CN108611426A - 用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量pcr引物对、检测试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于检测绒螯蟹肝孢虫的实时荧光定量PCR引物对，所述引物对序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。本发明提供的引物对、试剂盒及检测方法在检测绒螯蟹肝孢虫上具有以下优点：与其他病原微孢子虫无交叉反应，特异性强；组内和组间重复性试验结果的变异系数均小于2%，重复性好；扩增效率为98.3%，最低可检测 2.87×10¹拷贝/μL，是普通PCR的100倍，本发明建立的方法扩增效率和检测的灵敏度更高；从绒螯蟹肝孢虫待检品提取DNA到结果分析整个实验过程只需要2h，检测效率大大提高。

Description

用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR引物对、检测试剂 盒及应用

技术领域

本发明涉及微生物分子检测领域，具体涉及一种检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光PCR引物对、检测试剂盒及应用。

背景技术

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)，又称河蟹、大闸蟹,因其味道鲜美和营养丰富，深受广大消费者的喜爱，是我国主要养殖的经济蟹类。然而，随着集约化养殖的发展，河蟹各类疾病频发，其中“水瘪子”是近几年对河蟹造成危害最严重的病害之一，其引起的症状主要表现为病蟹的肝胰腺颜色发生变化，从健康时的黄色肝胰腺变浅到进一步发展至乳白和灰黑色，胸腔积液，肝胰腺和肌肉大量萎缩甚至消失等症状，给河蟹养殖业带来了巨大的经济损失。但是迄今导致河蟹“水瘪子”的原因众说纷纭，病毒、微孢子虫、细菌等生物因素及杀虫药物的滥用、养殖水质、种质退化和营养等非生物因子都被认为是可能的原因。

绒螯蟹肝胞虫(Hepatospora eriocheir)是一种寄生于中华绒螯蟹肝胰腺的微孢子虫。绒螯蟹肝胞虫的感染可能与“水瘪子”的发生相关。“水瘪子”是近几年对河蟹造成危害最严重的病害之一，给河蟹养殖业带来了巨大的经济损失。但是迄今导致河蟹“水瘪子”的原因众说纷纭，病毒、微孢子虫、细菌等生物因素及杀虫药物的滥用、养殖水质、种质退化和营养等非生物因子都被认为是可能的原因。之前有研究表明，绒螯蟹肝胞虫的感染可能与“水瘪子”的发生相关。

目前关于绒螯蟹肝胞虫的检测方法，主要有镜检法、常规PCR法、实时荧光定量PCR法以及原位杂交法。虽然这些方法都能达到检测绒螯蟹肝胞虫的目的，但是仍有一些不足，比如，漏诊率高，易出现假阳性，敏感性相对较低，操作繁琐，耗时长等，例如丁正峰建立的绒螯蟹肝胞虫实时荧光定量PCR检测方法，扩增效率只有79.1％，灵敏度检测下限只能达到200拷贝/μL，不适用于低浓度样本的绒螯蟹肝胞虫检测。

因此，现在需要建立一种高灵敏度、快速检测绒螯蟹肝胞虫的方法，该方法不仅可以为绒螯蟹肝孢虫的高灵敏度、快速准确检测提供有效技术手段，而且还可以为“水瘪子”病病因的初步筛查和“水瘪子”病的有效防控提供重要的技术支持和参考资料。

发明内容

发明目的：为建立一种高灵敏度、快速检测绒螯蟹肝胞虫的方法，本发明通过在分析和比对绒螯蟹肝胞虫18SrDNA基因序列的基础上，设计特异性引物扩增并克隆相应片段，构建由绒螯蟹肝胞虫基因片段和pMD-18载体连接而成的质粒标准品，建立了绒螯蟹肝孢虫的实时荧光定量PCR方法，该方法为绒螯蟹肝孢虫的高灵敏度、快速检测提供了一种有效的技术手段。

因此，本发明所要解决的技术问题是提供了用于高灵敏度、快速检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR引物对。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供了实时荧光定量PCR检测试剂盒在绒螯蟹肝胞虫检测方面的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种绒螯蟹肝胞虫的检测方法。

技术方案：为了解决现有技术存在的问题，本发明采用以下技术方案：一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的引物对，所述引物对由HE-F和HE-R组成，所述引物对的序列如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

