CN111269997A

CN111269997A - 用于同时检测三种微孢子虫的引物组及其应用

Info

Publication number: CN111269997A
Application number: CN202010093114.0A
Authority: CN
Inventors: 姜宏波; 宁梓健; 包杰; 陈启军
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2020-02-14
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2020-06-12
Anticipated expiration: 2040-02-14
Also published as: CN111269997B

Abstract

本发明公开了用于同时检测三种微孢子虫的引物组及其应用，所述引物组包括用于检测肝肠胞虫的第一特异性引物对，用于检测卤虫肠孢子虫的第二特异性引物对以及用于检测河蟹微孢子虫的第三特异性引物对；其中，所述第一特异性引物对是针对虾肝肠胞虫ptp2基因，所述第二特异性引物对是针对卤虫肠孢子虫STPK基因，所述第三引物对是针对河蟹微孢子虫swp7基因。本发明通过多重PCR反应可以快速准确地检测虾蟹中虾肝肠胞虫、卤虫肠孢子虫和河蟹微孢子虫的感染情况，敏感性和特异性较好。

Description

用于同时检测三种微孢子虫的引物组及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测微孢子虫的引物组及其应用。

背景技术

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)可感染多种经济虾类，感染后会造成对虾大小不齐，生长减慢或停止，严重降低养殖经济价值。卤虫肠孢子虫(Enterocytospora Artemiae)发现于水产上常用饵料-卤虫中，会感染经济虾类中华小长臂虾，感染了卤虫肠孢子虫的中华小长臂虾会出现肌肉白浊、肝胰腺糜烂的现象。河蟹微孢子虫(Hepatospora eriocheir)是一种严格细胞内寄生的孢子虫，主要寄生于河蟹的肝胰腺，严重威胁河蟹的健康养殖。上述三种微孢子虫给甲壳动物的养殖造成了很大影响。

目前，鉴于虾蟹类微孢子虫感染的复杂性，越来越多病害的发生不止一种微孢子虫的感染，同时通过临床诊断难以区别。目前常规的检测方法是形态学检测，而微孢子虫个体微小，不易于观察，灵敏性和特异性均较低，容易造成误检。

发明内容

为此，本发明提供用于同时检测三种微孢子虫的引物组及其应用，以解决现有技术中检测的微孢子虫过程复杂，灵敏度、特异性低的问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

用于同时检测三种微孢子虫的引物组，所述引物组包括用于检测肝肠胞虫的第一特异性引物对，用于检测卤虫肠孢子虫的第二特异性引物对以及用于检测河蟹微孢子虫的第三特异性引物对；其中，所述第一特异性引物对是针对核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的虾肝肠胞虫ptp2基因，所述第二特异性引物对是针对核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的卤虫肠孢子虫STPK基因，所述第三特异性引物对是针对核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的河蟹微孢子虫swp7基因。

优选地，所述第一特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；

所述第二特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

所述第三特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明的用于同时检测三种微孢子虫的引物组，在制备下述a)或b)中的应用；

a)PCR扩增虾肝肠胞虫ptp2基因、卤虫肠孢子虫STPK基因和河蟹微孢子虫swp7基因片段的试剂或试剂盒；

b)检测虾肝肠胞虫ptp2基因、卤虫肠孢子虫STPK基因和河蟹微孢子虫swp7基因型的试剂或试剂盒。

优选地，上述引物组，在PCR扩增虾肝肠胞虫ptp2基因、卤虫肠孢子虫STPK基因和河蟹微孢子虫swp7基因片段，或检测虾肝肠胞虫ptp2基因、卤虫肠孢子虫STPK基因和河蟹微孢子虫swp7基因型中的应用；

所述应用中，利用所述第一特异性引物对、第二特异性引物对、第三特异性引物对对待测样品进行三重PCR扩增，分别得到第一PCR扩增产物、第二PCR扩增产物以及第三PCR扩增产物；

