μL，DNA模板2μL，灭菌ddH2O补加至25μL；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共循环30次，72℃后延伸5min。结果如图3所示，扩增出一条大小约为176bp的单一清晰条带。
(4)将PCR鉴定成功的菌液送往武汉擎科生物技术有限公司测序。测序选择双向测序，测序使用的引物为正向引物HH-F和反向引物HH-R。
(5)对测序得到的序列进行拼接。首先利用DNAMAN软件在观察了逆向测定的序列和正向测定序列的峰形图都满足峰形规则且在序列的中部之后，先将逆向测定的序列反向互补，然后将得到的反向互补序列与正向测定的序列Blast，找到两个序列的重叠部分，剔除反向互补序列中的重叠部分，将反向互补序列其余的部分与正向测定的序列连接之后得到拼接序列。
(6)将拼接序列与洪湖碘泡虫176bp基因片段序列Blast比对，Blast比对后发现拼接序列与洪湖碘泡虫176bp基因片段序列同源性为100％，说明成功构建了含有洪湖碘泡虫基因片段的重组质粒，结果如图4所示，其中黑色部分为插入目的片段序列，灰色部分为连接目标序列的PMD-18T载体序列。
(7)对构建成功的重组质粒进行少量提取和纯化，于-20℃保存备用。
5、实时定量荧光PCR反应体系建立与优化
(1)反应体系建立：反应体系：Real-time PCR Mix 10.0μL；HH-F(10μM)0.8μL；HH-R(10μM)0.8μL；重组质粒DNA1.0μL；ddH2O 7.4μL。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性12s；55℃退火20s，72℃延伸20s，75.5℃收集荧光5s，40个循环；溶解曲线温度、时间设置为65℃5s，95℃5min。
(2)反应体系优化：根据所设计引物的Tm设定退火温度分别为55℃和58℃，引物用量(10μM)0.8μL和1μL，重组质粒用量1μL和2μL。以获得扩增效率高、稳定性好，无特异性扩增的反应条件为判定标准对反应条件的退火温度、引物的用量和重组质粒的用量进行优化。
(3)经过优化的反应体系为：Real-time PCR Mix 10.0μL；HH-F(10μM)0.8μL；HH-R(10μM)0.8μL；重组质粒DNA2.0μL；ddH2O 6.4μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性12s；58℃退火20s，72℃延伸20s，75.5℃收集荧光5s，40个循环；溶解曲线温度、时间设置为65℃5s，95℃5min。扩增效率为102.3％，组内和组间重复性试验的变异系数均小于2％，稳定性好，溶解曲线为单峰，无特异性扩增。
6、实时定量荧光标准曲线和回归方程的建立
(1)将上述步骤4得到的少量提取并纯化后的重组质粒在Nano Drop 2000上测得260nm/280nm比值为1.97，满足260nm/280nm值在1.8-2.0要求，测得浓度为95ng/μl，对应浓度的重组质粒拷贝数为3.02×1010拷贝/μL。
(2)将3.02×1010拷贝/μL重组质粒10倍倍比稀释，取3.02×106-3.02×102拷贝μL共5个梯度浓度的重组质粒(9.5×10-3ng/μL、9.5×10-4ng/μL、9.5×10-5ng/μL、9.5×10- 6ng/μL、9.5×10-7ng/μL)作为模板在步骤5优化后的反应条件下同时进行实时荧光定量PCR扩增，每个浓度重复3次，同时设置阴性对照(ddH2O作为阴性对照模板)。
(3)PCR扩增过程中，荧光定量PCR仪根据5个梯度浓度重组质粒扩增产物的荧光信号到达设定域值所经历的循环数生成相应的Ct值和扩增产物的荧光信号生成溶解曲线。结果如图5所示，以5个梯度浓度重组质粒浓度的对数值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标建立标准曲线，5个梯度浓度重组质粒浓度的对数值与相应的Ct值呈线性关系，对应的回归方程为Y＝﹣3.2577X+39.043，回归方程与标准曲线的相关系数(R2)为0.999，扩增效率为102.3％。结果如图6所示，扩增产物的溶解曲线呈单峰，Tm值为77.5，无引物二聚体和非特异性扩增。
7、实时荧光定量PCR方法特异性、灵敏性、检出率及重复性检测
(1)特异性检测：分别以洪湖碘泡虫DNA、吴李碘泡虫DNA为模板在步骤5优化后的反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，以双蒸水作阴性对照。结果如图7所示，只有洪湖碘泡虫DNA出现典型“S”型扩增曲线，吴李碘泡虫DNA未出现典型“S”型扩增曲线，阴性对照也未见扩增，说明本发明建立的实时定量荧光PCR方法具有良好的特异性。