HE-F：5'CTCTATCGGAAGATGGGGAA 3'；

HE-R：5'GCTCTGGCTTGGTAAGTTTT 3'。

本发明内容还包括一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的试剂盒，含有所述的引物对的试剂盒。其中，所述的试剂盒包括：

(1)Real-time PCR Mix及所述的引物对的混合液；

(2)阳性标准品；

(3)阴性对照物。

其中，所述阳性标准品是含有绒螯蟹肝胞虫基因片段的重组质粒。该基因片段的序列如SEQ ID NO:3所示。

其中，所述阳性标准品的制备过程如下：

(1)提取绒螯蟹肝胞虫DNA：采用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue试剂盒按照说明书步骤提取绒螯蟹肝胞虫DNA于－20℃保存。

(2)常规PCR扩增：以绒螯蟹基因组DNA为PCR模板，以引物HE-F和HE-R为PCR引物，进行常规PCR扩增。扩增的反应体系是：10×PCR Buffer MIX 12.5μL，HE-F0.8μL，HE-R0.8μL，DNA模板2μL，灭菌ddH₂O补加至25μL；反应程序是：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共循环30次，72℃后延伸5min。

(3)扩增结束后取5μL反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收目的基因，将目的基因与PMD-18T载体进行连接、转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞。将转化成功的菌落纯化培养和PCR鉴定，PCR鉴定的反应条件如上述步骤(2)中所述，将PCR鉴定成功的菌液送往生物公司进行测序，序列比对正确后，采用OMEGA质粒小提试剂盒对阳性重组质粒进行提取，于-20℃保存备用。

(4)将提取的阳性重组质粒在Nano Drop 2000上测得260nm/280nm比值(满足在1.8-2.0)和浓度后并换算为拷贝数，10倍倍比稀释，取连续5个或5个以上不同梯度拷贝数的重组质粒在优化的反应条件下进行荧光定量PCR扩增，在5个或5个以上不同梯度拷贝数重组质粒满足扩增效率在90％-105％之间，组内和组间重复性试验的变异系数均小于2％的条件情况下，将这5个或5个以上不同梯度拷贝数的重组质粒作为阳性标准品。

本发明内容还包括所述的一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的试剂盒在绒螯蟹肝胞虫检测方面的应用。

本发明内容还包括一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的检测方法，所述检测方法是实时定量荧光PCR方法。

其中，所述检测方法包括以下步骤：

(1)提取绒螯蟹肝胞虫DNA：采用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue试剂盒按照说明书步骤从待测样品中提取绒螯蟹肝胞虫DNA，于－20℃保存。

(2)将绒螯蟹肝胞虫DNA和阳性标准品作为模板，在包含HE-F、HE-R引物和荧光染料Real-time PCR Mix的优化反应条件中同时进行实时荧光定量PCR扩增，每个DNA浓度重复3次，以双蒸水作阴性对照。

(3)PCR扩增过程中，荧光定量PCR仪会根据阳性标准品扩增产物的荧光信号到达设定域值所经历的循环数生成相应的Ct值。重复多次得到多个CT值，然后取平均值得到△Ct值，以阳性标准品拷贝数的对数值为横坐标，△Ct值为纵坐标建立标准曲线，根据待检品的△Ct值在标准曲线上的位置确定待绒螯蟹肝胞虫的DNA初始浓度。

(4)其中，检测结果的判定标准为：待检品△Ct值为0，阴性对照无△Ct值，表示样品中不含绒螯蟹肝胞虫；待检品△Ct值小于或等于35，阴性对照无△Ct值，表示样品中含有绒螯蟹肝胞虫；待检品△Ct值大于35且小于40，阴性对照无△Ct值，则对该待检品重复检测，重复检测结果无△Ct值则该样品中不含绒螯蟹肝胞虫，重复检测如果得到相同的实验结果则该样品中含有绒螯蟹肝胞虫。

本发明内容还包括对采用的荧光定量PCR反应体系和反应程序的建立与优化，具体包括如下内容：

1)建立20μL反应体系：Real-time PCR Mix 10.0μL；正向引物HH-F(10μM)0.8μL；反向引物HH-R(10μM)0.8μL；阳性重组质粒DNA模板1.0μL；ddH₂O7.4μL。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性12s；56℃退火20s，72℃延伸20s，75.5℃收集荧光5s，40个循环；溶解曲线温度、时间设置为65℃5s，95℃5min。