将所述第一PCR扩增产物、第二PCR扩增产物、第三PCR扩增产物和虾肝肠胞虫ptp2基因、卤虫肠孢子虫STPK基因和河蟹微孢子虫swp7基因片段标准品进行电泳，若所述第一PCR扩增产物为880bp，判断所述待测样品中含虾肝肠胞虫；

若第二PCR扩增产物为440bp，判断所述待测样品中含卤虫肠孢子虫；

若第三PCR扩增产物为167bp，判断所述待测样品中含河蟹微孢子虫。

优选地，所述三重PCR扩增体系为2×PCR Mix 10μL，第一特异性引物对1μL，第二特异性引物对1μL，第三特异性引物对1μL，待测样品液2μL，DEPC处理水加至20μL。

优选地，所述三重PCR的扩增程序如下：预变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火55℃，30s；延伸72℃，1min；终延伸72℃，10min；其中，变性、退火和延伸为30个循环。

本发明具有如下优点：

本发明根据Genbank中(OQS55341.1、尚未上传、ORD99956.1)的基因序列，分别设计并筛选出三对特异引物，用于虾肝肠胞虫、卤虫肠孢子虫和河蟹微孢子虫的检测。通过多重PCR反应可以快速准确地检测虾蟹中虾肝肠胞虫、卤虫肠孢子虫和河蟹微孢子虫的感染情况，检测的敏感性和特异性较好，比常规PCR经济简便，具有广阔的应用前景。

本发明的多重PCR主要用于多种微孢子虫病原微生物的同时检测或鉴定，具有高效性、系统性、经济简便性等特点。对于微孢子虫的PCR检测步骤简化，对微孢子虫的早期诊断，水产健康养殖都具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引申获得其它的实施附图。

图1为本发明提供的三种微孢子虫提取的DNA模板的PCR扩增产物的电泳图，其中，M：Marker；N：阴性对照；1：河蟹微孢子虫PCR扩增基因片段；2：虾肝肠胞虫PCR扩增基因片段；3：卤虫肠孢子虫PCR扩增基因片段；

图2为本发明提供的三种微孢子虫提取的DNA模板在退火温度分别为55℃和50℃时的PCR扩增产物的电泳图，其中，M：Marker；N：阴性对照；1,3,5：分别为虾肝肠胞虫、卤虫肠孢子虫、河蟹微孢子虫在退火温度为55℃时的PCR扩增基因片段；2,4,6：分别为虾肝肠胞虫、卤虫肠孢子虫、河蟹微孢子虫在退火温度为50℃时的PCR扩增基因片段；

图3为本发明提供的引物组特异性试验PCR产物电泳图，其中，M：Marker；N：阴性对照；1：河蟹微孢子虫扩增基因片段；2：卤虫肠孢子虫扩增基因片段；3：虾肝肠胞虫扩增基因片段；

图4为本发明提供的引物组多重PCR扩增产物的电泳图，其中，M：Marker；N：阴性对照；1,2,3：为三份样品的多重PCR产物电泳泳道；

图5为本发明提供的引物组敏感性检测的PCR产物电泳图，其中，M：Marker；N：阴性对照；1-8为不同样品稀释度的PCR扩增产物的电泳图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、虾肝肠胞虫、卤虫肠孢子虫和河蟹微孢子虫三重PCR的建立一、材料与方法

1、样本：虾肝肠胞虫、卤虫肠孢子虫和河蟹微孢子虫阳性样本均为采自辽宁营口和盘锦，后经实验室分离获得。

2、试剂：DNA提取试剂盒购自天根(北京)生化科技有限公司；PCR Mix和PCR产物回收试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

3、三种微孢子虫DNA的提取

(1)切取不多于30mg的含三种微孢子的组织材料，分别放入装有200μlGA缓冲液的离心管中，涡旋振荡15s。

(2)加入20μLProteinase K(20mg/ml)溶液，涡旋混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。在56℃放置，直至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。

