CN117512134A - 鉴定水蛭基原的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鉴定水蛭基原的方法及应用。具体地，本发明提供了一种用于区分不同水蛭基原的DNA分子鉴定方法。本发明方法可用于检测待测样品中所含有的水蛭基原。本发明还提供了相应的检测试剂、试剂盒和对水蛭基原种类进行鉴定。本发明方法可准确地区分来自宽体金钱蛭、日本医蛭、菲牛蛭、光润金线蛭、日本石蛭等多种不同物种的水蛭基原。本发明的方法准确、高效，且适用范围广，对DNA降解严重的样品也有良好的鉴别效果。

Description

鉴定水蛭基原的方法及应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，更具体地，涉及一种鉴定水蛭基原的方法及应用。
背景技术
现有水蛭鉴定方法包括《中国药典》2020年版所述薄层鉴定法及一些学者开发的DNA分子鉴定法。薄层鉴定法的描述如下：取本品粉末1g，加乙醇5ml，超声处理15分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取水蛭对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；紫外光灯(365nm)下显相同的橙红色荧光斑点。然而，前期预实验及其他学者的研究表明，菲牛蛭也会在对照药材的同一位置显示相同的荧光斑点，无法实现对水蛭基原的区分。
现有一些研究者开发出了针对水蛭的DNA分子鉴定方法，其一般步骤如下：首先提取样品的基因组总DNA，然后构建PCR扩增体系，PCR扩增体系一般包括，样品DNA模板、正反引物、dNTP等，并进行PCR扩增反应，随后用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，将在琼脂糖凝胶电泳中有单一明亮条带的PCR产物进行测序，对测序结果进行分析、BLAST比对，从而确定样品基原。其中，PCR体系中扩增引物的通用性及特异性决定了DNA鉴定方法的适用性与准确性，是鉴定方法中的关键。现有研究者开发出了通用引物LCO1490、HCO2198扩增水蛭的COI基因从而进行鉴定的方法，但是前期实验研究发现，由于其特异性不足加之数据库的庞杂，难以实现有效鉴定。也有研究者开发出了水蛭的特异性鉴定引物，但是适用物种少，扩增片段较长，并且难以实现对DNA降解样品的鉴定。
因此，开发出准确、高效的水蛭基原鉴定方法对本领域来说具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种准确、高效的水蛭基原鉴定方法。
在本发明的第一方面，提供了一种检测待测样品中是否含有水蛭基原的试剂盒，所述试剂盒中包括：(A)水蛭基原鉴别引物对，所述水蛭基原鉴别引物对用于特异性地扩增包含水蛭基原的迷你条形码区域的扩增产物，
其中，所述的迷你条形码区域为SEQ ID NO:1～5中一个或多个序列所对应的或所示的区域。
在另一优选例中，所述的水蛭基原鉴别引物对包括SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有(B)标准品，所述标准品包括具有选自下组所示序列的多核苷酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、或其组合。
在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的额外引物对：
(i)序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的引物对；
(ii)序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的引物对；
(iii)序列如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的引物对。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包含用于对扩增产物进行物种区分的试剂，较佳地，所述试剂选自下组：特异性区分探针或Cas蛋白。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包含用于对扩增产物进行物种区分的试剂，较佳地，所述试剂选自下组：特异性区分探针或Cas蛋白。
在另一优选例中，所述特异性区分探针包括实时荧光PCR的特异性Taqman探针。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括PCR扩增反应所需的试剂；优选所述PCR为常规PCR或者实时荧光PCR或者数字PCR；优选所述PCT扩增反应所需的试剂为DNA聚合酶和DNA聚合酶缓冲液。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、阳性对照和阴性对照。
