CN118166123A - 一种长江江豚环境dna引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种长江江豚环境DNA引物及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明所述引物基于长江江豚线粒体基因组微卫星开发，其基序为CAAATT，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还提供了所述DNA引物在进行长江江豚环境DNA检测鉴定长江江豚物种中的应用，并提供了一种鄱阳湖长江江豚环境DNA检测方法。本发明所述引物具有较高的特异性和灵敏度，可用于检测鄱阳湖长江江豚物种，检测效率高，准确度高，检测假阳性的可能性低。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种长江江豚环境DNA引物及其应用。
背景技术
长江江豚是世界上体型最小的鲸类之一。鲸类长期生活在水中，分布广泛，活动能力强，其监测往往面临一些困难，尤其是小型鲸类，出水时间短，体型小，监测尤其困难。而长江江豚成年体长只有1.5米，平均出水时间少于1秒，是野外最难观察的鲸类动物之一，监测准确率低。过去几十年其种群快速衰退至1000头左右，极度濒危，对其种群数量和分布进行监测是促进其保护的关键。而长江江豚种群数量和遗传监测通常是基于直接捕获和视觉观察中获得的数据，难以准确监测。
鄱阳湖是中国第一大淡水湖，生活着近一半的现存江豚种群，其保护对整体江豚物种的保护至关重要。开展有效的鄱阳湖长江江豚监测是实施有效保护的基础，但是其具有明显的季节性吞吐特征，丰枯季节水面波动巨大，一直以来对于长江江豚的监测主要集中在低枯水位时期开展，对其在全年的分布并不十分清晰。同时，鄱阳湖自2020年起禁止生产性渔业捕捞十年，使得直接监测和评估长江江豚种群愈发困难。因此应采用破坏性较小的调查方法，改善对受保护物种的生态监测，并评估种群遗传的现状。
环境DNA也称eDNA，是指生物体在皮肤脱落、排泄物、体表粘液、鳞屑、分泌物、精子、卵子等生理生态过程和个体死亡后细胞破碎新陈代谢过程中释放到水体、空气、冰芯、沉积物等环境中DNA的总称。环境DNA结合测序技术在生物多样性、物种监测、动物食性分析和外来入侵物种检测等方面均具有较好的应用前景。近年来，以线粒体序列为目标对象，利用环境DNA技术分析对鲸豚类进行种群遗传推断成为分子生态热点课题之一。当前关于长江江豚环境DNA已经在长江干流及天鹅洲保护区开展了相关的研究，均证明这是一种有效的监测方式。但目前的长江江豚环境DNA引物基本是围绕线粒体特定基因或区域开发，以能否扩增或测序为检测手段，引物扩增目标序列的数量和种类相对较少，长度相对单一，不能很好满足种群遗传推断和分布调查技术需求。此外，不同水域，由于环境中生物群落组成不同，如采用通用的引物非特异扩增，可能出现较高的监测错误。因此，如何建立用于鄱阳湖长江江豚环境DNA技术体系，提升检测的效率和精度，降低检测假阳性的可能性，是本领域研究的关键。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种长江江豚环境DNA引物，具有较高的特异性和灵敏度。
本发明的目的还在于提供上述DNA引物在进行长江江豚环境DNA检测鉴定长江江豚物种中的应用，可用于检测鄱阳湖长江江豚物种。
本发明的目的还在于提供一种长江江豚环境DNA检测试剂盒。
本发明的目的还在于提供一种鄱阳湖长江江豚环境DNA检测方法，检测效率高，准确度高，检测假阳性的可能性低。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种长江江豚环境DNA引物，所述引物基序为CAAATT，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明提供了上述DNA引物在进行长江江豚环境DNA检测鉴定长江江豚物种中的应用。
优选的，所述长江江豚环境DNA检测为鄱阳湖长江江豚环境DNA检测。
本发明还提供了一种长江江豚环境DNA检测试剂盒，包含上述长江江豚环境DNA引物。
本发明还提供了一种长江江豚环境DNA检测方法，包括以下步骤：采集水样，用微孔滤膜抽滤；采用DNA提取试剂盒提取滤膜上的DNA；利用上述长江江豚环境DNA引物对提取所得DNA进行扩增，对扩增后的产物进行检测。