2)反应体系优化：根据所设计引物的Tm设定退火温度分别为53℃和56℃，引物用量(10μM)0.8μL和1μL，重组质粒用量1μL和2μL。以获得最低Ct值为判定标准对反应条件的退火温度、引物的用量和重组质粒的用量进行优化，以找到扩增效率高、稳定性好，无特异性扩增的最佳反应条件。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：

1、本发明建立的方法兼有PCR的高灵敏性，DNA杂交的特异性，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化。并且与普通PCR相比，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭关操作，有效地降低了污染。

2、扩增效率为98.3％，最低可检测2.87×10¹拷贝/μL，是普通PCR的100倍，与丁正峰建立的绒螯蟹肝孢虫的实时荧光定量PCR检测方法相比，本发明建立的检测方法扩增效率和灵敏度更高。

3、从绒螯蟹肝孢虫待检品提取DNA到结果分析整个实验过程只需要2h，检测效率大大提高。

附图说明

图1为绒螯蟹肝胞虫、石斑鱼微孢子虫、对虾肝孢子虫18S rDNA基因序列序列比对图(黑框部分为绒螯蟹肝胞虫HE-F上游引物序列和HE-R下游引物反向互补序列)；

图2为PCR扩增产物电泳图(M：DL2000marker，1：阳性绒螯蟹肝胞虫，2：阴性对照(ddH₂O))；

图3为重组质粒PCR鉴定图(M：DL 2000Marker1，1、重组质粒PCR结果，2：阴性对照(ddH₂O))；

图4为测序结果图(黑色部分为插入目的片段序列，灰色部分为PMD-18T载体序列)；

图5为实时荧光定量PCR标准曲线图；

图6为实时荧光定量PCR溶解曲线图；

图7为实时荧光定量PCR特异性试验图(1：阴性对照ddH₂O，2-4依次为：绒螯蟹肝胞虫、石斑鱼肠道微孢子虫、对虾肝孢子虫)；

图8为逐级稀释的重组质粒实时荧光定量PCR扩增曲线图(1：阴性对照ddH₂O，2～6：2.87×10⁵～2.87×10¹拷贝/μL重组质粒(标准品扩增产物)。

图9为逐级稀释的重组质粒PCR扩增产物电泳图(M：DL2000marker，1～5：2.87×10⁵～2.87×10¹拷贝/μL重组质粒，6：阴性对照(ddH₂O))。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例是为了对本发明作进一步详细说明，并非对发明的限制。

实施例1

一、实验材料

1、绒螯蟹肝胞虫DNA、石斑鱼肠道微孢子虫DNA、对虾肝孢子虫DNA

绒螯蟹肝胞虫来自盐城市盐都区大岗镇的中华绒螯蟹的感染病料、石斑鱼肠道微孢子虫来自海南省儋州市区排浦镇石斑鱼的感染病料、对虾肝孢子虫来自海南省文昌市清兰镇对虾的感染病料，分别使用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue试剂盒进行DNA的抽提获得绒螯蟹肝胞虫DNA、石斑鱼肠道微孢子虫DNA、对虾肝孢子虫DNA。

2、主要试剂与设备

试剂:DL marker 2000，pMD-18T载体，大肠杆菌DH5α感受态细胞、QIAGEN DNeasyBlood&Tissue试剂盒(武汉百腾瑞达生物科技有限公司，货号：69504)、EZNA Water DNAKit(武汉百腾瑞达生物科技有限公司，货号：D5525-01)、EZNA Soil DNA Kit(武汉百腾瑞达生物科技有限公司，货号：D5625)、Real-time PCR Mix(武汉佰蕾真生物科技有限公司，货号：1708882AP)、ddH₂O(武汉百腾瑞达生物科技有限公司，货号：BTH9988)。

设备：伯乐T100PCR仪、Nano Drop 2000、Bio-rad CFX96荧光定量PCR仪。

二、实验方法

1、绒螯蟹肝胞虫实时荧光定量PCR引物设计：

首先将Genbank上已发表的绒螯蟹肝胞虫(Hepatospora eriocheir)、石斑鱼微孢子虫(Microsporidium sp)、对虾肝孢子虫(Enterocytozoon hepatopenaei)18S rDNA基因序列(登录号：HE584635.1、KR263870.1、KF362129.1)下载后，进行序列比对分析(图1)，找出绒螯蟹肝胞虫特异的区域作为绒螯蟹肝胞虫引物设计的靶序列。然后利用Primer5.0根据实时荧光定量PCR引物设计原则设计引物，oligo6.0分析引物二级结构。最后将设计得到的引物Blast再次比对分析，以确保引物的特异性。