在另一优选例中，所述水蛭基原包括选自下组的物种的水蛭基原：宽体金钱蛭(Whitmania pigra)、日本医蛭(Hirudo nipponica)、菲牛蛭(Poecilobdellamanillensis)、光润金线蛭(Whitmania laevis)、日本石蛭(Erpobdella japonica)、或其组合。
在另一优选例中，所述待测样品选自下组：新鲜水蛭、水蛭药材、水蛭饮片、含有水蛭的中成药、水蛭加工产品、或其组合。
在本发明的第二方面，提供了一种用于水蛭基原鉴别引物对，所述引物对包括SEQID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物。
在另一优选例中，水蛭基原鉴别引物对用于特异性地扩增包含水蛭基原的迷你条形码区域的扩增产物。
在本发明的第三方面，提供了如本发明第二方面所述的引物对的用途，用于检测待测样品中所含有的水蛭基原。
在本发明的第四方面，提供了一种检测试剂的用途，所述的检测试剂为水蛭基原的迷你条形码区域的检测试剂，并且所述检测试剂用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于鉴别或区分水蛭基原，或用于检测待测样品中是否含有水蛭基原。
在另一优选例中，所述的检测试剂包括序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物对。
在另一优选例中，所述的检测试剂还包含用于对扩增产物进行物种区分的试剂，较佳地，所述试剂选自下组：特异性区分探针或Cas蛋白。
在另一优选例中，所述的检测试剂还包含用于对扩增产物进行物种区分的试剂，较佳地，所述试剂选自下组：特异性区分探针或Cas蛋白。
在另一优选例中，所述特异性区分探针包括实时荧光PCR的特异性Taqman探针。
在另一优选例中，所述待测样品选自下组：新鲜水蛭、水蛭药材、水蛭饮片、含有水蛭的中成药、水蛭加工产品、或其组合。
在另一优选例中，所述检测为非诊断和非治疗的。
在本发明的第五方面，提供了一种区分不同水蛭基原的DNA分子的鉴定方法，包括步骤：
(a)提供对应于待测样品的核酸提取物；
(b)以所述核酸提取物为模板，用水蛭基原鉴别引物对进行扩增，从而获得特异性扩增产物，并对所述扩增产物进行物种区分，从而获得所述待测样品中的水蛭基原的物种信息，
其中，所述的水蛭基原鉴别引物对包括SEQ ID NO:8和9所示的引物。
在另一优选例中，所述的对所述扩增产物进行物种区分是基于水蛭基原的迷你条形码区域进行区分。
在另一优选例中，所述的迷你条形码区域包括或为SEQ ID NO:1～5中一个或多个序列所对应的或所示的区域。
在另一优选例中，所述的物种区分包括针对所述迷你条形码区域，用选自下组的方法进行物种鉴别或区别：测序分析、特异性探针检测、Cas蛋白切割、或其组合。
在另一优选例中，所述的特异性探针检测包括Taqman探针检测。
在另一优选例中，所述的Cas蛋白切割包括Cas蛋白的旁路切割。
在另一优选例中，所述的Cas蛋白包括Cas12或Cas13蛋白。
在另一优选例中，所述的Cas12蛋白包括Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12f或其组合。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的扩增与对所述扩增产物进行物种区分是先后进行的。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的扩增与对所述扩增产物进行物种区分是先后进行的，并且通过对扩增产物进行测序和序列比对，进行物种区分。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的扩增抗震与对所述扩增产物进行物种区分是同时进行的。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的扩增抗震与对所述扩增产物进行物种区分是同时进行的，并且物种区分用选自下组的方法进行：特异性探针检测、Cas蛋白切割。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗的方法。
在另一优选例中，所述的方法是体外方法。
在另一优选例中，所述待测样品选自下组：新鲜水蛭、水蛭药材、水蛭饮片、含有水蛭的中成药、水蛭加工产品、或其组合。
在另一优选例中，所述的待测样品选自下组：水蛭组织样品、水蛭药材、含水蛭的中成药、或其组合。