优选的，所述扩增方法为PCR扩增或qPCR扩增。
优选的，所述PCR扩增的反应体系包括正向引物10μM 1μL，反向引物10μM 1μL，Mix高保真酶25μL，模板DNA 1μL，ddH2O 22μL。
优选的，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸5s，35个循环；72℃延伸5min。
优选的，所述qPCR扩增的反应体系包括正向引物5μM 0.4μL，反向引物5μM 0.4μL，2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 5μL，50×ROX Reference Dye 10.2μL，模板DNA1μL，ddH2O 3μL。
优选的，所述qPCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，35个循环；72℃延伸1min。
本发明的有益效果：
本发明基于生物信息学的方法，以鄱阳湖流域主要鱼类和长江江豚线粒体基因组序列比较分析为基础，围绕特定微卫星序列进行鄱阳湖长江江豚环境DNA引物开发，得到一组长江江豚环境DNA引物，旨在建立用于鄱阳湖长江江豚环境DNA技术体系，可以提升检测的效率和精度，降低检测假阳性的可能性。
附图说明
图1：基序AGAAT的一代测序结果seqlogo图；
图2：基序TACTA的一代测序结果seqlogo图；
图3：基序CAAATT的一代测序结果seqlogo图；
图4：引物YDloop的一代测序结果seqlogo图；
图5：基序CAAATT引物验证扩增曲线；
图6：基序CAAATT引物验证扩增溶解曲线；
图7：无长江江豚的天然水域样本检测结果；
图8：添加草鱼、青鱼、鲢、鳙、鲤和鲫DNA的水体样本检测结果；
图9：添加牛、羊、鸡、鸭和人类DNA的水体样本检测结果；
图10：鄱阳湖长江江豚集中分布水域的水体样本检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种长江江豚环境DNA引物，所述引物基于长江江豚线粒体基因组微卫星开发，其基序为CAAATT，正向引物的核苷酸序列为TAGGGGCCTCCGCTCTAATA，如SEQ IDNO:1所示，反向引物的核苷酸序列为AGATTTGTAGGCCTCGTGCT，如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供了上述DNA引物在进行长江江豚环境DNA检测鉴定长江江豚物种中的应用。CAAATT基序位于长江江豚ND4基因(10213～11590)，产物是NADH脱氢酶亚基4，所述DNA扩增产物长度为123bp，通过该DNA引物可用于鉴定长江江豚物种。本发明所述长江江豚环境DNA检测优选为鄱阳湖长江江豚环境DNA检测。
本发明还提供了一种长江江豚环境DNA检测试剂盒，包含上述长江江豚环境DNA引物。优选的，本发明所述试剂盒还包括DNA提取试剂和扩增原料。作为可选的实施方式，本发明所述试剂盒包括DNA提取试剂、Mix高保真酶和ddH2O；作为另一种可选的实施方式，本发明所述试剂盒包括DNA提取试剂、2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix、50×ROXReference Dye 1和ddH2O。
本发明还提供了一种鄱阳湖长江江豚环境DNA检测方法，包括以下步骤：采集鄱阳湖水样，用微孔滤膜抽滤；采用DNA提取试剂盒提取滤膜上的DNA；利用上述长江江豚环境DNA引物对提取所得DNA进行扩增，对扩增后的产物进行检测。
本发明所述扩增方法可选为PCR扩增或qPCR扩增。
当扩增方法为PCR扩增时，所述PCR扩增的反应体系包括正向引物10μM 1μL，反向引物10μM 1μL，Mix高保真酶25μL，模板DNA 1μL，ddH2O22μL。所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸5s，35个循环；72℃延伸5min。
当扩增方法为qPCR扩增时，所述qPCR扩增的反应体系包括正向引物5μM 0.4μL，反向引物5μM 0.4μL，2×ChamQ SYBR Color qPCRMasterMix5μL，50×ROX Reference Dye10.2μL，模板DNA 1μL，ddH2O 3μL。所述qPCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，35个循环；72℃延伸1min。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、鄱阳湖长江江豚环境DNA引物开发
