CN111434781A - 一种康复新液的pcr鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种康复新液的PCR鉴定方法，使用该方法进行聚合酶链式反应(PCR)扩增出美洲大蠊COI基因序列(140bp)，PCR产物经过琼脂糖胶进行验证后送至测序公司进行测序，将测序结果通过手工校对、序列拼接，并与公开序列进行比对，如果与所述基因序列SEQ ID NO.1的一致性在99％以上，即可判断所述的样品为美洲大蠊来源。本发明采用了可靠的PCR鉴定技术，快速、准确地实现了对康复新液的快速鉴定，增强了准确性和可靠性，确保了康复新液以美洲大蠊作为药材入药的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及中药及中药材、中药提取物鉴定技术领域，特别是一种能够对美洲大蠊药材、美洲大蠊提取物(水提物和醇提物)及极限条件处理的样品及康复新液药品进行快速地鉴定。
背景技术
美洲大蠊(Periplaneta Americana L)系蜚蠊科大蠊属昆虫，其入药始载于《神农本草经》，列为中品；据历代本草记载，其主治：“瘀血癥坚寒热，破积聚，喉咽闭，内寒无子”、“通利血脉”、“食之下气”。其“【性味与归经】咸、平；归肝、肾、脾经。【功能与主治】活血化瘀，清热解毒，消积，生肌。用于癥瘕积聚，小儿疳积，咽喉肿痛，虫蛇咬伤，疮痈肿痛及痔疮出血，口腔溃疡，胃、十二指肠溃疡。外用：消肿生肌，用于外伤、溃疡，烧伤、烫伤、褥疮之创面”。
康复新液系中药材美洲大蠊干燥虫体乙醇提取物，具有通利血脉，养阴生肌功效。内服用于瘀血阻滞，胃痛出血，胃、十二指肠溃疡；以及阴虚肺痨，肺结核的辅助治疗。外用用于金疮、外伤、溃疡、瘘管、烧伤、烫伤、褥疮之刨面。
目前，根据国家药品监督管理局康复新液的质量标准(WS3-B-3674-2000(Z))，对产品的鉴定主要通过茚三酮试液显色和基于丙氨酸主斑点显色的层析法；另外产品的含量测定只有总氨基酸一项，具体以康复新液每1ml含总氨基酸以丙氨酸(C3H7NO2)计(不得少于0.72mg)，难以达到对产品进行全面评价和有效的质量控制，影响了该产品的临床用药安全性和有效性。
PCR方法：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)法具有灵敏度高、特异性强、高效快速等特点，利用该技术可以在试管内将待测的目的基因在很短的时间内扩增物至十万倍乃至上百万倍，大大提高了基因诊断的灵敏度，降低了分析的难度。
目前，虽然已经有PCR方法鉴定美洲大蠊药材的报道(发明专利CN201710426033.6和CN201710991800.8)，但有关美洲大蠊提取物(水提物和醇提物)及极限条件处理的样品及康复新液药品的PCR鉴定方法至今未见报道。尤其在康复新液的生产过程中，存在美洲大蠊药材干燥、粉碎、混合等环节，醇煎煮提取工艺，甚至是成品高温高压等条件处理过程，这些条件要么使美洲大蠊粉末变为混合物，要么使美洲大蠊因提取过程被破坏大量有机成分，使康复新液的鉴定变得困难。
发明内容
本发明克服了目前以茚三酮试液显色和基于丙氨酸主斑点显色的层析法鉴定康复新液方法存在的缺陷，提供一种美洲大蠊提取物(水提物和醇提物)及极限条件处理的样品及康复新液药品的PCR试剂盒，及PCR鉴定方法，如下所示：
首先从美洲大蠊对照品药材中提取总DNA，利用一对引物JWF1和JWR1，通过PCR扩增一段COI基因片段，将扩增产物测序，然后进行序列分析比对，建立美洲大蠊的序列标准数据库，在比较数据库DNA序列的基础上，通过分析在特定条件下的聚合酶链式反应的产物结果，从而达到快捷、准确鉴定康复新液是否由美洲大蠊药材进行生产的目的。