所述的物种区分包括区分以下物种：宽体金线蛭(W.pigra)、日本医蛭(H.nipponica)、菲牛蛭(P.manillensis)、光润金线蛭(W.leavis)、日本石蛭(Erpobdellajaponica)。
在另一优选例中，所述扩增为PCR扩增。
在另一优选例中，所述PCR扩增体系包括：模版DNA、正向引物、反向引物、其它缓冲试剂等。
在另一优选例中，所述PCR扩增体系为：总体积25μL，含有2×Taq PCR Mix12.5μL，ddH2O 9.5μL，浓度均为20μM的上下游引物各1μL，DNA模板1μL；
PCR扩增程序为：94℃预变性7min，94℃变性30s，46.9℃退火30s，72℃延伸1min(30～40个循环)，72℃再延伸10min；
优选所述步骤(s3)中采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否含有目的条带。
在另一优选例中，可检测的所述模板的浓度可低至10-5ng/μL。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了四对引物对水蛭树种进行PCR扩增；M：DNA标记；0：阴性对照；WP1-WP2：宽体金线蛭(Whitmania pigra)；HN1-HN2:日本医蛭(Hirudo nipponia)；PM1-PM2：菲牛蛭(Poecilobdella manillensis)。
图2显示了迷你条形码区域和引物对741F/943R位置。
图3显示了COI和741F/943R的鉴定结果：(A)COI的blast结果；(B)COI的系统发育树；(C)741F/943R的blast结果；(D)741F/943R的系统发育树。
图4显示了(A)741F/943R扩增的包含本发明7种CPM的凝胶图像，M：DNA标记；0：阴性对照；(B)反映7种中成药物种组成的条形图，CPM：中成药；HUN：混合样本。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地开发了可以准确而特异性地区分包括各种不同水蛭来源的水蛭基原的分子标记，即区分水蛭基原的迷你条形码区域。本发明的分子标记(或DNA片段)可区分来自宽体金钱蛭(Whitmania pigra)、日本医蛭(Hirudonipponica)、菲牛蛭(Poecilobdella manillensis)、光润金线蛭(Whitmania laevis)、日本石蛭(Erpobdella japonica)等不同水蛭的水蛭基原。此外，本发明通过大量筛选得到一对水蛭基原鉴别引物，所述引物对可以高效、高灵敏度、稳定、特异性地扩增出多种不同水蛭的特定线粒体DNA片段，从而用于区分或鉴定不同水蛭鲜品和含有水蛭的药材或中成药中水蛭基原。在此基础上，完成了本发明。
具体地，本发明的实验表明，在水蛭鲜品、药材和中成药中，本发明的方法均可以准确地鉴定出其包含的水蛭基原。
术语
如本发明所用，“迷你条形码”、“标准分子”、“标准品”、“迷你条形码区域”、“min-barcode”可互换使用，均指水蛭的具有特异性的线粒体DNA片段，该片段可以特异性地对水蛭基原进行鉴定。应理解，本发明的所述的迷你条形码区域包括或为SEQ ID NO:1～5中一个或多个序列所对应的或所示的区域。
基原和水蛭基原
基原是指正确的中药材品种来源，包含学名与药用部位。例如中药材人参的基原为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎。有些中药材的药材名和基原名并不一致，例如金银花的基原为忍冬科植物忍冬LonicEJa japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花。有些中药材是多基原的，例如大黄的基原为蓼科植物掌叶大黄Rheumpalmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheumofficinale Baill.的干燥根和根茎。
水蛭也是一种多基原中药，根据中国药典描述，水蛭基原为“水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmaniaacranulata Whitman的干燥全体。”，但是实际上，并无“水蛭科”这一科，“蚂蟥”、“水蛭”、“柳叶蚂蟥”并非科学描述。结合药典，按照动物学分类，水蛭的基原应为黄蛭科动物宽体金线蛭Whitmania pigra Whitman、医蛭科动物日本医蛭Hirudo nipponica Whitman或黄蛭科动物尖细金线蛭Whitmania acranulata Whitman的干燥全体。
此外，水蛭不仅是一种药材名，还是人们对于蛭纲动物的俗称，例如一些水蛭(药材)的混伪品，菲牛蛭、光润金线蛭，人们也称其为水蛭(俗称)。