根据鄱阳湖鱼类监测及查阅相关文献资料，得到鄱阳湖常见鱼类86种。用拉丁名在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中搜索下载长江江豚的线粒体全基因组序列和其他常见鱼类的线粒体全基因组序列，共得到81条线粒体基因组序列。
采用MISA软件对81条全基因组序列中的1～6核苷酸重复类型SSR进行检索，检索标准只包括完美型SSR重复单元，检索标准为单碱基重复大于10次，二碱基重复大于6次，三和四碱基大于5次，五和六碱基大于2次，并统计线粒体全基因组微卫星分布基本特征。同时考虑到长江江豚在野外环境的中种群密度低，降解程度高，设计的鄱阳湖长江江豚环境DNA目标序列为200bp以内。采用Primer 3.0软件进行引物设计，共合成8组DNA引物，详细内容见表1。
表1鄱阳湖长江江豚环境DNA引物
引物基序为AGAAT的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。引物基序为ATACT的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。引物基序为TACTA的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。引物基序为ACCTC的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。引物基序为TTTAA的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。引物基序为GCATCC的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。引物基序为CAAATT的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。引物基序为CATCCT的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
除了合成上述8对引物外，再合成一对已有文献报道的引物作为对照，记为引物YDloop，即F：5′-TATGTCCACTAGCCCTTCATAACCATTA-3′(如SEQ ID NO:17所示)；R：5′-AGATCATTATTTAGCTACCCCCACAAGC-3′(如SEQ ID NO:18所示)。
引物由上海生工生物有限公司合成，并置于-20℃保存。
2、长江江豚肌肉组织DNA提取
实验所用肌肉组织来源于江西省水生生物保护中心存储的2022年长江干流及鄱阳湖搁浅死亡的5头长江江豚，于实验室-20℃冰箱保存。
长江江豚肌肉组织基因组DNA的提取方法采用DP304-02天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，按照说明书方法并加以改进，具体的实验操作步骤如下：
(1)称取肌肉组织30～50mg于1.5ml离心管中，加入200μLBuffer GA，加入磁珠，采用高通量组织研磨机制成匀浆，短暂离心除去泡沫。
(2)加入4μL RNaseA溶液(100mg/ml)，涡旋振荡15s，室温静置10min。
(3)加入20μL Proteinase K溶液，充分混匀后放入56℃水浴锅中温浴3h，直至组织溶解；取出短暂离心去除管盖内壁的水珠。
(4)加入200μL缓冲液Buffer GB，颠倒混匀后置于70℃温浴10min，取出短暂离心。
(5)加入200μL无水乙醇，涡旋振荡15s，将所得溶液全部吸入吸附柱CB3中，12000r/min离心30s，倒掉废液。
(6)加入500μL缓冲液Buffer GD，12000r/min离心30s，倒掉废液。
(7)加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心30s，倒掉废液，并重复漂洗一次，将废液倒掉，再12000r/min离心2min。
(8)将吸附柱置于室温10min挥发乙醇。