(2)灵敏性检测：将3.02×106-3.02×102拷贝/μL 5个梯度浓度(9.5×10-3ng/μL、9.5×10-4ng/μL、9.5×10-5ng/μL、9.5×10-6ng/μL、9.5×10-7ng/μL)的重组质粒作为模板在步骤5优化后的反应条件下同时进行实时荧光定量PCR扩增，以双蒸水作阴性对照。结果如图8所示，3.02×106-3.02×102拷贝/μL重组质粒均呈现典型“S”型扩增曲线，最低检测拷贝数为3.02×102拷贝/μL，说明本发明建立的实时定量荧光PCR方法具有良好的灵敏性。
(3)检出率检测：将3.02×106-3.02×102拷贝/μL 5个梯度浓度(9.5×10-3ng/μL、9.5×10-4ng/μL、9.5×10-5ng/μL、9.5×10-6ng/μL、9.5×10-7ng/μL)的重组质粒为模板，采用上述常规的PCR体系和程序进行PCR扩增，同时以双蒸水作阴性对照，扩增结束后取5μL反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。结果如图9所示，常规PCR最低检测拷贝数为3.02×104拷贝/μL，实时荧光定量PCR检测的最低拷贝数为3.02×102拷贝/μL，实时荧光定量PCR方法检出率较高，是常规PCR方法的100倍，说明本发明建立的实时定量荧光PCR方法具有较高的检出率。
(4)重复性检测：将3.02×106-3.02×102拷贝/uL 5个梯度浓度(9.5×10-3ng/μL、9.5×10-4ng/μL、9.5×10-5ng/μL、9.5×10-6ng/μL、9.5×10-7ng/μL)的重组质粒为模板，在优化后的反应条件下分别进行组内和组间的重复性试验。进行组内重复性试验时，每个浓度重复3孔；组间重复性试验时，同一次反应每个浓度重复3孔，重复3次反应，同时设阴性对照，通过组内和组间Ct值变异系数(标准偏差/重复值平均数)，验证该方法的重复性和稳定性。结果由表1可知，3次组内和组间重复性试验的变异系数均小于2％，说明本发明建立的实时定量荧光PCR方法具有较好的重复性，同时也说明3.02×106-3.02×102拷贝/μL5个梯度浓度的重组质粒具有良好的重复性和稳定性，可以将这5个梯度浓度的重组质粒作为洪湖碘泡虫的阳性标准品。
表1 实时荧光定量PCR的组内与组间重复性试验
实施例2 鱼喉部组织样品、水样和泥样待检品中洪湖碘泡虫的检测
对采集自湖北黄冈市蕲春县八里湖五里墩正大水产(湖北)有限公司周年发生喉孢子虫病池塘中的5份鲫鱼喉部组织样品、5份水样和5份泥样待检品，分别采用QIAGENDNeasy Blood&Tissue，EZNA Water DNA Kit，EZNA Soil DNA Kit试剂盒提取DNA后，采用上述实施例1的步骤5优化的实时荧光定量PCR方法进行检测鲫鱼喉部组织样品、水样和泥样中的洪湖碘泡虫，以双蒸水作阴性对照。每个样品重复3个孔，将荧光定量PCR仪得到的3个Ct值取平均值得到△Ct值，将检测得到的△Ct值代入上述所述的回归方程式Y＝﹣3.2577X+39.043中，计算得出洪湖碘泡虫DNA的拷贝数(拷贝/μL)和对应的初始浓度(ng/μL)，结果见表2、表3和表4。
表2 周年发生喉孢子虫病池塘中鲫鱼喉部组织样品实时荧光定量PCR方法的检测
表3 周年发生喉孢子虫病池塘中水样样品实时荧光定量PCR方法的检测
表4 周年发生喉孢子虫病池塘中泥样样品实时荧光定量PCR方法的检测
根据判定规则：待检品△CT值为0，阴性对照无△CT值，表示样品中不含洪湖碘泡虫；待检品△CT值小于或等于35，阴性对照无△CT值，表示样品中含有洪湖碘泡虫；待检品△CT值大于35且小于40，阴性对照无△CT值，则对该待检品重复检测，重复检测结果无△CT值则该样品中不含洪湖碘泡虫，重复检测如果得到相同的实验结果则该样品中含有洪湖碘泡虫。
由表2检测结果可知，在周年发生喉孢子虫病池塘中的5份鲫鱼喉部组织待检品中，实时荧光定量PCR扩增结果的△Ct值分别为24.51、34.64、30.24、28.83、35.05，对应的DNA模板拷贝数分别为28914.989拷贝/uL、22.47拷贝/μL、503.75拷贝/μL、1364.69拷贝/μL、16.82拷贝/μL，对应的DNA模板浓度分别为9.0981E+23ng/μL、7.0696E+20ng/μL、1.585E+22ng/μL、4.294E+22ng/μL、5.291E+20ng/μL，样品1-样品4的△CT值在0～35范围之间，阴性对照△Ct值为0，表示4份鲫鱼喉部组织待检品中均含有洪湖碘泡虫，样品5的△CT值为35.05，阴性对照无△CT值，对该样品重复检测仍得到相同的实验结果，说明该样品中也含有洪湖碘泡虫。