本发明的引物对(引物序列)
如本文所用，术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。本发明的水蛭线粒体DNA特异性引物不是针对外源基因本身或病毒载体本身设计，而是针对水蛭线粒体DNA上选自下组所示区段设计的：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、和SEQ ID NO:5。
如本文所用，术语“水蛭基原鉴别引物对”为一种针对水蛭16s rDNA的引物对，它可特异性地扩增包含所述水蛭基原的迷你条形码区域的扩增产物。
换言之，本发明的引物可以特异性结合于不同水蛭线粒体DNA上选自下组的所示区段或其互补链：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、或其组合。
鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员应该理解，针对选自下组的所示区段可以设计多种引物序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、或其组合。因此，本发明的引物对不限于实施例中具体得到的引物序列。
在具体的实施方式中，所述引物序列为如SEQ ID NO:8和9所示的引物对。
探针
本文所用的术语“探针”具有本领域技术人员常规理解的意义，即，一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。
鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员应该理解，在知晓引物对的前提下，本领域技术人员可以根据正向引物和反向引物结合位点之间的模板序列自主设计探针，并检测该探针与引物对的技术效果。在具体的实施方式中，本领域普通技术人员可根据需要具体设计探针，所述探针可以处于液相中，也可以固定于固相上；可以在扩增前结合，也可以在扩增后结合。因此，本发明的探针并不限于实施例中具体公开的探针。本发明的引物对也不限于与实施例中具体公开的探针配对使用。
扩增子序列变体(ASV)
高通量测序的结果是许多reads(片段)，通过一些数据处理的手段，按照reads之间的重叠区域将其连接，得到一个个较长的片段，然后再将这些片段聚类，聚类后就得到一个ASV的序列。与其相似的一个名词是OTU(operational taxonomic units，分类操作单元)。它是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元(品系，种，属，分组等)设置的同一标志。通常按照97％的相似性阈值将序列划分为不同的OTU，例如在微生物测序(16S测序)每一个OTU被视为一个微生物物种。ASV也是一种聚类的方法，目前认为ASV聚类得到的序列更为真实和准确。
在本发明的具体实施例中，采用扩增子测序，扩增的是741/943R区域(迷你条形码区域)，通过去噪、错误模型(为了识别测序错误的序列，将其纠正为正确序列，并且保留发生基因突变的序列，在肠道菌群中则是通过相似性聚类)，得到ASV。因此，ASV中包括迷你条形码区域，通过对ASV的blast对比，确定每一个ASV的物种，进而确定包含ASV样品中的生物多样性。
本发明鉴定水蛭基原的方法
本发明的方法对水蛭基原进行鉴定包括以下步骤：
(1)提取待测样品的总DNA：
所述待测样品可以理解为待鉴定的水蛭组织样品、干药材、饮片、中成药、其它水蛭加工产品及他们的组合物，例如水蛭的肌肉组织、晾晒后的药材等，提取待测样品的总DNA后，对总DNA浓度进行测定，例如采用微量分光光度计对总DNA浓度进行测定，并根据吸光度A260/A280，A260/A230的值判断其DNA纯度，此为本领域常用技术手段，本发明在此不做限定。
(2)采用本发明筛选出的特定引物对(即水蛭基原鉴别引物对：SEQ ID NO:8和9)，分别以各待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；将扩增结果为阳性的待测样品胶条切下纯化，进行DNA测序，在进行DNA测序时可交由生物公司进行。
所述“阳性”结果可以理解为扩增结果可检测到，例如采用琼脂糖凝胶电泳检测，可观察的到条带，无条带则为阴性结果。采用核酸荧光染料染色，在紫外光下可观察到荧光即为阳性结果。在本发明的一些实施方式中，采用核酸荧光染料对扩增结果进行检测。所述核酸荧光染料为本领域常用试剂，本领域技术人员也可根据实际情况选择其他核酸荧光染料，本发明在此不做限定。
(3)测序结果进行校对、序列拼接，并在NCBI网站中采用BLAST的方法进行序列比对，相似度最高的序列的物种则为所测样品的物种，此为本领域常用技术手段，本发明在此不做赘述。
