CN114507741B - 快速鉴别海马多鞭丸中五种动物药材的分子生物学方法 - Google Patents

快速鉴别海马多鞭丸中五种动物药材的分子生物学方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种快速鉴别海马多鞭丸中五种名贵动物中药材海马、鹿茸、雀脑、蛤蚧和牛鞭的各自特异性引物。本发明还公开了一种快速分别鉴别海马多鞭丸中五种名贵动物药材海马、鹿茸、雀脑、蛤蚧和牛鞭的分子生物学方法，即运用某一特异性引物，以海马多鞭丸样品（DNA）为一次PCR反应的模板，并以一次PCR反应产物作为二次PCR反应的模板，扩增得到某一特异片段进而特异鉴别某一味药材。本发明可以准确、快速鉴定海马多鞭丸中的名贵药材，为其质量提供保障。

Description

快速鉴别海马多鞭丸中五种动物药材的分子生物学方法
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速鉴定海马多鞭丸中五种动物药材（海马、鹿茸、雀脑、蛤蚧和牛鞭）的分子生物学方法。
背景技术
海马多鞭丸（国药准字Z21021322）收载于《卫生部药品标准-中药成方制剂》中，该制剂由海马、蛤蚧、韭菜子、锁阳、鹿茸（去毛）、补骨脂（制）、小茴香（制）、菟丝子、沙苑子等34味药原粉入药组成。具有补肾壮阳，添精增髓的功效。临床上用于气血两亏，面黄肌瘦，梦遗滑精，早泄，阳痿不举，腰腿酸痛。
目前海马多鞭丸的鉴别（WS3-B-2607-97）标准主要采取显微镜观察的方式进行，主要对成品中的淀粉粒、种皮表皮细胞形状和直径大小及纤维情况进行鉴别。但是形态学方面药材部位特征简单，准确鉴定较为困难；同时由于海马多鞭丸中存在34味中药材，通过显微镜观察的方式很显然无法实现对所有的药材进行鉴别，特别是对其中的一些贵细药材海马、鹿茸和蛤蚧无法进行有效地鉴别。贵细药材由于本身野生资源匮乏，来之不易，物稀量少、疗效显著，因而价值极高，市场上出现伪品和混淆品较多。因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统显微镜观察鉴别方法的缺陷。
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术具有灵敏度高、特异性强、高速快速等特点，再加上特异性引物可扩增得到物种特异性的条带，用此检测方法可不受形态的控制。
近年来虽然PCR技术在海马、鹿茸、蛤蚧等及其伪品的鉴定方面得到了广泛运用，但缺乏从复方中成药中（包含多种不同动物药材）鉴定某一种动物药材方面的研究。本发明即提供了一种高效便捷的分子检测方法，利用特异性引物，根据预期DNA条带的有无来鉴定海马多鞭丸中5种动物药材，可以准确、快速鉴定海马多鞭丸中的名贵动物药材，为其质量提供保障。
发明内容
本发明的目的是提供特异性引物鉴定海马多鞭丸中5种动物药材（海马、鹿茸、雀脑、蛤蚧和牛鞭）、含有其的试剂盒及应用。
为了实现本发明目的，本发明根据海马、梅花鹿或马鹿、麻雀、蛤蚧和牛的线粒体DNA序列，设计筛选得到五对特异性引物，其包括：
1）海马特异性Cytb引物，其特征在于，其序列是：
正向引物1F: 5’-TGCCCTTGTAGACCTSCCT-3’；
反向引物1R: 5’-GCAAATRTGTGTTACTGAAGAGAA-3’
2）鹿茸特异性Cytb引物，其特征在于，其序列是：
正向引物2F: 5’-GCAAACGGGGCATCAAT-3’；
反向引物2R: 5’-AAGCAGGTCTGGTGCGAAT-3’
3）雀脑特异性COI引物，其特征在于，其序列是：
正向引物3F: 5’-GCTACTCACCGACCGCAA-3’；
反向引物3R: 5’-TTATAGTGGCGGATGTGAAGTAG-3’
4）蛤蚧特异性Cytb引物，其特征在于，其序列是：
正向引物4F: 5’-ATCCGAGATGTCCACTA-3’；
反向引物4R: 5’-AAGTATGGGTGAAATGG -3’
5）牛鞭特异性COI引物，其特征在于，其序列是：
正向引物5F: 5’-CGTAGTTGTAACCGCAC-3’；
反向引物5R: 5’-GCTAAGTGTAAAGAGAARATG-3’
本发明还提供含有引物1F~5F和1R~5R，以及含有引物1F~5F和1R~5R的试剂盒在检测鉴定海马多鞭丸中海马、鹿茸、雀脑、蛤蚧和牛鞭的应用。
本发明还提供一种海马多鞭丸中海马(1F1R)、鹿茸(2F2R)、雀脑(3F3R)、蛤蚧(4F4R)和牛鞭(5F5R)的特异性PCR检测方法,包括以下步骤：
1）供试品前处理；
2）提取样品DNA；
3）以步骤2）提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物1F~5F和1R~5R进行PCR扩增反应；
4）分析PCR产物。
一次PCR反应体系以20ul计为：2×Taq PCR PreMix 10 ul、模板DNA（海马多鞭丸药品DNA）6.0 ul、正，反向引物（10umol/L）各1.0 ul (1F1R、3F3R、4F4R、5F5R)或各0.8ul（2F2R）、无菌双蒸水补足至20ul。二次PCR反应体系以20ul计为：2×Taq PCR PreMix 10ul、模板DNA（一次PCR产物） 2.5~3.5 ul、正，反向引物（10umol/L）各1.0 ul (1F1R、3F3R、4F4R、5F5R)或各0.8ul（2F2R）、无菌双蒸水补足至20ul。