引物设计结果为：

HE-F：5'CTCTATCGGAAGATGGGGAA 3'；

HE-R：5'GCTCTGGCTTGGTAAGTTTT 3'。

2、PCR扩增目标片段

(1)采用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue按照说明书步骤提取绒螯蟹肝胞虫DNA。

(2)以所提取的绒螯蟹肝胞虫DNA为模板进行常规PCR扩增，采用25μL反应体系：10×PCR Buffer MIX 12.5μL，HE-F 0.8μL，HE-R 0.8μL，DNA模板2μL，灭菌ddH₂O补加至25μL；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共循环30次，72℃后延伸5min。

(3)扩增结束后取5μLPCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，得到绒螯蟹肝胞虫162bp目标基因片段扩增产物，结果如图2所示。该基因片段的序列如SEQ ID NO:3所示。

3、绒螯蟹肝胞虫阳性标准品的制备

(1)用胶回收试剂盒回收162bp目标片段。按照目标片段与pMD-18T载体分子比5∶1比例进行连接，将连接产物转化入DH5α感受态细胞。将转化成功的菌落进行纯化培养和PCR鉴定，PCR鉴定的反应条件如上述PCR步骤中相同。将PCR鉴定成功的阳性克隆菌液送往武汉擎科生物技术有限公司进行测序。对测序成功的阳性重组质粒进行少量提取和纯化，于-20℃保存备用。

(2)结果如图3所示，采用菌落PCR鉴定，电泳结果显示，扩增出一条大小约为162bp的单一清晰条带，与预期结果一致；结果如图4所示，测序结果显示，绒螯蟹肝胞虫162bp目标片段插入到pMD-18T载体中；在NCBI中进行序列比对结果显示，测序结果的序列与绒螯蟹肝胞虫18S rDNA基因序列(登录号：HE584635.1)的对应区域的同源性为100％，因此，说明含有绒螯蟹肝胞虫目标基因的阳性重组质粒构建成功。

4、实时荧光定量PCR反应条件建立与优化

(1)建立20μL反应体系：Real-time PCR Mix 10.0μL；正向引物HH-F(10μM)0.8μL；反向引物HH-R(10μM)0.8μL；阳性重组质粒DNA模板1.0μL；ddH₂O7.4μL。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性12s；56℃退火20s，72℃延伸20s，75.5℃收集荧光5s，40个循环；溶解曲线温度、时间设置为65℃5s，95℃5min。

(2)反应体系优化：根据所设计引物的Tm设定退火温度分别为53℃和56℃，引物用量(10μM)0.8μL和1μL，重组质粒用量1μL和2μL。以获得最低Ct值为判定标准对反应条件的退火温度、引物的用量和重组质粒的用量进行优化以找到扩增效率高、稳定性好，无特异性扩增的最佳反应条件。

(3)经过优化的反应体系为：Real-time PCR Mix 10.0μL；正向引物HH-F(10μM)0.8μL；反向引物HH-R(10μM)0.8μL；阳性重组质粒DNA模板2.0μL；ddH2O 6.4μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性12s；53℃退火20s，75.5℃收集荧光5s，40个循环；溶解曲线温度、时间设置为65℃5s，95℃5min。扩增效率为98.3％，组内和组间重复性试验的变异系数均小于2％，稳定性好，溶解曲线为单峰，无特异性扩增。

5、实时定量荧光PCR反应标准曲线和回归方程的建立

(1)将步骤3少量提取并纯化后的阳性重组质粒在Nano Drop 2000上测得260nm/280nm比值为1.97，满足260nm/280nm值在1.8-2.0要求，测得浓度为90ng/μl，对应浓度的重组质粒拷贝数为2.87×10¹⁰拷贝/μL，将阳性重组质粒进行10倍梯度稀释，取2.87×10⁵-2.87×10¹拷贝数的5个重组质粒作为模板在优化后的反应条件下同时进行实时荧光定量PCR扩增，每个浓度重复3次，同时设置阴性对照。