对需要鉴定的美洲大蠊来源的相关样品(如康复新液)，提取其总DNA，在给定的条件下，用设计的引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增产物结果，然后测序，根据序列比对可以从康复新液样品中鉴定出美洲大蠊COI基因序列。本发明设计的用于鉴定美洲大蠊来源样品的PCR鉴定方法，采用如下步骤：
(1)从待测样品中分离提取DNA；
(2)以该DNA为模板设计一对引物，通过聚合酶链式反应扩增出美洲大蠊COI基因；其中所述引物DNA的序列为：
正向引物JWF1：5′-ATTCTGATTATTACCACCTTCA-3’
反向引物JWR1：5′-AAATTGCTAGATCAACAGATGC-3’
(3)PCR扩增反应；
(4)取适量步骤(3)的聚合酶链式反应扩增出的PCR产物用2％的琼脂糖电泳分离扩增产物的大小，送生物公司测序；
(5)根据测序结果，进行序列分析比对，如果与所述美洲大蠊的检测基因序列SEQID NO.1的一致性在99％以上，即可判断所述样品含有美洲大蠊来源。
进一步的，所述的PCR扩增反应的反应体系为1.1xT3 Super PCR mix 21μl，正反向引物(25μmol/L)各1.0μl，模板DNA 2.0μl。
更进一步的，所述的PCR扩增反应的扩增程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸15s，共30个循环；最后72℃终延伸2min。
再进一步，美洲大蠊的检测基因序列如SEQ ID No.1所示。
另一方面，提供一种康复新液的PCR鉴定试剂盒，试剂盒中的特异性引物的序列为：
正向引物JWF1：5′-ATTCTGATTATTACCACCTTCA-3’
反向引物JWR1：5′-AAATTGCTAGATCAACAGATGC-3’。
本发明的有益效果：
1.本发明根据GenBank中公布的美洲大蠊线粒体COI基因序列(AccesionNo.HM577152)，设计的一对引物，对美洲大蠊药材、美洲大蠊提取物(水提物和醇提物)及极限条件处理的样品及康复新液具有扩增效果，适用于以美洲大蠊为原料的相关样品的扩增，如康复新液中美洲大蠊COI基因的扩增，扩增产物大小为140bp。由于扩增片段较小，虽然该对引物对其他蜚蠊目昆虫：如云南真地鳖、黑胸大蠊、德国小蠊、澳洲大蠊、褐斑大蠊、菱叶斑蠊、苏里南蔗蠊、双纹小蠊均具有扩增能力，但可以对测序后的基因序列通过专业软件进行序列比对分析后通过序列一致性进行种属区分。
2.与康复新液传统的茚三酮试液显色和基于丙氨酸主斑点显色的层析法鉴定方法相比，本发明获得的基因序列有利于实现由以美洲大蠊为药材制成的康复新液的分子鉴定，从基因的角度实现康复新液全生产过程的质量的定性控制。
附图说明
图1为本发明实施例1中15批次康复新液PCR电泳检测图谱，其中泳道M为DNAMarker，“-”阴性对照，“+”代表美洲大蠊在引物JWF1/JWR1扩增下的结果，1-15代表15个批次的四川好医生攀西药业有限责任公司康复新液成品。
图2为利用本发明实施例2中的美洲大蠊引物JWF1/JWR1与蜚蠊目昆虫COI引物LCO1490/HCO2198(发明专利：CN104651486A，2015.05.27)、美洲大蠊特异性COI引物JMF1/JMR1(发明专利：CN201710426033.6)在康复新液及美洲大蠊成虫中的扩增检测结果。其中，M为Marker，“-”为阴性对照，“+”代表美洲大蠊在引物LCO1490/HCO2198扩增下的结果，1～3分别为美洲大蠊成虫DNA样品在分别在引物对：LCO1490/HCO2198、JMF1/JMR1、JWF1/JWR1扩增下的结果，4～6为康复新液成品DNA样品在引物对：LCO1490/HCO2198、JMF1/JMR1、JWF1/JWR1扩增下的结果。