PCR扩增反应条件为：94℃ 预变性 5 min；94℃ 变性 30 s；50℃（海马、牛鞭、蛤蚧）、55℃（雀脑）、60℃（鹿茸） 20 s；35个循环。
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现大小为与163bp（海马）、501bp（鹿茸）、301bp（雀脑）、464bp（蛤蚧）和294bp（牛鞭）的DNA条带，则判定海马多鞭丸中含有海马、鹿茸、雀脑、蛤蚧和牛鞭。
本发明的有益效果在于：
本发明根据GenBank中公布的线粒体基因组COI基因：东北梅花鹿GU457433.1；华南梅花鹿HQ832482.1；马鹿KP172593.1；刺海马NC_021454.1；三斑海马KJ956892.1；线纹海马NC_022722.1；黑顶麻雀NC_029344.1；家麻雀KM078784.1；树麻雀NC_024821.1；蛤蚧AY282753.1；牦牛KR106993.1；普通牛AF492351.1；水牛AY488491.1；黄喉貂KM347744.1；美洲貂HM106324.1；日本貂NC_009678.1；石貂HM106325.1；松貂NC_021749.1；鱼貂HM106327.1；紫貂FJ429093.1；狗KF907307.1；驴MG931481.1，以及Cytb基因：东北梅花鹿GU457433.1；华南梅花鹿HQ832482.1；马鹿KP172593.1；刺海马NC_021454.1；三斑海马KJ956892.1；线纹海马NC_022722.1；黑顶麻雀NC_029344.1；家麻雀KM078784.1；树麻雀NC_024821.1；蛤蚧AY282753.1；牦牛KR106993.1；普通牛AF492351.1；水牛AY488491.1；黄喉貂KM347744.1；美洲貂HM106324.1；日本貂NC_009678.1；石貂HM106325.1；松貂NC_021749.1；鱼貂HM106327.1；紫貂FJ429093.1；狗KF907307.1；驴MG931481.1，设计五对特异性引物，包括海马1F1R、鹿茸2F2R、雀脑3F3R、蛤蚧4F4R、牛鞭5F5R。
本发明在海马多鞭丸中的药材检测方面具有很高的价值。本发明不仅节约时间而且准确性高，而且在实际应用中具有重要的意义。本发明利用PCR检测技术，由特异性引物扩增得到特异性单一条带，操作简单，具有高效、价廉、特异性强的特点，提高了检测的准确性。
附图说明
图1为本发明实施例1中海马药材特异性PCR扩增后电泳检测结果；其中“M”代表DNA Marker，“-”代表阴性对照，1-5分别为海马药材DNA、鹿茸药材DNA、雀脑药材DNA、蛤蚧药材DNA和牛鞭药材DNA。
图2为本发明实施例1中鹿茸药材特异性PCR扩增后电泳检测结果；其中“M”代表DNA Marker，“-”代表阴性对照，1-5分别为鹿茸药材DNA、海马药材DNA、雀脑药材DNA、蛤蚧药材DNA和牛鞭药材DNA。
图3为本发明实施例1中雀脑药材特异性PCR扩增后电泳检测结果；其中“M”代表DNA Marker，“-”代表阴性对照，1-5分别为雀脑药材DNA、海马药材DNA、鹿茸药材DNA、蛤蚧药材DNA和牛鞭药材DNA。
图4为本发明实施例1中蛤蚧药材特异性PCR扩增后电泳检测结果；其中“M”代表DNA Marker，“-”代表阴性对照，1-5分别为蛤蚧药材DNA、海马药材DNA、鹿茸药材DNA、雀脑药材DNA和牛鞭药材DNA。
图5为本发明实施例1中牛鞭药材特异性PCR扩增后电泳检测结果；其中“M”代表DNA Marker，“-”代表阴性对照，1-5分别为牛鞭药材DNA 、海马药材DNA、鹿茸药材DNA、雀脑药材DNA和蛤蚧药材DNA。
图6为本发明实施例2中海马多鞭丸中五种动物药材成分海马、鹿茸、雀脑、蛤蚧和牛鞭特异性PCR扩增后电泳检测结果；其中“M”代表DNA Marker，“-”代表阴性对照，1-1、1-2、1-3、1-4和1-5：海马多鞭丸的一次PCR(海马、鹿茸、蛤蚧、雀脑、和牛鞭);2-1、2-2、2-3、2-4和2-5：海马多鞭丸的二次PCR(海马、鹿茸、蛤蚧、雀脑、和牛鞭);3-1、3-2、3-3、3-4和3-5：阳性对照（药材海马、鹿茸、蛤蚧、雀脑、和牛鞭）。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规试验条件，如Smabrook等分子克隆实验手册（J Sambrook, David RussellMolecular Cloning A Laboratory Manual Third Edition，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1海马、鹿茸、雀脑、蛤蚧和牛鞭五种动物药材特异性PCR扩增
1、供试品前处理
试验样本在基因组制备前，首先使用75%乙醇擦拭样本表面消除外源性污染，待乙醇挥发后，选取适当位置组织进行充分磨碎后作为基因组提取样本。