(2)PCR扩增过程中，荧光定量PCR仪根据5个重组质粒扩增产物的荧光信号到达设定域值所经历的循环数生成相应的Ct值和扩增产物的荧光信号生成溶解曲线。结果如图5所示，以2.87×10⁵-2.87×10¹拷贝数5个重组质粒拷贝数的对数值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标建立标准曲线，2.87×10⁵-2.87×10¹拷贝数5个重组质粒拷贝数的对数值与相应的Ct值呈线性关系，对应的回归方程为Y＝﹣3.3507X+42.589，回归方程与标准曲线的相关系数(R²)为0.9957，扩增效率为98.3％。结果如图6所示，扩增产物的溶解曲线呈单峰，Tm值为81.5，无引物二聚体和非特异性扩增，所建立的荧光定量PCR方法引物特异性良好。

5、实时荧光定量PCR方法特异性、灵敏性、检出率及重复性检测

(1)以绒螯蟹肝胞虫、石斑鱼肠道微孢子虫、对虾肝孢子虫的DNA为模板，在步骤4经过优化后的反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，同时以双蒸水作阴性对照。结果如图7所示(曲线1为阴性对照ddH₂O、曲线2-4分别是绒螯蟹肝胞虫、石斑鱼肠道微孢子虫、对虾肝孢子虫)，仅有绒螯蟹肝胞虫DNA出现扩增，石斑鱼肠道微孢子虫DNA、对虾肝孢子虫DNA及阴性对照并未扩增，说明本发明建立的实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性。

(2)将已计算出拷贝数的阳性重组质粒10倍梯度稀释，作10次稀释，取2.87×10⁵-2.87×10¹拷贝数的5个重组质粒作为模板在经过优化后的反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，同时以双蒸水作阴性对照。结果如图8所示(曲线1为阴性对照、曲线2～6所对应的重组质粒模板浓度分别为2.87×10⁵、2.87×10⁴、2.87×10³、2.87×10²、2.87×10¹拷贝/μL)，阴性对照无扩增，2.87×10⁵-2.87×10¹拷贝数的5个重组质粒均出现典型”S”型扩增曲线，检测的最低拷贝数为2.87×10¹拷贝/μL，说明本发明建立的实时荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性。

(3)以2.87×10⁵-2.87×10¹拷贝数的5个阳性重组质粒作为常规PCR的模板，采用上述常规的PCR体系和程序进行PCR扩增，同时以双蒸水作阴性对照，扩增结束后取5μL反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。结果如图9所示(1-5分别为2.87×10⁵、2.87×10⁴、2.87×10³、2.87×10²、2.87×10¹拷贝/μL，6：阴性对照(ddH₂O))，常规PCR检测的最低拷贝数为2.87×10³拷贝/μL，实时荧光定量PCR检测的最低拷贝数为2.87×10¹拷贝/μL因此，实时荧光定量PCR方法检出率较高，是常规PCR方法的100倍，说明本发明建立的实时荧光定量PCR方法具有较高的检出率。

(4)选用2.87×10⁵-2.87×10¹拷贝/μL的5个重组质粒作为模板在步骤4经过优化后的反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，同时以双蒸水作阴性对照。每个浓度重复3孔进行组内重复性检测；间隔一星期重复3次反应进行组间重复性检测，同一次反应每个浓度重复3孔，通过Ct值变异系数(标准偏差/重复值平均数)，评估该方法的重复性。由表1可知，3次组内和组间重复性试验的变异系数均小于2％，说明本发明建立的实时荧光定量PCR方法方法具有较好的重复性。

表1实时荧光定量PCR的组内与组间重复性试验

6、临床样品检测

对分别采集自黄河、辽河、长江水系的15份疑似感染绒螯蟹肝胞虫的绒螯蟹病料，采用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue试剂盒按照说明书步骤提取绒螯蟹肝胞虫DNA后，用已经建立的荧光定量PCR方法检测15份待检品中的绒螯蟹肝胞虫，同时以双蒸水作阴性对照。每组实验重复3次，将荧光定量PCR仪得到的3个Ct值取平均值得到△Ct值，将检测得到的待检品△Ct值代入所述回归方程式Y＝﹣3.3507X+42.589中，计算得出待检品中绒螯蟹肝胞虫的拷贝数和对应待检品中绒螯蟹肝胞虫的初始DNA浓度。