图3为本发明实施例3中美洲大蠊相关样品PCR扩增结果。其中，M为Marker，“-”阴性对照，“+”代表美洲大蠊对照药品样品，1,2-美洲大蠊成虫样品、3,4-美洲大蠊水提物样品、5,6-美洲大蠊水提物极限条件处理后样品、7,8-美洲大蠊醇提物样品、9,10-美洲大蠊醇提物极限条件处理后样品。
图4为本发明实施例4中美洲大蠊与其他蜚蠊目昆虫样品PCR扩增结果。其中，M为Marker，“-”阴性对照，“+”代表美洲大蠊对照药品样品，1-美洲大蠊成虫、2-云南真地鳖、3-黑胸大蠊、4-德国小蠊、5-澳洲大蠊、6-褐斑大蠊、7-菱叶斑蠊、8-苏里南蔗蠊、9-双纹小蠊。
图5本发明实施例6中的本发明引物在其他不同药材样品昆虫中的检测结果。其中，M为Marker，“-”阴性对照，“+”代表美洲大蠊对照药品样品，1-蜈蚣药材、2-地龙药材、3-蝎子药材、4-雀脑药材、5-蛤蚧药材、6-牛鞭药材、7-鹿茸药材、8-大海马药材。
图6本发明实施例7中的本发明引物在康复新液生产全过程中PCR扩增鉴定结果。其中，M为Marker，“-”阴性对照，“+”代表美洲大蠊对照药品样品，1,2,3-美洲大蠊卵荚样品、4,5,6-美洲大蠊成虫/干燥虫体样品、7,8,9-美洲大蠊乙醇提取物中间体样品、10,11,12-康复新液样品样品。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1本发明中的引物对康复新液美洲大蠊COI基因的PCR扩增
1、康复新液(15批次的四川好医生攀西药业有限责任公司康复新液批号：B171207、B171208、B171209、B171210、B180121、B180122、B180123、171103、180301、180101、B171216、180201、B171214、180302、180107)；美洲大蠊对照品药材(ID:5RTB-TBMS)购自中国食品药品检定研究院。
2、样品的前处理：取适量康复新液样品用水浴蒸干进行浓缩处理后备用。
3、样品DNA提取：取浓缩后的一定体积的康复新液至离心管中，加入275μl的消化液(细胞裂解液200μl；0.5M EDTA(pH 8.0)50μl；蛋白酶K，20mg/mL 20μl；RNase A溶液5μl)确保样品完全被消化物覆盖，在55℃水浴中孵育1h；加入250μl(
SV LysisBuffer)于样品中混匀；将混合液转入到吸附柱中，离心(4min,10000r/min,)弃滤液；加入漂洗液650μl(含95％乙醇,)，离心(1min，10000r/min)；弃滤液；重复步骤以上三次，共洗脱四次；弃掉最后一次过滤液后再次离心2min，将吸附柱转移到新的离心管中，加入100μl无核酸酶水，室温放置2min,离心(2min,10000r/min)，收集滤液，-20℃保存备用。
4、引物合成：本实验实施所用引物如下：
正向引物JWF1：5′-ATTCTGATTATTACCACCTTCA-3’
反向引物JWR1：5′-AAATTGCTAGATCAACAGATGC-3’
5、PCR扩增本实施例的PCR反应体系如下：
PCR反应体系为25μl：1.1xT3 Super PCR mix 21μl，正反引物(25μmol/L)各1.0μl，模板DNA2.0μl。1.1xT3 Super PCR mix包含了Taq DNA聚合酶、DNTPS、MGCL2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂及稳定剂，且含有染料；PCR扩增程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸15s，共30个循环；最后72℃终延伸2min。
6、琼脂糖凝胶电泳检测：
配制含Gel Red的2.0％琼脂糖凝胶，120V电泳25min，各样本均扩增良好，条带清晰无杂质，结果见图1。由图可知，15批次的康复新液均在140bp出现条带，可直接送测序公司进行测序。