(9)将吸附柱CB3转入一只干净的离心管，加入50μL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000r/min离心2min，收集所得溶液。
(10)为提高DNA得率，将所得溶液重复洗脱一次，收集溶液，编号，并置于-20℃冰箱保存。
3、PCR扩增
以步骤2提取得到的5头长江江豚DNA作模板进行PCR反应，PCR反应体系为50μL：正向引物10μM 1μL，反向引物10μM 1μL，Mix高保真酶25μL，模板DNA 1μL，ddH2O 22μL。为了强化PCR扩增的可靠性，选择其中1对引物进行平行实验，即每个样品至少进行17次扩增反应，对于不可靠不清晰的实验结果进行重复实验。此外，采取1：1：1：1：1的方式将5头长江江豚样品的DNA混合进行扩增。将上述混合液加入PCR仪中，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸5s，35个循环；72℃延伸5min。
采用琼脂糖凝胶电泳法对PCR扩增后的产物进行检测。
通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测表明，本实验有4对引物(基序AGAAT、TACTA、CAAATT和引物YDloop)在5个长江江豚引物中均扩增成功，电泳条带单一明亮、无杂带，且其测序结果与预期结果一致，说明所开发引物特异性良好，而另外5对引物(基序CATCCT、ACCTC、TTTAA、ATACT和GCATCC)特异性不行，扩增不稳定或长度不符合。5个样品的DNA混合样也成功进行了扩增，其测序结果与预期结果一致。
4、测序
将步骤3中扩增成功的扩增产物送至生工(武汉)一代测序(基序AGAAT、TACTA、CAAATT和引物YDloop)。
基序AGAAT的一代测序结果seqlogo图见图1，基序TACTA的一代测序结果seqlogo图见图2，基序CAAATT的一代测序结果seqlogo图见图3，引物YDloop的一代测序结果seqlogo图见图4。分析3对特异性良好的扩增序列信息，发现仅有基序CAAATT微卫星在5个扩增样品中均存在。
5、qPCR
进一步采用荧光定量PCR(qPCR)验证引物特异性。
使用美国Applied Biosystems生产的ABI7300型荧光定量PCR仪，采用南京诺唯赞生物科技有限公司出品的ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix(2X)定量PCR试剂进行qPCR反应。qPCR反应产物溶解曲线如为单峰图则表示PCR扩增产物的单一性。具体反应组分及体系如下。
(1)标准品制备：
PCR扩增→PCR产物纯化、质检→与克隆载体连接→蓝白斑筛选→质粒提取→测序鉴定
(2)制备标准曲线样本：
OD260的值的测定：构建好特异性良好的目标基序CAAATT引物的相关质粒，经测序鉴定无误后用紫外分光光度计(NanoDrop2000，Thermo Fisher Scientific，美国)测定质粒OD260的值，通过公式换算成拷贝数(copies/μl)，质粒载体为pMD18-T，2692bp；质粒起始拷贝数换算公式(copies/μl)＝浓度(ng/μl)*10-9*6.02*1023/(分子量*660)，其中分子量是指载体加上目的序列；10倍梯度稀释构建好的各质粒，90μl稀释液+10μl质粒，一般做4～6个点，即基序CAAATT引物相关质粒浓度(ng/μl)和拷贝数(copies/μl)分别为190.4和6.148E+10。通过预实验分别选取基序CAAATT标准品的10-5～10-8稀释液用于制备标准曲线。
(3)荧光定量PCR检测：配制qPCR扩增反应体系，具体见表2，在ABI7300型荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)设置qPCR扩增反应参数，把加好样本的96孔板放在ABI7300型荧光定量PCR仪中进行反应，具体见表3，其中qPCR试剂采用ChamQ SYBR ColorqPCRMasterMix(2X)，南京诺唯赞生物科技有限公司。
表2qPCR扩增反应体系及用量
表3qPCR扩增反应参数
目标基序CAAATT的标准曲线的相关系数分别为R2＝0.9984，回归方程为Y＝-3.248X+39.08；说明其在稀释的质粒标准品浓度范围内均具有良好的线性关系，所建立的标准曲线能够正确地反映出长江江豚线粒体相关序列的扩增。