表2黄河水系疑似感染绒螯蟹肝胞虫的绒螯蟹病料实时荧光定量PCR方法的检测

表3辽河水系疑似感染绒螯蟹肝胞虫的绒螯蟹病料实时荧光定量PCR方法的检测

表4长江水系疑似感染绒螯蟹肝胞虫的绒螯蟹病料实时荧光定量PCR方法的检测

根据判定规则：待检品△Ct值为0，阴性对照无△Ct值，表示样品中不含绒螯蟹肝胞虫；待检品△Ct值小于或等于35，阴性对照无△Ct值，表示样品中含有绒螯蟹肝胞虫；待检品△Ct值大于35且小于40，阴性对照无△Ct值，则对该待检品重复检测，重复检测结果无△Ct值则该样品中不含绒螯蟹肝胞虫，重复检测如果得到相同的实验结果则该样品中含有绒螯蟹肝胞虫。

由表2检测结果可知，在采集自黄河水系疑似感染绒螯蟹肝胞虫的5份绒螯蟹病料待检品中，实时荧光定量PCR扩增结果的△Ct值分别为17.18、16.51、21.25、15.24、31.31，对应的DNA模板拷贝数分别为184769742.4拷贝/μL、29905518.43拷贝/μL、107364133.5拷贝/uL、55507533.09拷贝/μL、637468.5594拷贝/μL，对应的DNA模板浓度分别为5.78544E+17ng/μL、9.3639E+16ng/μL、3.3617E+17ng/μL、1.73803E+17ng/μL、1.99602E+15ng/μL，△Ct值在0～35范围之间，阴性对照△Ct值为0，表示采集自黄河水系疑似感染绒螯蟹肝胞虫的5份绒螯蟹病料待检品中均含有绒螯蟹肝胞虫。

由表3检测结果可知，在采集自辽河水系疑似感染绒螯蟹肝胞虫的5份绒螯蟹病料待检品中，实时荧光定量PCR扩增结果的△Ct值分别为14.89、17.54、15.68、16.64、23.14，对应的DNA模板拷贝数分别为38299364.86拷贝/μL、60694563.1拷贝/μL、2336253.75拷贝/μL、1.45E+08拷贝/μL、2323.60496拷贝/μL，对应的DNA模板浓度分别为1.19922E+17ng/μL、1.9004E+17ng/μL、7.3152E+15ng/μL、4.54863E+17ng/μL、7.27559E+12ng/μL，△Ct值在0～35范围之间，阴性对照△Ct值为0，表示采集自辽河水系疑似感染绒螯蟹肝胞虫的5份绒螯蟹病料待检品中均含有绒螯蟹肝胞虫。

由表4检测结果可知，在采集自长江水系疑似感染绒螯蟹肝胞虫的5份绒螯蟹病料待检品中，实时荧光定量PCR扩增结果的△Ct值分别为0、0、0、0、0，0，阴性对照△Ct值为0，表示采集自长江水系疑似感染绒螯蟹肝胞虫的5份绒螯蟹病料待检品中均不含有绒螯蟹肝胞虫。

通过以上检测结果，说明本发明建立的荧光定量PCR的方法可以成功地定量检测到绒螯蟹病料待检品中的绒螯蟹肝胞虫的DNA浓度。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> 用于检测绒螯蟹肝胞虫的引物对、检测试剂盒及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 上游扩增引物HE-F(Artificial Sequence)

<400> 1

ctctatcgga agatggggaa 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 下游扩增引物HE-R(Artificial Sequence)

<400> 2

gctctggctt ggtaagtttt 20

<210> 3

<211> 162

<212> DNA

<213> 目的基因片段(Artificial Sequence)

<400> 3

ctctatcgga agatggggaa gggagaaatc ttagtgtacg ggctctgggg aaaatacgat 60

cgcaagattg aaacttaaaa cgaaattgac ggaaggacac cacaaagagt ggattgtgct 120

gcttaatttg actcaacgcg ggaaaactta ccaagccaga gc 162

<210> 4

<211> 887

<212> DNA

<213> 中华绒螯蟹微孢子虫(Hepatospora eriocheir partial 18S rRNA gene)