7、测序结果序列拼接与比对分析：
将测序结果用DNAMAN生物软件，将序列导入，将引物剪切后将序列组装，然后与基因序列SEQ ID NO.1进行比对，各样本序列与SEQ ID NO.1序列一致性在99％以上，则为美洲大蠊来源，说明该方法可以鉴定以美洲大蠊为药材的康复新液。
实施例2基于本发明中的引物、蜚蠊目昆虫通用引物以及美洲大蠊特异性引物，对比康复新液及美洲大蠊成虫COI基因的PCR扩增
本实施例的材料主要有：康复新液(批号：180107)、美洲大蠊成虫(批号：CP180701)来自四川好医生攀西药业有限责任公司，美洲大蠊对照品药材(ID:5RTB-TBMS)购自中国食品药品检定研究院。
1、引物合成：本实施例所用引物如下：
本次发明中的引物：(JWF1和JWR1)
正向引物JWF1：5′-ATTCTGATTATTACCACCTTCA-3’
反向引物JWR1：5′-AAATTGCTAGATCAACAGATGC-3’
美洲大蠊COI引物：(LCO1490和HCO2198)
正向引物LCO1490：5′-TAAACTCCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’
反向引物HCO2198：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATAATTGG-3’
美洲大蠊特异性COI引物：(JMF1和JMR1)
正向引物JMF1：5′-TGCTGAGCTCGGGCACCA-3’
反向引物JMR1：5′-CTACTGATCATACGAAAAGGGGA-3’
2、将样品经预处理后，取一定体积的康复新液样品，美洲大蠊成虫约0.1g分别置于2.0mL的离心管中，按照实施例1中DNA的提取方法提取DNA，并且按照实施例1中的PCR反应条件及反应程序进行扩增，结果如图2所示。由图可知，美洲大蠊成虫DNA样品在685bp、452bp及140bp处均有一条带，而康复新液成品DNA样品仅在140bp处含有一条带，在685bp、452bp并未出现条带，说明，本发明的方法可以对美洲大蠊来源的康复新液进行鉴定。
实施例3基于本发明中的引物对美洲大蠊水提物、醇提取物以及极限(高温、高压、长时间)条件处理样品的PCR扩增
本实施例的材料主要有：美洲大蠊成虫(批号：CP180701)、美洲大蠊水提物样品及极限(高温、高压、长时间)条件下处理样品、美洲大蠊醇提取物样品及极限(高温、高压、长时间)条件下处理样品来自四川好医生攀西药业有限责任公司，美洲大蠊对照品药材(ID:5RTB-TBMS)购自中国食品药品检定研究院。
按照实施例1中DNA提取方法提取DNA，并且按照实施例1中的PCR反应条件、引物及反应程序进行扩增，最终得到图3结果。由图可知，美洲大蠊对照药材、美洲大蠊水提物样品及极限(高温、高压、长时间)条件下处理样品、美洲大蠊醇提取物样品及极限(高温、高压、长时间)条件下处理样品均在140bp处均有一条带。实验结果说明，本发明的方法可以对美洲大蠊水提物样品及极限(高温、高压、长时间)条件下处理样品、美洲大蠊醇提取物样品及极限(高温、高压、长时间)条件下处理样品进行定性鉴定。
实施例4基于本发明中的引物对其他蜚蠊目昆虫样品的PCR扩增
本实施例的材料主要有：美洲大蠊成虫(批号：CP180701)样品来自四川好医生攀西药业有限责任公司，美洲大蠊对照品药材(ID:5RTB-TBMS)购自中国食品药品检定研究院。常见的其他蜚蠊目昆虫：云南真地鳖、黑胸大蠊、德国小蠊、澳洲大蠊、褐斑大蠊、菱叶斑蠊、苏里南蔗蠊、双纹小蠊样品来自四川大学生命科学学院生物资源保护与生态环境重点实验室并经过相关专家验证。