由表3检测结果可知，在周年发生喉孢子虫病池塘中的5份水样待检品中，实时荧光定量PCR扩增结果的△Ct值分别为25.56、31.35、28.65、29.20、29.45，对应的DNA模板拷贝数分别为13766.06拷贝/μL、229.87拷贝/μL、1549.84拷贝/μL、1050.65拷拷贝/μL、880.47拷贝/μL，对应的DNA模板浓度分别为4.3315E+23ng/μL、7.2329E+21ng/μL、4.8766E+22ng/μL、3.3059E+22ng/μL、2.7704E+22ng/μL，△Ct值在0～35范围之间，阴性对照△Ct值为0，表示在周年发生喉孢子虫病池塘中的5份水样待检品中均含有洪湖碘泡虫。
由表4检测结果可知，在周年发生喉孢子虫病池塘中的5份泥样待检品中，实时荧光定量PCR扩增结果的△Ct值分别为35.07、35.70、24.51、32.68、28.06，对应的DNA模板拷贝数分别为16.58拷贝/uL、10.62拷贝/uL、28914.98拷贝/uL、89.79拷贝/uL、2351.78拷贝/uL，对应的DNA模板浓度分别为5.21677E+20ng/μL、3.34205E+20ng/μL、9.09813E+23ng/μL、2.82519E+21ng/μL、7.39991E+22ng/μL，样品3-样品5的△CT值在0～35范围之间，阴性对照△Ct值为0，表示3份泥样待检品中均含有洪湖碘泡虫，样品1和样品2的△CT值分别为35.07、35.70，阴性对照无△CT值，对两份样品重复检测仍得到相同的实验结果，说明这两份样品中也含有洪湖碘泡虫。结果，通过表2、表3和表4可知，本发明建立的实时定量荧光PCR方法可以成功定量和检测到周年发生喉孢子虫病池塘中的鲫鱼喉部、水样和泥样中的洪湖碘泡虫。
综上所述，本发明建立的一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测方法可以准确、快速、灵敏的定量检测出洪湖碘泡虫，以期为洪湖碘泡虫病害的早期诊断和有效防控提供重要的技术支持。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 中国科学院水生生物研究所
<120> 一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测引物、试剂盒及检测方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 正向引物HH-F(Artificial Sequence)
<400> 1
ccacgtttgt cagagtgatt gc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 反向引物HH-R(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtcgtatat tcactgtccg act 23
<210> 3
<211> 176
<212> DNA
<213> 阳性标准品(Artificial Sequence)
<400> 3
ccacgtttgt cagagtgatt gcggtatgtg ataattgttt acaattatta tatataatct 60
ggcaactttg catacacttt ggttttcgta agacaatcac ataaagttag catcgagagc 120
aatggaatat tattgatcat tgtgtgttca tcaagtcgga cagtgaatat acgacc 176
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 上游引物F(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtaacaagg tttccgtag 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 下游引物R(Artificial Sequence)
<400> 5
cacttcactc gcagttact 19
<210> 6
<211> 853
<212> DNA
<213> 洪湖碘泡虫ITS序列(Myxobolus honghuensis)
<400> 6
cgtaacaagg tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tatattactt gtacacacct 60
gttggtgtat gtaaatgtgt ccacgtttgt cagagtgatt gcggtatgtg ataattgttt 120
acaattatta tataaaatct ggcaactttg catacacttt ggttttcgta agacaatcac 180