(3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(4)加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱加入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)重复操作步骤7。

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

将得到的三种微孢子虫DNA模板-20℃保藏，同时，将卤虫肠孢子虫DNA送到上海生工生物工程有限公司进行全基因测序，得到全基因序列。

4、引物设计：从GenBank上分别下载虾肝肠胞虫ptp2基因和河蟹微孢子虫swp7基因序列，以及卤虫肠孢子虫STPK基因序列，用Primer 5.0软件设计引物，引物组的名称及序列见表1，表1为多重PCR扩增引物序列。

表1

5、纯化虾肝肠胞虫ptp2基因、卤虫肠孢子虫STPK基因和河蟹微孢子虫swp7基因片段

(1)根据引物合成后的参考温度，对虾肝肠胞虫ptp2基因、卤虫肠孢子虫STPK基因和河蟹微孢子虫swp7基因进行PCR扩增。

(2)DNA电泳结束后，在紫外灯下快速切下含目的DNA片段的凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，并尽量去除多余的凝胶。称取凝胶重量，100mg凝胶等同于100μl体积，作为一个凝胶体积。

(3)加入等倍体积Buffer GDP。50-55℃水浴7-10min，根据凝胶大小适当调整时间，确保凝胶块完全溶解。水浴期间颠倒混匀2次加速溶胶。

(4)短暂离心收集管壁上的液滴。将Fast Mini Columns-G吸附柱置于CollectionTubes 2ml收集管中，把≤700μl溶胶液转移至吸附柱中，12000xg离心30-60s。

(5)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入300μl Buffer GDP至吸附柱中。静置1min。12000xg离心30-60s。

(6)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入600μl BufferGW至吸附柱中。12000xg离心30-60s。

(7)重复步骤5。

(8)弃滤液，把吸附柱置于在1.5ml灭菌的离心管中，加入7-30μl ElutionBuffer至吸附柱中央，放置2min。12000xg离心1min。弃去吸附柱，把DNA模板保存于-20℃。

将三种微孢子虫分别进行PCR扩增，如图1所示，扩增虾肝肠胞虫ptp2基因片段为880bp、扩增卤虫肠孢子虫STPK基因片段为440bp和扩增河蟹微孢子虫swp7基因片段为167bp。分别扩增得到目的基因片段，将得到的PCR产物送测序，测序结果表明各扩增的基因片段序列均正确。

6、多重PCR的建立

引物进行退火温度的确定，进行单个基因的PCR扩增，根据各个引物合成后的参考温度，选取50℃和55℃进行PCR扩增，根据扩增效果确定退火温度。如图2所示，各微孢子虫目的基因在55℃扩增效果最好，最终选择55℃作为多重PCR的退火温度。

多重PCR反应体系为：2×PCR Mix 10μL，第一特异性引物对(10mM)1μL，第二特异性引物对(10mM)1μL，第三特异性引物对(10mM)1μL，3种微孢子虫的DNA模板混合液共2μL，DEPC处理水加至20μL。

多重PCR的扩增程序如下：预变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火55℃，30s；延伸72℃，1min；终延伸72℃，10min；其中，变性、退火和延伸为30个循环。扩增结果如图4所示，多重PCR扩增效果良好。

实施例2、上述引物组检测样品的特异性实验

1、单一引物特异性实验

将三种微孢子虫DNA模板等比例混合，分别加入其中一对引物进行PCR扩增，以检测引物的特异性，结果显示只能扩增出该特异性引物对应的基因。将三种微孢子虫DNA混合后，分别用单一引物进行PCR扩增，结果如图3所示，每对引物均能够扩增出对应的目的基因片段，而不能扩增出其他基因片段。

2、3对引物特异性实验

将三种微孢子虫DNA混合后，向样品中同时加入上述引物组的3对特异性引物对，同时进行PCR扩增，结果显示能同时分别扩增出3种特异性引物对对应的基因片段，表明设计的引物对具有很好的特异性，如图4所示，可以看出能够相应扩增出3种对应的目的基因。如图3和图4所示，本发明中建立的多重PCR方法具有很好的特异性。