按照实施例1中DNA提取方法提取DNA，并且按照实施例1中的PCR反应条件、引物及反应程序进行扩增，最终得到图4结果。由图可知，美洲大蠊和其他蜚蠊目昆虫均在140bp条带位置出现目的条带。出现该结果主要有两个方面的原因：1)从进化角度来讲，美洲大蠊与其他的蜚蠊目昆虫亲缘较近；同时2)PCR扩增的基因片段较小(140bp)，因此在同样条件下，其他蜚蠊目昆虫同样可以扩增出相应的条带。
实施例5基于本发明引物扩增出的美洲大蠊COI基因序列与其他蜚蠊目昆虫COI基因序列比对分析
实施例4中基于本发明中的引物对其他蜚蠊目昆虫与美洲大蠊无法从PCR产物电泳图谱上条带的有无进行区分，但是可以通过对扩增的片段进行测序后，通过序列同源性比对进行区分。美洲大蠊COI基因片段(140bp)与其他24种蜚蠊目昆虫COI基因序列(140bp)来自NCBI网站(表1)。
表1序列比对过程中所涉及的25中蜚蠊目昆虫COI基因序列
首先，利用生物分析软件(DNAMAN)对10条美洲大蠊COI基因序列(140bp)(NCBI登录号：KM577145.1、KM577147.1、KM577148.1、KM577150.1、KM577151.1、KM577152.1、KM577155.1、KM577156.1、KM577157.1、KM591608.1)进行比对分析，分析结果显示这10条序列一致性为99.29％，在这140bp长度的序列中有5处碱基不同(表2)。其次，从进化角度，对与美洲大蠊亲缘性最近的其他4种大蠊属昆虫：日本大蠊、澳洲大蠊、黑胸大蠊及褐斑大蠊相应COI基因序列(140bp)进行比对分析，分析结果显示这5种大蠊属昆虫序列一致性为93.86％，在这140bp长度的序列中有32处碱基不同(表3)。最后，将美洲大蠊COI基因序列与其它24种其它蜚蠊目昆虫相应序列进行比对分析，分析结果显示这25种蜚蠊目昆虫序列一致性为84.69％，在这140bp长度的序列中有67处碱基不同(表4)。因此，可以通过与美洲大蠊标准COI基因序列(140bp)一致性比对分析对物种来源进行准确地鉴定。
表2 10条美洲大蠊COI基因序列(140bp)比对后差异性位点
表3美洲大蠊COI基因序列(140bp)与其他四种大蠊属昆虫COI基因(序列140bp)比对后差异性位点
表4美洲大蠊COI基因序列(140bp)与其他24种蜚蠊目属昆虫COI基因序列(140bp)比对后差异性位点
实施例6基于本发明的引物对其他动物类药材样品的PCR扩增
本实施例的材料主要有：美洲大蠊对照品药材(ID:5RTB-TBMS)购自中国食品药品检定研究院。常见的其他动物类药材样品：蜈蚣、地龙、蝎子、雀脑、蛤蚧、牛鞭、鹿茸及大海马来自好医生药业集团有限公司中药研究所，并经四川大学生命科学学院生物资源保护与生态环境重点实验室相关专家验证。
按照实施例1中DNA提取方法提取DNA，并且按照实施例1中的PCR反应条件、引物及反应程序进行扩增，最终得到图5结果。由图可知，除美洲大蠊对照药材样品在140bp条带位置出现目的条带外，其他药材样品子在对应的位置均无相应条带的扩增。
实施例7基于本发明中的引物对康复新液生产全过程PCR扩增鉴定
本实施例的材料主要有：美洲大蠊对照品药材(ID:5RTB-TBMS)购自中国食品药品检定研究院。美洲大蠊卵荚、美洲大蠊成虫/干燥虫体、美洲大蠊乙醇提取物中间体及康复新液样品均来自四川好医生攀西药业有限责任公司。
按照实施例1中DNA提取方法提取DNA，并且按照实施例1中的PCR反应条件、引物及反应程序对康复新液全生产过程中涉及的关键原料进行PCR鉴定，结果如图6所示。由图可知，美洲大蠊卵荚、美洲大蠊成虫/干燥虫体、美洲大蠊乙醇提取物中间体及康复新液样品均在在140bp条带位置出现目的条带扩增。对各样本目的片段经过测序后的基因序列与美洲大蠊对照药材COI基因序列即SEQ ID NO.1的一致性均在99％以上，可以判断样本均为美洲大蠊来源。因此，本发明中的引物及相应的方法可以作为康复新液生产全过程质量控制的一种手段。