在本发明的一些实施方式中，每25μL PCR扩增体系包括：DNA模板1μL，引物741F 1μL，引物943R 1μL，2×Taq PCR Mix12.5μL，ddH2O 9.5μL，其中引物的浓度为20μM，PCR体系可根据实际情况发生变化。此为本领域常用技术手段，本发明在此不做赘述。
本发明所采用的的2×Taq PCR Mix包含了dNTPs、DNA聚合酶等必要成分，本领域技术人员可根据实际需要具体选择PCR Mix或DNA聚合酶等试剂，本发明在此不做限定。
在本发明的一些实施方式中，步骤2)中，PCR扩增的条件为：
4℃预变性7min，94℃变性30s，46.9℃退火30s，72℃延伸1min(30～40个循环)，72℃再延伸10min。
需要说明的是，本发明所使用的引物对741F943R由安升达生命科学有限公司合成，PCR体系中除模板和引物之外的试剂以及琼脂糖凝胶电泳所需的试剂均市售可得，此为本领域常规试剂，本发明在此不做限定。
在一个典型的水蛭鉴定方式中，具体包括如下步骤：
(1)基因组DNA提取：水蛭待测样品适量，用DNA提取试剂盒提取总DNA。按照DNA提取试剂盒说明书进行操作，-4℃保存。本步骤中待测样品为来源清晰并经过传统方法验证过品种的水蛭样品。
(2)PCR扩增体系的建立与反应：PCR反应体系总体积25μL，其中包括DNA模板1μL，引物741F 1μL，引物943R 1μL，2×Taq PCR Mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL，其中引物的浓度为20μM。PCR反应参数：94℃预变性7min，94℃变性30s，46.9℃退火30s，72℃延伸1min(30～40个循环)，72℃再延伸10min，4℃保存。
(3)PCR产物检测：PCR扩增反应结束后，取PCR反应产物5μL，1％琼脂糖凝胶电泳检测，含水蛭的样品应在200bp左右有单一明亮的条带。切下目的条带进行纯化，纯化后的PCR扩增产物由测序公司进行DNA测序。
(4)测序结果序列拼接：将测序结果序列导入至生物软件中去除引物序列及两端的低质量碱基，然后使用NCBI网站中的BLAST功能进行比对，相似度最高的序列的物种则为所测样品的物种。
本发明的主要优点：
1.本发明开发的鉴定方法可对药典中收录的宽体金线蛭、日本医蛭、及市场上常见的混伪品菲牛蛭、光润金线蛭、日本石蛭等进行鉴定，并且可对经过晾干、炮制的水蛭药材或中成药进行鉴定。
2.本发明与现有方法相比，适用范围更广，适用于药典中收录的宽体金线蛭、日本医蛭、尖细金线蛭及市场上常见的混伪品菲牛蛭、光润金线蛭、日本石蛭等水蛭药材的基原鉴定。
3.本发明选择的741F/943R片段，长度仅为200bp左右，适用于DNA降解严重的样品，DNA模板的质量无需太高，检测灵敏度更高。并且结合高通量测序技术可以鉴定中成药中水蛭的基原。
4.本发明的扩增引物741F/943R是针对水蛭专门设计的，因此不仅特异性高，也更容易扩增，PCR产物单一，胶图中无引物二聚体等杂带。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
材料和方法
本发明中，所涉及主要仪器和试剂包括如下：PCR仪(杭州柏恒科技有限公司)，高速离心机(湘仪实验室仪器开发有限公司)，DNA染料(上海泰坦科技股份有限公司)，DNA分子量标准(上海泰坦科技股份有限公司)，基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)，2×Taq PCR Mix(天根生化科技(北京)有限公司)。
实施例1线粒体基因组中物种特异性迷你条形码的发现及引物设计1.1实验方法
经过研究和分析，本发明人选定了水蛭基因组的一些候选共有区域，其中包括五种水蛭线粒体基因组的共有基因区域，计算每个区域的核苷酸多样性(nucleotidediversity，Pi value)，选择Pi值最高的区域作为迷你条形码(mini-barcode)，并设计通用引物。
对于水蛭线粒体基因组，选定的五种水蛭的基因组序列，包括：Hirudo nipponica(HN)，NC_023776；Poecilobdella manillensis(PM)，NC_023925；Whitmania acranulata(WA)，NC_023928；Whitmania laevis(WL)，NC_023926；和Whitmania pigra(WP)，NC_013569。
为了保证设计的引物可以扩增多种水蛭，按照以下步骤设计引物：
(a)使用DNAsp设置窗口为20步长为1计算mini-barcode的Pi值，Pi值为0的区域作为设计引物的区域；
(b)随后，设计引物，根据产物的长度和Pi值筛选引物；