基序CAAATT引物验证扩增曲线见图5，基序CAAATT引物验证扩增溶解曲线见图6。对基序CAAATT引物进行qPCR验证发现，该引物扩增曲线单峰且光滑，具有明显的指数增长期及平台期，平行样本间一致性较高，提示基序CAAATT引物具有高特异性。此外，基序AGAAT和TACTA相关的2对引物特异性差。
实施例2
1、水样采集
为保证采集样本中明确无长江江豚DNA，在江西省南昌市瑶湖水域，从表层水体水面以下(0.3～0.6m)采集水样，放置于全新1L可密封的广口瓶。采集器在使用前需经过10％漂白粉溶液消毒，无菌水冲洗并干燥；采集人员佩戴一次性手套，取样后更换。水样使用真空泵现场抽滤或冷藏条件下运送回实验室抽滤。滤膜置于2mL EP管中,保存在液氮中直至DNA提取。
2、DNA提取
保存的滤膜取出干燥后剪碎，使用OMEGA公司的Water DNAKit提取DNA，提取过程中90℃水浴溶解难溶细胞，最后加入50μL Elution Buffer洗脱，提高eDNA样品的浓度，置于-20℃冷冻保存。
3、PCR扩增
以提取的环境DNA作模板进行PCR反应，PCR反应体系为50μL：正向引物10μM 1μL，反向引物10μM 1μL，Mix高保真酶25μL，模板DNA 1μL，ddH2O 22μL。正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示。采用琼脂糖凝胶电泳法对PCR扩增后的产物进行检测，结果见图7。
图7中10个环境DNA样本的PCR结果均为阴性，而江西省南昌市瑶湖水域为无长江江豚的天然水域，表明本发明所述长江江豚环境DNA引物假阳性率较低。
实施例3
在水体中添加草鱼、青鱼、鲢、鳙、鲤和鲫肌肉得到的10个环境DNA模拟样品实验：
1、水样采集
取2L无菌水于储水器中，分别加入草鱼、青鱼、鲢、鳙、鲤和鲫肌肉各10g左右，静置30min，取表层水体放置于全新1L可密封的广口瓶。储水器在使用前需经过10％漂白粉溶液消毒,无菌水冲洗并干燥；采集人员佩戴一次性手套，取样后更换，水样使用真空泵抽滤，滤膜置于2mL EP管中，保存在液氮中直至DNA提取。
2、DNA提取
保存的滤膜取出干燥后剪碎，使用OMEGA公司的Water DNAKit提取DNA，提取过程中90℃水浴溶解难溶细胞，最后加入50μL Elution Buffer洗脱，提高eDNA样品的浓度，置于-20℃冷冻保存。
3、PCR扩增
以提取的环境DNA作模板进行PCR反应，PCR反应体系为50μL：正向引物10μM 1μL，反向引物10μM 1μL，Mix高保真酶25μL，模板DNA 1μL，ddH2O 22μL。正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示。采用琼脂糖凝胶电泳法对PCR扩增后的产物进行检测，结果见图8。
图8中10个环境DNA样本的PCR结果均为阴性，表明本发明所述长江江豚环境DNA引物假阳性率较低，草鱼、青鱼、鲢、鳙、鲤和鲫的DNA不会造成假阳性现象。
实施例4
在水体中添加牛、羊、鸡和鸭肌肉以及人类血液样品得到的10个环境DNA模拟样品实验：
1、水样采集
取2L无菌水于储水器中，分别加入牛、羊、鸡和鸭肌肉肌肉各10g左右以及个人血液10ml左右，静置30min，取表层水体放置于全新1L可密封的广口瓶。储水器在使用前需经过10％漂白粉溶液消毒，无菌水冲洗并干燥；采集人员佩戴一次性手套，取样后更换。水样使用真空泵抽滤，滤膜置于2mLEP管中，保存在液氮中直至DNA提取。
2、DNA提取
保存的滤膜取出干燥后剪碎，使用OMEGA公司的Water DNAKit提取DNA，提取过程中90℃水浴溶解难溶细胞，最后加入50μL Elution Buffer洗脱，提高eDNA样品的浓度，置于-20℃冷冻保存。
3、PCR扩增
以提取的环境DNA作模板进行PCR反应，PCR反应体系为50μL：正向引物10μM 1μL，反向引物10μM 1μL，Mix高保真酶25μL，模板DNA 1μL，ddH2O 22μL。正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示。采用琼脂糖凝胶电泳法对PCR扩增后的产物进行检测，结果见图9。
图9中10个环境DNA样本的PCR结果均为阴性，表明本发明所述长江江豚环境DNA引物假阳性率较低，牛、羊、鸡和鸭和人的DNA不会造成假阳性现象。
实施例5
本实施例采集鄱阳湖水进行长江江豚环境DNA检测：