实施例4、上述引物组检测样品的敏感性实验

对实施例1切胶回收的PCR产物进行浓度测定，根据DNA拷贝数计算公式分别计算每个样品的拷贝数，结果见表2。

表2

拷贝数＝(6.02×10¹⁴×浓度ng/μL)/(DNA长度×660)

三种微孢子虫DNA模板的拷贝数分别稀释至约5.7×10⁸，5.7×10⁷，5.7×10⁶，5.7×10⁵，5.7×10⁴，5.7×10³，5.7×10²，5.7×10¹，相同拷贝数的三种DNA模板按等比例混合。分别从混合液中取2μL作为模板，进行PCR扩增。

将混合样品按照上述方法进行成比例稀释用于以上建立的多重PCR方法，以检验所建立方法的敏感性，结果如图5所示，表明该方法敏感性较好，最低检出拷贝数为5.7×10²个/μL，如图5中7号泳道。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 用于同时检测三种微孢子虫的引物组及其应用

<130> GG20736052A

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ttattaactt gaattattta ttcgttggat gtt 33

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tttgaaacat gagtctttat aatgcactg 29

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ggggattgat gtagaaac 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atagctcagg tggtctgt 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tatgggatgg tgctaaac 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tccaaatact gagggtgt 18

<210> 7

<211> 855

<212> DNA

<213> Enterocytozoon hepatopenaei

<400> 7

atgagtcttt ataatgcact ggtgctatta actactataa aagcaggaac agtaaacatg 60

cctttgcctg gacaaggaca aaacaatgcg caacaagatc caattgcaag acacattcag 120

gacatgaagg tggaaacaga agaagcaaaa agaagggctg cagcagaatg ccagcagagc 180

ctcatagaga aaaacgtaca ggtagatggt gcacaacaaa aagtagatcc ttctgagttt 240

actgcgtgtg ttgaagcaaa aaagaagaaa ttattccagt tgtcaaagtc aatcaattca 300

ctcattaaaa atgaaatgtc aaagccaatt caaaagccat gcgtggtcaa attaaaccag 360

gcaaccaaaa actgctacac aaaggcagca ctcaaggaat ggctcaaggg ttcaaaatac 420

agtttggatg tgtttaagaa cgtagttgaa atatggaaca cagaaaaaga aaagttgata 480

gcaatgattg ttcatgaaac accaaagtac gagttaattt taccaccaaa agtatgcaag 540

tctttcttta aaagaccttc atataagatg gacgtaaaca gggcaggaga tatgatcaat 600

tcacagggta agcctaacga aaagaaggac attgcaaagg attgcaggcc atgcagcgac 660

tttgctaaca ccacagaagg tgcatttgca gagtgcaaga acacatgcga tccaatgtct 720

atgattgtca atgttagcga tagcatccac acagtacaca ggccaaccac cttaccatct 780

ggtaaagatg accataaaaa gccaactcca tctgaaagtg aaataaacaa tgaaacatta 840

acatccaacg aataa 855

<210> 8

<211> 762

<212> DNA

<213> Enterocytospora Artemiae

<400> 8

taattggctc gggaacatac gcccatgttt atgaggggat tgatgtagaa acaaaaaagg 60

ttgttgctct gagaaaatag aacttaatga gagagaaggg atgccatcaa cggctttgag 120

agaaatttcc atattaaaaa atttaaagca cgaaaatatt atcaatttat tgcaggtgat 180

tcacacagta gaacacctga ctatggttat ggagtttgtt gagtatgact tactgactta 240

cttaagctcg tttgacgatc aaacatattg cctgataaat cagttgatca gtggtgtcca 300