(c)评估不同引物对的扩增能力并优化PCR条件。
1.2实验结果
根据Pi值，本发明最终选取了以下基因：ATP6、ATP8、ND4L、16S ribosomal DNA(16S rDNA)。再根据基因差异度、变异程度、区域长度等因素对引物设计的影响，最终选择16S rDNA区域作为迷你条形码区域。最终获得五种水蛭的迷你条形码，如下所示。
宽体金线蛭(Whitmania pigra)：
TTTTAAGTCAACATCGAGGTGCCAAACATTATATTAGATATGTACTCCTGTATAAAATTAGCCTGTTACCCCTAAAGTAACTTAATCTTCTGATCTAATAAAGGGTCAAATAAAGATTTATAGTTCATAAATAAATGTGATGTTTTATAAATCACAGATCGCCCCAATCAAATTTTATATAAACTTACTTTATAGTAAAATTAAGCTTTATAGGGTCTTCTGA(SEQ ID NO:1)。
日本医蛭(Hirudo nipponica)：
TTTAAGTCAACATCGAGGTGCCAAACATTATATTAGATAGGTACTCCTGTATAAAATTAGCCTGTTACCCCTAAAGTAACTTAATCTTTTGATCTAATAAAGGGTCTAATAAAGGTTTATTTACCATATAAAAAAAATGACGTTTTATAAATCATAGATCGCCCCAATCAAATTATTGTATAAACATGTTTTATATTAAAATAAAGCTTTATAGGGTCTTCATGA(SEQ ID NO:2)。
菲牛蛭(Poecilobdella manillensis)：
TTATTTAAGTCAACATCGAGGTGCCAATCATTATATTAGATAAGAACTCCGATATAAAAATTAGCCTGTTACCCCTAAAGTAACTTAATCTTATGCTCTTATTAAGGATCAAATCTAGACTAATATGTCAAATTGTTTAAATGATGTTTAATTAATTAATCATTGATCGCCCCAATCAAATATATGTTTAAATTAAAAACTTTAATAGTTATATAAAGCTTTATAGGGTCTTCTT(SEQ ID NO:3)。
光润金线蛭(Whitmania laevis)：
TTTAAGTCAACATCGAGGTGCCAAACATTATATTAGATAAGTACTCCTGTATAAAATCAGCCTGTTACCCCTAAAGTAACTTAATCTTCTGATCTAATAAAGGGTCAAATAAAGATCTATTAATCATAAAAAAAATTGATGTTTAATAAATCAAAGATCGCCCCAATCAAATTTTATATAAACTATCTTTATATTAAAATTAAGCTTTATAGGGTCTTCTTGA(SEQ ID NO:4)。
日本石蛭(Erpobdella japonica)：
TTTTTTAAGTCAACATCGAGGTGCCAAGCATATTTGTCGATAGGAGCTCTTTAAATATTTTAGCCTGTTATCCCTAAAGTAGCTTAATTTTTTAGCTTTACGGATCTATTTATGAATTATAAGTCTATGTATTTATAGGTTGTTTTATTATACCTAGGTCGCCCCAACCGAATATAAATATAGTAAACTTATATTATTTATGAAGCTTTATAGGGTCTTCTAA(SEQ ID NO:5)。
根据步骤(b)，本发明人设计了6对候选引物。基于扩增产物的长度和Pi值，最后选取了4对引物进行进一步扩增筛选，如表1所示，退火温度设定为46.9℃。
表1
采用表1中所述的4个引物对来自三个不同水蛭品种的DNA抽提物进行扩增。
结果如图1所示，结果表明，四种引物对均能够扩增出对应于三种不同水蛭物种的扩增产物。其中，引物对741F/943R(SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)的扩增条带最为清晰和均一，并且其扩增产物具有最高的Pi值。因此，将该引物对作为最优选的引物对用于后续实验。
引物对741F/943R(也称为“水蛭基原鉴别引物对”)及其扩增产物中的迷你条形码区域如图2所示。
实施例2不同方法对水蛭样品的鉴定
2.1材料和方法
2.1.1样品收集
从不同区域收集了77个动物样品和70个中药样品，包括宽体金线蛭、日本石蛭、菲牛蛭、光润金线蛭、和日本石蛭。
具体样品信息如表2所示。
表2
2.1.2基因组DNA提取
取每个样品适量，研磨成粉末，使用TIANampFeedstuffAnimalDNAKit(天根生物科技公司，北京，中国)提取总DNA。简要步骤如下：
(1)将GAbuffEJ和ProteinaseK加入管中，混匀。然后，65℃孵育约30分钟；