<400> 4

aaaggaggga gtgtaaacta ctacctgtga ggctattgtt gggcaagctt ggtgccagca 60

gccgcggtaa ttccaacaac aagaatgtct atgattgatg ctgcagttaa aaagtccgta 120

gttgtatatg caatgaaaaa acactgatta agggtgttag atttgttcgc attggcggaa 180

tggacaggga gcacagtata gatgggcgaa ggatgaaatc tcaagaccct atctggactg 240

acagaagcga aggcggtgct cttgtacatc tcagagaatc aaggacgaag gctatagtag 300

tgatggcgat tagagaccgc cgtagcttta gcagtaaatt atgccgacat tctctatcgg 360

aagatgggga agggagaaat cttagtgtac gggctctggg gaaaatacga tcgcaagatt 420

gaaacttaaa acgaaattga cggaaggaca ccacaaagag tggattgtgc tgcttaattt 480

gactcaacgc gggaaaactt accaagccag agcctatcgt agaatgcaaa cgagataggc 540

aagagtggtg catggccgtt ggaaattgat gggatgacct ttcgcttaaa tgctttaacc 600

agtgagatct tctagacagg taccatgcgg tacaggaagg agaaggctat aacaggtccg 660

taatgccctc aatggcttgg gcagcaagcg caatacaata tctatcgtaa gagaaagcaa 720

atggtagata agtaggattg gatcttgtaa gagatccatg aatgcggaat tctcagtaac 780

aataggttca ttaagccatt gtgaatacgt ccctgttctt tgtacacacc gcccgtcgcc 840

atttcagatg atgttggata tgaagagcct aggttctgaa tattcaa 887

<210> 5

<211> 1115

<212> DNA

<213> 石斑鱼微孢子虫(JZ-2016 Microsporidium sp. 18S ribosomal RNA gene,partial sequence)

<400> 5

gcccaagggc agcagcaggc gcgaaacttg tccactcttc tgcgaggaga cagtcaggaa 60

acgtgaaatg aactaaccac ggtaacctgt ggctaaaaat ttagaataag gcgcagtcct 120

attatgtttg ttggtagtgt aatggactcc caaggcaaca atgggtgacg ggaaatcagg 180

gtttgattcc ggagagggag cctgagagat ggctcccacg tccaaggacg gcagcaggcg 240

cgaaaattgt ccactttttt gagaagagac atttattaga cgtgactaaa agagcgtagt 300

ttaaaaaact atgtgtaaag ttattggagg gtaagtttgg tgccagcagc cgcggtaatt 360

ccgactccaa gagtgttcat gatggttgtt gcagttaaaa cgtccgtagc tgtagatgca 420

attaaaacac gatgataaaa atcgtagagt ttgctaaata ttgctagcgg aatggatagg 480

gaacgtggta taggtagaca aagaatgaaa tctctagact ctacctggac caacagaggc 540

gaaagcgacg ttcttagacg tatccgaggg tcaaggacta aggctggagt attgaaagtg 600

attagatacc gctgtaattc tagcagtaaa ctatgccgac aatttttagt gactttttaa 660

aaagtttgct gggaataaga gaaatcaagt tttcgggctc tggggatagt acagccgcaa 720

gactgaaact taaacgatat tggcggaagt ttaccaccag tagtggatta tgccgcttaa 780

tttaactcaa cgcgggaaaa cttaccaggg tcaagtttat cgtagattga ttacatgaga 840

taaacgagag tggtgcatgg ccgttgtaaa ttgatggaat gatctttaac ttaagtgttg 900

gaatcagtga gatctatgag acaggtgctt tttaagtaca ggaaaggtgt aggacgataa 960

caggtccgta atgccctcag atatcctggg cagcaagcgt aatacaatat cacttaaaaa 1020

aataaagaaa tttgtgataa gcaggattag cttttgtaaa taagctatga acgaggaatt 1080

actagtaacg gtgcctcatc aaggcatggt gaatg 1115

<210> 6

<211> 913

<212> DNA

<213> 对虾肝孢子虫(KF362129.1 Enterocytozoon hepatopenaei small subunitribosomal RNA gene, partial sequence)