2、五种动物药材基因组DNA的制备
采用DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit-北京天根生化科技有限公司）提取海马、鹿茸、雀脑、蛤蚧和牛鞭五种药材的模板DNA，储存于-20°C冰箱备用。
3、五种动物药材特异性引物合成
从NCBI中下载海马、鹿茸、雀脑、蛤蚧和牛鞭五种药材线粒体基因组的COI和Cytb基因序列。COI基因GenBank基因登录号：东北梅花鹿GU457433.1；华南梅花鹿HQ832482.1；马鹿KP172593.1；刺海马NC_021454.1；三斑海马KJ956892.1；线纹海马NC_022722.1；黑顶麻雀NC_029344.1；家麻雀KM078784.1；树麻雀NC_024821.1；蛤蚧AY282753.1；牦牛KR106993.1；普通牛AF492351.1；水牛AY488491.1；黄喉貂KM347744.1；美洲貂HM106324.1；日本貂NC_009678.1；石貂HM106325.1；松貂NC_021749.1；鱼貂HM106327.1；紫貂FJ429093.1；狗KF907307.1；驴MG931481.1。Cytb基因登录号：东北梅花鹿GU457433.1；华南梅花鹿HQ832482.1；马鹿KP172593.1；刺海马NC_021454.1；三斑海马KJ956892.1；线纹海马NC_022722.1；黑顶麻雀NC_029344.1；家麻雀KM078784.1；树麻雀NC_024821.1；蛤蚧AY282753.1；牦牛KR106993.1；普通牛AF492351.1；水牛AY488491.1；黄喉貂KM347744.1；美洲貂HM106324.1；日本貂NC_009678.1；石貂HM106325.1；松貂NC_021749.1；鱼貂HM106327.1；紫貂FJ429093.1；狗KF907307.1；驴MG931481.1。
采用DNAMAN软件进行多序列对比，分析不同物种的COI和Cytb特异性片段，分别设计引物信息见表1。
表1.海马多鞭丸中海马、鹿茸、雀脑、蛤蚧和牛鞭五种药材特异性引物
4、PCR扩增
反应体系为20ul，包括：2×Taq PCR PreMix 10ul、模板DNA 1.0 ul（海马、雀脑、蛤蚧）或2ul (鹿茸、牛鞭)、正，反向引物（10umol/L）各1.0 ul (2F2R、5F5R) 或 0.5 ul(1F1R、3F3R、4F4R)、无菌双蒸水补至20ul。
PCR的反应条件为：94℃ 预变性5 min；94℃ 变性30 s；50℃（蛤蚧）、55℃（海马、雀脑、牛鞭）、65℃（鹿茸） 20 s；35个循环。PCR扩增仪型号为美国Applied Biosystems9700型。
5、PCR产物鉴定
取PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1-5所示，仅有1泳道分别扩增出163bp（海马）、501bp（鹿茸）、301bp（雀脑）、464bp（蛤蚧）和294bp（牛鞭）的目的条带，说明本发明的引物特异性强。产物进行测序，其序列如序列表1所示。
实施例2海马多鞭丸中海马、鹿茸、雀脑、蛤蚧和牛鞭五种动物药材特异性PCR扩增。
1、供试品前处理
试验样本在基因组制备前，将20丸药丸碾碎混匀。
2、海马多鞭丸基因组DNA的制备
采用DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit-北京天根生化科技有限公司）提取海马多鞭丸的模板DNA，储存于-20°C冰箱备用。
3、五种动物药材特异性引物合成
使用实施例1中的引物。
4、PCR扩增
一次PCR反应体系以20ul计为：2×Taq PCR PreMix 10 ul、模板DNA（海马多鞭丸药品DNA）6.0 ul、正，反向引物（10umol/L）各1.0 ul (1F1R、3F3R、4F4R、5F5R)或各0.8ul（2F2R）、无菌双蒸水补足至20ul。二次PCR反应体系以20ul计为：2×Taq PCR PreMix 10ul、模板DNA（一次PCR产物） 2.5~3.5 ul、正，反向引物（10umol/L）各1.0 ul (1F1R、3F3R、4F4R、5F5R)或各0.8ul（2F2R）、无菌双蒸水补足至20ul。
PCR扩增反应条件为：94℃ 预变性 5 min；94℃ 变性 30 s；50℃（海马、牛鞭、蛤蚧）、55℃（雀脑）、60℃（鹿茸） 20 s；35个循环。
5、PCR产物鉴定
取PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图6示，泳道1-2（163bp）、2-2（501bp）、3-2(464bp)、4-2(301bp)和5-2（294bp）分别扩增出与对照药材泳道1-3（163bp）、2-3（501bp）、3-3（464bp）、4-3（301bp）和5-3（294bp）大小一致的条带，说明本发明的引物特异性强，能够在海马多鞭丸中单一扩增和鉴定出海马、鹿茸、蛤蚧、雀脑和牛鞭。对泳道1-2、2-2、3-2、4-2和5-2产物进行测序，其序列如序列表2所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进，均落入本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 沈阳清宫药业集团有限公司