(2)加入GB缓冲液，混匀；
(3)65℃孵育约10分钟。12,000rpm离心2分钟，然后将上清液转移至新管中；
(4)用GD和PW缓冲液重复洗涤，然后用TE缓冲液洗脱基因组DNA。
2.1.3 DNA片段扩增及测序
PCR体系包括2×TaqPCRMix12.5μl(天根生物技术公司，北京，中国)，各引物1.0μl(金唯智合成，中国苏州)，DNA模板1μl，加入无菌双蒸水。总体积25μl。
反应条件优化如下：741F/943R，94℃7分钟，94℃30秒循环30次，46.9℃30秒(LCO1490/HCO2198温度设置为46.0℃)，72℃1分钟，最后一步为72℃10分钟。
对于原始动物和药材样品，PCR产物经GENEWIZ纯化并测序。对于CPM样品，PCR产物由生工生物使用Illumina双端测序以2×250bp进行测序。
其中，DNA片段扩增所用到的引物信息如表3所示。
表3
2.1.4测序数据处理及分析
使用CodonCodeAlignEJ进行测序峰图的校对和双端测序数据的组装。使用MAFFT进行多序列比对。使用trimAl删除gap位点。使用IQ-TREE进行最大似然系统发育分析。
使用fastq-multx对双端读取进行多路分离，并根据标签分配给每个样本。此外，使用cutadapt去除接头，并使用bbduk修剪引物序列。经过质量控制、连接配对末端读段、去除嵌合体、去除非目标长度序列以及使用DADA2方法去噪后，鉴定了扩增子序列变体(ASV)。
2.2通过COI区域对水蛭样品进行鉴定
有45个样品在使用LCO1490/HCO219扩增和测序后未获得序列。扩增和测序的成功率为70％。通过blast每个序列进行物种鉴定，保留匹配度最高的blast结果。最终成功鉴定出58个样品(58/147)。
如图3A所示，EJ和PM中的某些样品无法鉴定到五种水平，并且某些样品鉴定错误。这种差异在WP组中尤其明显。
如图3B所示，使用104个序列构建了系统发育树。结果表明，除了WPZJ09和WPHN02之外，每个样本都聚类到自己的进化枝中。
2.3通过引物对(741F/943R区域)对水蛭样品进行鉴定
使用引物对741F/943R(SEQ ID NO:8和9)可以对所有样品进行扩增，扩增成功率为100％。
经过测序后，只有WLSH05、HNSD06和WPAH02的测序失败，扩增和测序的成功率为98％。通过blast对每个序列进行物种鉴定，保留匹配度最高的blast结果，最终成功鉴定144个样品(144/147)。
出乎意料的是，就无法鉴别的样品而言，在147个样品中，COI方法无法检测的样品高达89个，本发明方法无法鉴定的品种仅为3个，两者相差了约29倍((147-58)/(147-144)＝29.67倍)。
此外，采用本发明的水蛭基原鉴别引物对时，如图3C中所示，除PM组外，其他组的blast结果都是准确的。PM组的两个样本PMMyanmar01-02与hirudo medicinal相匹配。
如图3D所示，系统发育树结果表明，每个样本都正确地聚类到各自的进化枝中。
实施例3含有水蛭的中成药样品检测
总共收集了7个不同的中成药(CPM)，采用水蛭基原鉴别引物对(SEQ ID No:8和9)进行扩增，并对扩增产物进行测序。
结果表明，共有7种中成药扩增成功。此外，混合样品(HUN)的扩增也成功。
如图4A所示。总共获得了734,048个reads和187个扩增子序列变体(ASV)，其中86个ASV使用blast比对到了水蛭物种。
中成药中ASV序列的分类鉴定信息如表4所示。序列数量小于1％的物种被归为“其它”。
表4中成药样品中ASV序列分布
如图4B所示，混合样品中存在五种不同的水蛭物种(WP、HN、WL、EJ、PM)，这证明了结果的可靠性。CPM10、CPM3、CPM9中有多种水蛭。CPM10和CPM6中的主要物种是日本石蛭；在CPM9中检测到菲牛蛭；宽体金线蛭和日本医蛭在除CPM6之外的所有样品中均检测到。
由此可见，本发明方法对中成药中的水蛭基原的检测也具有极其优异的效果。
讨论
水蛭药材包括蚂蟥、水蛭和柳叶蚂蟥，是一种常用的中药材，可用于心血管疾病的治疗中。近年来，随着人口不断老龄化，加之水蛭药用资源不足，导致水蛭药材价格上涨，市场上出现诸多伪品。目前市场上的主要流通品种为宽体金线蛭，常见伪品有菲牛蛭、光润金线蛭、石蛭等，前期的实验研究表明，不同来源的水蛭抗凝血活性差异较大，且目前尚无可靠有效的方法对不同种水蛭进行区分，因此本发明的目的是开发一种新的方法以区分市场上常见的不同水蛭基原。