<400> 6

gatggctccc acgtccaagg gatgcagcag gcgcgaaaat tgtccactct tttgagagga 60

gacagttatg aaacgtgagt agaagggtcg agtgtaaaaa ccttgacgtg aagcaattgg 120

agggcaagtt ttggtgccag cagccgcggt aattccaact ccaagagtgt ctatggtgga 180

tgctgcagtt aaagggtccg tagtcgtaga tgcaattaaa aggtggtgtt aaaagccatt 240

gagtttgttg agagtagcgg aacggatagg gagcatggta taggtgggca aagaatgaaa 300

tctcaagacc ccacctggac caacggaggc gaaagcgatg ctcttagacg tatctgggga 360

tcaaggacga aggctagagt atcgaaagtg attagacacc gctgtagttc tagcagtaaa 420

ctatgccgac aatgctgggt gttgcgagag cgatgcttgg tgtgggagaa atcttagttt 480

tcgggctctg gggatagtac gctcgcaagg gtgaaactta aagcgaaatt gacggaagga 540

cactaccagg agtggattgt gctgcttaat ttaactcaac gcgggaaaac ttaccagggt 600

caagtctatc gtagattgga gacatgaggt agacaagagt ggtgcatggc cgttggaaat 660

tgatggggcg acttttagct taagtgctgg aaccagtgag atcttctaga caggtgttat 720

ttaggcacag gagggagaag gcaataacag gtccgtgatg cccttagata tcctgggcag 780

caagcgcaat acaatatctc ttgagaagac aaagcaattt gagatgagta ggattagctt 840

ttgtaaataa gctatgaatg aggaattcct agtaacagtg tctcatcaag gcattgtgaa 900

tgtgtccctg ttc 913

Claims (10)

1.一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR引物对，其特征在于，所述引物对由HE-F和HE-R组成，所述引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

2.一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物对。

3.根据权利要求2所述的用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：Real-time PCR Mix、阳性标准品和阴性对照物。

4.根据权利要求3所述的用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品是含有绒螯蟹肝胞虫基因片段的重组质粒，所述阴性对照物是双蒸水。

5.根据权利要求4所述的用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，该基因片段长度为162bp，该基因片段的序列如SEQ ID NO:3所示。

6.根据权利要求4所述的用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品的制备方法为：

（1）以绒螯蟹肝胞虫基因组DNA为PCR模板，以引物HE-F和HE-R为PCR引物，将PCR扩增后得到的DNA片段与PMD-18T载体进行连接得到重组质粒；

（2）将连接成功的阳性重组质粒测定浓度，10倍倍比稀释，取连续5个或5个以上不同梯度浓度的重组质粒在优化的反应条件下进行荧光定量PCR扩增，在5个或5个以上不同梯度浓度重组质粒满足扩增效率在90%-105%之间，组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%的条件情况下，将这5个或5个以上不同梯度浓度的重组质粒作为阳性标准品。

7.权利要求2~5任一项所述的实时荧光定量PCR检测试剂盒在绒螯蟹肝胞虫检测方面的应用。

8.一种用于检测绒螯蟹肝胞虫的检测方法，其特征在于，所述检测方法是实时荧光定量PCR方法，所述检测方法步骤为：

（1）从待测样品中提取绒螯蟹肝胞虫基因组DNA；

（2）分别将绒螯蟹肝胞虫基因组DNA和阳性标准品作为模板，在包含权利要求1所述的引物对和荧光染料Real-time PCR Mix的优化反应条件中同时进行实时荧光定量PCR扩增，每个DNA浓度重复3次，以双蒸水作阴性对照；

（3）PCR扩增过程中，荧光定量PCR仪根据阳性标准品扩增产物的荧光信号到达设定域值所经历的循环数生成相应的Ct值，重复多次生成的Ct值取平均值得到△Ct值，以阳性标准品拷贝数的对数值为横坐标，△Ct值为纵坐标建立标准曲线，根据待检品的△Ct值在标准曲线上的位置确定待绒螯蟹肝胞虫的DNA初始浓度。

9.根据权利要求8所述的用于检测绒螯蟹肝胞虫的检测方法，其特征在于，所述优化的反应条件是，反应体系为20μL：Real-time PCR Mix 10.0μL；上游引物0.8μL；下游引物0.8μL；DNA模板2.0μL；ddH₂O6.4μL；反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性12s；53℃退火20s，75.5℃收集荧光5s，40个循环；溶解曲线温度、时间设置为65℃ 5s，95℃ 5min。

10.根据权利要求8所述的用于检测绒螯蟹肝胞虫的检测方法，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR扩增结果的判定标准为：待检品△Ct值为0，阴性对照无△Ct值，表示样品中不含绒螯蟹肝胞虫；待检品△Ct值小于或等于35，阴性对照无△Ct值，表示样品中含有绒螯蟹肝胞虫；待检品△Ct值大于35且小于40，阴性对照无△Ct值，则对该待检品重复检测，重复检测结果无△Ct值则该样品中不含绒螯蟹肝胞虫，重复检测如果得到相同的实验结果则该样品中含有绒螯蟹肝胞虫。