综上，本发明建立了基于COI基因的美洲大蠊水提物、美洲大蠊醇提物(康复新液)及相应极限(高温、高压、长时间)条件下处理样品的PCR鉴定方法，该方法具有检测准确、高效、简便快速，为提高以美洲大蠊为原料的相关药品及产品的质量控制水平奠定了良好基础。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之做一些修改或改进，如利用COII基因序列、16SrRNA基因序列、28SrRNA基因序列、Cyt b基因序列、12SrRNA基因序列或其它基因用类似的方法进行相关鉴定，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进，均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 四川好医生攀西药业有限责任公司
<120> 一种康复新液的PCR鉴别方法
<130> 2019
<141> 2020-01-10
<150> 201910031161X
<151> 2019-01-14
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 140
<212> DNA
<213> Periplaneta americana
<400> 1
attctgatta ttaccacctt cattaacttt attactagct agtagtatag tagaaagagg 60
tgccggaaca ggatgaacag tatacccacc actagcaaga ggcattgctc atgccggagc 120
atctgttgat ctagcaattt 140
Claims (5)
1.一种康复新液的PCR鉴定方法，其特征在于采用PCR技术从康复新液中扩增出美洲大蠊COI基因序列，其步骤主要包括：
(1)从待测康复新液样品中分离提取DNA；
(2)以该DNA为模板设计一对引物，通过聚合酶链式反应扩增出美洲大蠊COI基因；其中所述引物DNA的序列为：
正向引物JWF1：5′-ATTCTGATTATTACCACCTTCA-3’
反向引物JWR1：5′-AAATTGCTAGATCAACAGATGC-3’
(3)PCR扩增反应；
(4)取适量步骤(3)的聚合酶链式反应扩增出的PCR产物用2％的琼脂糖电泳分离扩增产物的大小，送生物公司测序；
(5)根据测序结果，进行序列分析比对，如果与所述美洲大蠊的检测基因序列SEQ IDNO.1的一致性在99％以上，即可判断所述样品含有美洲大蠊来源。
2.根据权利要求1所述的PCR鉴定方法，其特征在于步骤(3)所述的PCR扩增反应的反应体系为：1.1xT3 Super PCR mix 21μl，正反向引物(25μmol/L)各1.0μl，模板DNA 2.0μl。
3.根据权利要求1所述的PCR鉴定方法，其特征在于步骤(3)所述的PCR扩增反应的扩增程序为：98℃预变性3min，98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸15s，共30个循环，最后72℃终延伸2min。
4.根据权利要求1所述的PCR鉴定方法，其特征在于步骤(5)所述美洲大蠊的检测基因序列如SEQ ID No.1所示。
5.一种康复新液的PCR鉴定试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的特异性引物的序列为：
正向引物JWF1：5′-ATTCTGATTATTACCACCTTCA-3’
反向引物JWR1：5′-AAATTGCTAGATCAACAGATGC-3’。
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2020
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