水蛭是一种常用中药。不同水蛭活性成分的差异导致其不能混用。DNA条形码技术常用于中药鉴定中，但是应用于DNA降解的样品及中成药样品却鲜有报道。因此本发明人开发了一种水蛭专用的条形码(mini-barcode)或标准分子，并与通用DNA条形码COI的鉴定效果进行比较。通过5种水蛭线粒体基因组的高可变区筛选出mini-barcode，并根据保守区域设计并筛选出引物对741F/943R。共收集了样品147份，扩增测序得到了102个COI序列，通过blast与数据库比对，成功鉴定了58个样品，遗传进化树显示2个样品进入了错误的分支。使用741F/943R成功鉴定了144个样品，并且在7种中成药中鉴定出了5种水蛭。
本发明同时采用COI基因鉴定方法和本发明方法对水蛭基原进行鉴定。由鉴定结果可得知本发明方法有极其优异的鉴定效果：
本发明选择的741F/943R片段，长度为200bp左右，适用于DNA降解的样品，DNA模板的质量无需太高，检测灵敏度更高。并且结合高通量测序技术可以鉴定中成药中水蛭的基原。而COI片段的长度为658bp，扩增难度大，对模板的要求高，检测灵敏度低。
本发明的扩增引物741F/943R是针对水蛭专门设计的，因此与模板更为准确，也更容易扩增，PCR产物单一，胶图中无引物二聚体等杂带。COI片段则是一种通用引物，广泛用于各种物种，其引物的特异性不高，导致扩增失败，例如无法扩增WL样品，根据胶图来看，其PCR产物不单一。
COI数据库较为冗杂。对于物种鉴定来说，一般是获得序列后通过blast与NCBI的nt数据库比对来确定物种，COI作为通用DNA条形码，在数据库中有着非常多的序列，然而这些序列并未经过审查，会对物种鉴定产生影响。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种检测待测样品中是否含有水蛭基原的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：(A)水蛭基原鉴别引物对，所述水蛭基原鉴别引物对用于特异性地扩增包含水蛭基原的迷你条形码区域的扩增产物，
其中，所述的迷你条形码区域为SEQ ID NO:1～5中一个或多个序列所对应的或所示的区域。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的水蛭基原鉴别引物对包括SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9所示的引物。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述水蛭基原包括选自下组的物种的水蛭基原：宽体金钱蛭(Whitmania pigra)、日本医蛭(Hirudo nipponica)、菲牛蛭(Poecilobdella manillensis)、光润金线蛭(Whitmania laevis)、日本石蛭(Erpobdellajaponica)、或其组合。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述待测样品选自下组：新鲜水蛭、水蛭药材、水蛭饮片、含有水蛭的中成药、水蛭加工产品、或其组合。
5.一种用于水蛭基原鉴别引物对，其特征在于，所述引物对包括SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9所示的引物。
6.如权利要求5所述的引物对的用途，其特征在于，用于检测待测样品中所含有的水蛭基原。
7.一种检测试剂的用途，其特征在于，所述的检测试剂为水蛭基原的迷你条形码区域的检测试剂，并且所述检测试剂用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于鉴别或区分水蛭基原，或用于检测待测样品中是否含有水蛭基原。
8.一种区分不同水蛭基原的DNA分子的鉴定方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供对应于待测样品的核酸提取物；
(b)以所述核酸提取物为模板，用水蛭基原鉴别引物对进行扩增，从而获得特异性扩增产物，并对所述扩增产物进行物种区分，从而获得所述待测样品中的水蛭基原的物种信息，
其中，所述的水蛭基原鉴别引物对包括SEQ ID NO:8和9所示的引物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的对所述扩增产物进行物种区分是基于水蛭基原的迷你条形码区域进行区分。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的物种区分包括区分以下物种：宽体金线蛭(W.pigra)、日本医蛭(H.nipponica)、菲牛蛭(P.manillensis)、光润金线蛭(W.leavis)、日本石蛭(Erpobdella japonica)。
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