1、水样采集
在考察船关闭发动机数分钟后，从表层水体水面以下(0.3～0.6m)采集水样，放置于全新1L可密封的广口瓶。采集器在使用前经过10％漂白粉溶液消毒，无菌水冲洗并干燥；采集人员佩戴一次性手套，取样后更换。水样使用真空泵现场抽滤或冷藏条件下运送回实验室抽滤。滤膜置于2mL EP管中，保存在液氮中直至DNA提取。
从鄱阳湖长江江豚集中分布水域的不同经纬度区域分别取水样，共取10组。
2、DNA提取
保存的滤膜取出干燥后剪碎，使用OMEGA公司的Water DNAKit提取DNA，提取过程中90℃水浴溶解难溶细胞，最后加入50μL Elution Buffer洗脱，提高eDNA样品的浓度，置于-20℃冷冻保存。
3、PCR扩增
以提取的环境DNA作模板进行PCR反应，PCR反应体系为50μL：正向引物10μM 1μL，反向引物10μM 1μL，Mix高保真酶25μL，模板DNA 1μL，ddH2O 22μL。正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示。采用琼脂糖凝胶电泳法对PCR扩增后的产物进行检测，结果见图10。
图10中10个环境DNA样本的PCR结果，第1、2、3、4、5、6、8、9和10组显示均为阳性，第7组显示为阴性。
对阳性组的扩增产物送至生工(武汉)一代测序，发现其与长江江豚线粒体中基序CAAATT的微卫星序列信息相匹配；对阴性组的扩增产物和水样DNA样本送至生工(武汉)一代测序，发现其与长江江豚线粒体中基序CAAATT的微卫星序列信息不相匹配。
Claims (10)
1.一种长江江豚环境DNA引物，其特征在于，所述引物基序为CAAATT，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的DNA引物在进行长江江豚环境DNA检测鉴定长江江豚物种中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述长江江豚环境DNA检测为鄱阳湖长江江豚环境DNA检测。
4.一种长江江豚环境DNA检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述长江江豚环境DNA引物。
5.一种长江江豚环境DNA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：采集水样，用微孔滤膜抽滤；采用DNA提取试剂盒提取滤膜上的DNA；利用权利要求1所述长江江豚环境DNA引物对提取所得DNA进行扩增，对扩增后的产物进行检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述扩增方法为PCR扩增或qPCR扩增。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包括正向引物10μM 1μL，反向引物10μM 1μL，Mix高保真酶25μL，模板DNA 1μL，ddH2O 22μL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸5s，35个循环；72℃延伸5min。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述qPCR扩增的反应体系包括正向引物5μM 0.4μL，反向引物5μM 0.4μL，2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 5μL，50×ROXReference Dye 10.2μL，模板DNA 1μL，ddH2O 3μL。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述qPCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，35个循环；72℃延伸1min。
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| CN113151500A (zh) * | 2021-04-30 | 2021-07-23 | 南京大学 | 一种基于环境dna的长江江豚检测试剂盒及其应用 |
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