ataaagttag catcgagagc aatggaatat tattgatcat tgtgtgttca tcaagtcgga 240
cagtgaatat acgatcaata tatgaaattg tttctcgatg ttttgaaagt ttgagctggt 300
gacatgattt aattgtgttg tatggttgat attaaaaaac aaccattgac ggtggatcac 360
ttggttcgaa gcacgatgaa gaacgtggca aaatgcgata attgatgcga ttcgcaagcc 420
ttgtgagtca tcaagttttt gaatgcatat ggcaccattg attatgtcag tggtatgtct 480
gtttgagggt tgttttctgt aaacattcgt ttgtttgtta tgataaactg ttaatttatt 540
agcagtttaa tcatacatca ttctgggtgc attaaaactt tttaagtttt gttggatttg 600
gtcatgattg aatctttatt gattttgtct tgacttgaat gtaattataa ctgtttatca 660
ttttgtataa agtaaaggtc atttttacga atgaattaca ttttaaactt gacttttatt 720
ttgtataact tgtttataac gacacttgtt tagcaacctc aaattaggca agacaacgcc 780
gtgaactaaa gcatttcagt aacggcagga aaagaaaata acaatgattc cctcagtaac 840
tgcgagtgaa gtg 853
<210> 7
<211> 868
<212> DNA
<213> 吴李碘泡虫ITS序列(Myxobolus wulii)
<400> 7
cgtaacaagg tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tattttactt gtaacacacc 60
gtgttgtgta tgtaaatgtg tccttattgg ttaaagagat cgccgtacat gaattgaggc 120
ttgactttaa tacatgtaat ttaaccaatt ttgcatacac ttggaatttc gtaagacgat 180
ctcattgtaa gacacagaaa tttattaata tgttctaaga ttaacgtatg cgtaaataaa 240
tggacattgc gtaaacaatc ttagacggtg ataatatttt tgtgttatgg atgttttagc 300
tggtgtattt ttaatattcg tggaaaaaat gatttgatca cacaactatt gacggtggat 360
cacttggttc gaagcacgat gaagaacgtg gcaaaatgcg ataattgatg cgattcgcaa 420
gccttgtgag tcatcaagtt tttgaatgca aatggcgcta tcgattcagt cggtggcatg 480
tctgtttgag ggttgttttc tgataacatc cgtatgtttg ttatggtgag aattaattaa 540
tctttggatt ttttatgact caactattcc aacgtattgg atgcattgga atttcgcaag 600
agatttcagt gggtatggtc atgatagaat ctttggtgaa tttatcttga cttgaatgta 660
tcaaatatgg ttcgagtcaa cgttgtgagc aaaaatcagg ttttatgatt gattaaattt 720
tagacatggt ttttgtattg cgacttgatg agaacgacac ttgttcagca acctcaaatt 780
aggcaagaaa acgccgtgaa ctaaagcatt tcagtaacgg caggaaaaga aaataacaat 840
gattccctca gtaactgcga gtgaagtg 868

Claims (10)

1.一种洪湖碘泡虫的ITS序列，其特征在于，所述ITS序列如SEQ ID NO：6所示。
2.一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于，所述检测引物基于权利要求1的ITS序列设计获得，其检测引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