ccatctccat attaacaaaa ttgttcatag agatttgaag cctggaaata ttcttgttac 360

aaaagatggg gtgctaaaaa ttgcgatttt ggattggctc gggttataaa ttctatggac 420

acaggatatt ccccagaggt aattacattg tggtacagac cacctgagct attaaaagga 480

gccacttcat atggatatga ggtggatatt tggagtttag gttgtataat atatgaaatg 540

ataacaaaga agccactatt gcaaggacaa gataagcaaa cacagcttga tttgtgtaat 600

tcactgaata ttgaacattt gggagctgaa ttggccaaaa actatggcgt tcccatattc 660

tttgttgaag ttatcaaagg atgttttgct gtaaatccgg atcacaggat caaagcagat 720

aagatcgtga tgattttaga gaaagtttat tataataaat aa 762

<210> 9

<211> 846

<212> DNA

<213> Hepatospora eriocheir

<400> 9

atggatatca taattataat tatttatata agtaggttag tttcaggtgt tttattagat 60

aaccctaaag aattgttaga acatattaaa ggacaagtca aatatgttga agatgaattt 120

acaggttgtt ctaatgaaaa taaaacttca ataattaact ttaatataca cgtagaaaga 180

gaaatagcac aagcattagt atcaatagct aagtttaata ataatatttc aaatgagttt 240

tttacaagca gaggtaaaga tgctgaaata gaggctatag aatcatattt ttcaacaata 300

tttgatgaat taaataatga tcttatagga tttaaagtac aagtaaatca tataattaat 360

aagaacagta caaaagaaat gactagtaat ggagcaatag atcagtcatg tgaagtactt 420

gatgcagccc aaacaagaac tgaatttgca cataaaaaga atattgaaaa aaataataaa 480

gaagtgggaa taaatctgta tttatttcac tgtatttata gaagtccagc acaaaagaat 540

tcgtttgtaa tagagaaaga gaaatgtgga agaacaatag gaattttatg ggatggtgct 600

aaacacacca gtaattatat taaatcagct gtgattgaag caataactgg attaccaaat 660

gcctatgaaa ctggtaaact cagaacatta tcgaaataca aattatgtaa tttcgttgaa 720

gattgtattt acagcacacc ctcagtattt ggacatgaaa taccacaaat agttagttta 780

caaagaacta aatctaataa aagtgaggat tcttctttag aaagtagcag cagtgatagt 840

aaataa 846

Claims

1.用于同时检测三种微孢子虫的引物组，其特征在于，所述引物组包括用于检测肝肠胞虫的第一特异性引物对，用于检测卤虫肠孢子虫的第二特异性引物对以及用于检测河蟹微孢子虫的第三特异性引物对；其中，所述第一特异性引物对是针对核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示的虾肝肠胞虫ptp2基因，所述第二特异性引物对是针对核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示的卤虫肠孢子虫STPK基因，所述第三特异性引物对是针对核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示的河蟹微孢子虫swp7基因。

2.如权利要求1所述的用于同时检测三种微孢子虫的引物组，其特征在于，

所述第一特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

3.权利要求1或2所述的用于同时检测三种微孢子虫的引物组，在制备下述a)或b)中的应用；

4.权利要求1或2所述的引物组，在PCR扩增虾肝肠胞虫ptp2基因、卤虫肠孢子虫STPK基因和河蟹微孢子虫swp7基因片段，或检测虾肝肠胞虫ptp2基因、卤虫肠孢子虫STPK基因和河蟹微孢子虫swp7基因型中的应用；

5.权利要求4所述的引物组，其特征在于，

所述三重PCR扩增体系为2×PCR Mix 10μL，第一特异性引物对1μL，第二特异性引物对1μL，第三特异性引物对1μL，待测样品液2μL，DEPC处理水加至20μL。

6.权利要求4所述的引物组，其特征在于，

所述三重PCR的扩增程序如下：预变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火55℃，30s；延伸72℃，1min；终延伸72℃，10min；其中，变性、退火和延伸为30个循环。