<120> 快速鉴别海马多鞭丸中五种动物药材的分子生物学方法
<130> 1
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgcccttgta gacctscct 19
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcaaatrtgt gttactgaag agaa 24
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcaaacgggg catcaat 17
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aagcaggtct ggtgcgaat 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gctactcacc gaccgcaa 18
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttatagtggc ggatgtgaag tag 23
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atccgagatg tccacta 17
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 8
aagtatgggt gaaatgg 17
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgtagttgta accgcac 17
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gctaagtgta aagagaarat g 21

Claims (7)

1.海马多鞭丸中五种动物药材特异性引物，其特征在于，包括：
1)海马特异性Cytb引物，
其序列是：
正向引物1F:5’-TGCCCTTGTAGACCTSCCT-3’；
反向引物1R:5’-GCAAATRTGTGTTACTGAAGAGAA-3’
2)鹿茸特异性Cytb引物，其序列是：
正向引物2F:5’-GCAAACGGGGCATCAAT-3’；
反向引物2R:5’-AAGCAGGTCTGGTGCGAAT-3’
3)雀脑特异性COI引物，其序列是：
正向引物3F:5’-GCTACTCACCGACCGCAA-3’；
反向引物3R:5’-TTATAGTGGCGGATGTGAAGTAG-3’
4)蛤蚧特异性Cytb引物，其序列是：
正向引物4F:5’-ATCCGAGATGTCCACTA-3’；
反向引物4R:5’-AAGTATGGGTGAAATGG-3’
5)牛鞭特异性COI引物，其序列是：
正向引物5F:5’-CGTAGTTGTAACCGCAC-3’；
反向引物5R:5’-GCTAAGTGTAAAGAGAARATG-3’。
2.用于检测海马多鞭丸中海马、鹿茸、雀脑、蛤蚧和牛鞭的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.根据权利要求1所述引物或者权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测海马多鞭丸中海马、鹿茸、雀脑、蛤蚧和牛鞭中的应用。
6.海马多鞭丸中海马、鹿茸、雀脑、蛤蚧和牛鞭的特异性PCR检测方法，其特征在于，
包括以下步骤：
1)供试品前处理；
2)提取样品DNA；
3)以步骤2)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行两次PCR扩增反应；一次PCR反应体系以20μl计为：2×Taq PCR PreMix用量10μl、模板DNA采用海马多鞭丸药品DNA用量6.0μl、10μmol/L的1F1R、3F3R、4F4R、5F5R作为正反向引物，用量各1.0μl，或采用10μmol/L的2F2R为正反向引物，用量各0.8μl、无菌双蒸水补足至20μl；二次PCR反应体系以20μl计为：2×Taq PCR PreMix用量10μl、一次PCR产物作为模板DNA，用量2.5～3.5μl，浓度为10μmol/L的1F1R、3F3R、4F4R、5F5R作为正反向引物各1.0μl，或10μmol/L的2F2R为正反向引物各0.8μl、无菌双蒸水补足至20μl；
4)分析PCR产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s；1F1R、4F4R、5F5R的退火温度为50℃，3F3R的退火温度为55℃，2F2R的退火温度为60℃，退火时间为20s；35个循环。
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