3.一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的检测引物的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于， 所述的试剂盒包括：
（1）Real-time PCR Mix及权利要求2所述的检测引物的混合液；
（2）阳性标准品；
（3）阴性对照物。
5.根据权利要求4所述的洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品是含有洪湖碘泡虫基因片段的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，该基因片段长度为176bp，所述基因片段序列如SEQ ID NO:3所示。
7.根据权利要求5所述的洪湖碘泡虫实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品的构建方法包括如下步骤：
（1）洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫ITS序列获取：分别以提取的洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫DNA作为模板，使用粘孢子虫18S通用上游引物F和28S通用下游引物R进行常规PCR扩增；将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫目的条带DNA；分别将目的条带DNA与PMD-18T载体连接，并将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞；将转化大肠杆菌DH5α成功的菌落纯化培养，PCR鉴定和筛选阳性克隆；将PCR鉴定成功的克隆菌液测序和序列拼接得到洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫ITS序列；
（2）实时荧光定量PCR引物设计：比对分析洪湖碘泡虫与吴李碘泡虫ITS序列，找出洪湖碘泡虫特异的ITS区域序列，将该区域序列作为靶标序列设计实时荧光定量PCR引物；引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
（3）洪湖碘泡虫阳性标准品的获得：将提取的洪湖碘泡虫DNA作为模板进行常规PCR扩增；扩增结束后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收目的基因；将目的基因与PMD-18T载体连接，并将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞；将转化成功的DH5α大肠杆菌菌落纯化培养和PCR鉴定； 将PCR鉴定成功的菌液测序，测序分析和序列比对正确后，用质粒小提试剂盒对转化成功的DH5α大肠杆菌菌液提取重组质粒；测定重组质粒浓度；验证获得良好的重复性和稳定性的重组质粒，即得到洪湖碘泡虫的阳性标准品。
8.权利要求3~7任一项所述的洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒在洪湖碘泡虫的检测方面的应用。
9.一种洪湖碘泡虫的检测方法，其特征在于，所述的检测方法是实时荧光定量PCR方法，所述检测方法包括步骤如下：
（1）以提取的洪湖碘泡虫DNA作待检品，分别以待检品和阳性标准品为模板，在在包含权利要求2所述的引物对和荧光染料Real-time PCR Mix的优化反应条件中同时进行实时荧光定量PCR扩增，每个DNA浓度重复3次，以双蒸水作阴性对照；
（2）PCR扩增过程中，荧光定量PCR仪根据阳性标准品扩增产物的荧光信号到达设定域值所经历的循环数生成相应的Ct值，将重复多次生成的Ct值取平均值得到△Ct值，以阳性标准品浓度的对数值为横坐标，△Ct 值为纵坐标建立标准曲线，根据待检品△Ct值在标准曲线上的位置确定待检品中洪湖碘泡虫DNA的初始浓度。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增结果判定方法为：待检品△Ct值为0，阴性对照无△Ct值，表示样品中不含洪湖碘泡虫；待检品△Ct值小于或等于35，阴性对照无△Ct值，表示样品中含有洪湖碘泡虫；待检品△Ct值大于35且小于40，阴性对照无△Ct值，则对该待检品重复检测，重复检测结果无△Ct值则该样品中不含洪湖碘泡虫，重复检测如果得到相同的实验结果则该样品中含有洪湖碘泡虫。
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