KR102255610B1 - 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커에 관한 것으로, 본 발명의 유전자 마커를 이용함으로써, 한약재로 사용되는 왕지네의 기원종을 PCR 산물의 전기영동 패턴에서 밴드 유무 확인만으로도 쉽고, 정확하게 구별할 수 있다.

Description

왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커{Genetic marker for discriminating original species of Scolopendra subspinipes mutilans}

본 발명은 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커, 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커를 검출하기 위한 왕지네의 기원종 감별용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 왕지네의 기원종 감별용 조성물 또는 키트, 왕지네의 기원종 감별 방법에 관한 것이다.

지네는 순각강에서 그리마류를 제외한 절지동물의 총칭으로 다지류에 속하며 몸길이 0.5∼15cm로 머리와 몸통으로 나뉜다. 지네의 종류로는 왕지네, 땅지네, 돌지네, 장수지네 등이 있다. 한방에서는 왕지네(Scolopendra subspinipes mutilans)를 대나무 막대기에 머리와 꼬리를 묶어서 말린 것을 오공(蜈蚣)이라 하며 중풍, 경간, 관절염, 림프선염, 암종 등에 처방한다. 다른 약효로는 특허문헌 1에 왕지네 유래의 펩타이드를 유효성분으로 하는 항균, 항진균용 조성물이 개시되어 있다.

한약재의 경우 약으로 사용하기 위해서는 명확한 기원을 사용해야 하므로정확한 감별이 필요하다. 예를 들면, 한약재로 쓰이는 오공은 「대한민국약전외한약(생약)규격집」에서 왕지네의 몸체로 정하고 있으나, 건조된 상태로 유통되므로 왕지네의 외형만으로는 기원종인지 감별이 어렵기 때문에 외형 외의 다른 방법으로 왕지네의 기원종을 감별할 수 있는 수단이 필요하다. 또한, 왕지네는 유전학적으로 거리가 가까운 동속 근연종이 다수 존재하기 때문에, 유전적 차이점을 확인하더라도 그 차이가 종간의 차이인지, 개체간의 차이인지 명확히 확인이 어려운 실정이다.

최근 분자생물학의 급속한 발전으로 다양한 유전자 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류, 동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석을 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법 등이 있다.

유전자 마커로 사용되는 것 중 하나로서, 단순 염기서열 길이 다형성(simple sequence length polymorphism, SSLP)이 있다. SSLP는 DNA 서열에서 반복되는 서열의 횟수가 다른 것을 나타내며, 길이의 다형성을 유전자 마커로 사용한다. 단순 염기서열 길이 다형성의 예로서, 초위성체(microsatellite)와 미소부수체(minisatellite)가 있다.

초위성체는 미세부수체라고도 불리며, 1~6개 염기쌍(bp) 이상 길이의 동일한 내용으로 반복된 DNA 단편이다. 일반적으로 5~50번까지 단편이 반복되는 양상을 보이고, DNA 복제시 슬립(slippage) 과정에서 반복수의 차이가 생긴다. 단순 염기서열 길이 다형성을 나타내는 다른 예인, 미소부수체는 염색체의 텔로미어 부근에 집중되어 있고, 초위성체는 염색체 전 구간에 고르게 퍼져 있어 초위성체가 미소부수체에 비해 유전자 마커로 더 많이 사용된다. 예를 들면, 초위성체는 유전자 감식을 통한 친자 확인, 법의학(검증, 감별), 농수산물(원산지, 종 감별 등), 식품(병원균 감별 등), 약재 감별 등 여러 분야에서 널리 사용된다.

종래에 왕지네 유래의 유효 성분에 대한 생리 활성을 확인하거나, 왕지네 추출물을 면역 증강의 용도로 사용하는 점 등과 같이 주로 약효에 대해서 연구가 진행되었고, 왕지네의 기원종의 감별에 대해서는 연구가 미비한 실정이다.

본 발명자는 한약재의 기원종에 따라 약효가 다를 수 있다는 점에 착안하여, 오공의 원료로 사용되는 왕지네의 기원종을 감별할 수 있는 유전자 마커에 대해서 연구하였으며, 왕지네 유전체에서 나타나는 초위성체를 왕지네의 기원종을 감별할 수 있는 유전자 마커로 사용가능한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허공보 제2020-0071402호

본 발명의 과제는 한약재로 사용되는 왕지네의 기원종을 효과적으로 감별할 수 있는 유전자 마커를 개발하는 것이다. 아시아 지역에서 수집한 지네 샘플에서 왕지네들이 공유하고 있는 초위성체를 확인하였고, 이 초위성체를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 개발하였다. 개발된 프라이머 세트로 왕지네의 기원종을 감별하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 한약재 오공(蜈蚣)의 기원종인 왕지네 감별용 유전자 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 한약재 오공(蜈蚣)의 기원종인 왕지네 감별용 유전자 마커를 검출하기 위한, 왕지네 감별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 한약재 오공(蜈蚣)의 기원종인 왕지네 감별용 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 한약재 오공(蜈蚣)의 기원종인 왕지네 감별 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 서열번호 20의 염기서열로 구성된 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 한약재 오공(蜈蚣)의 기원종인 왕지네 감별용 유전자 마커를 검출하기 위한, 왕지네의 기원종 감별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 한약재 오공(蜈蚣)의 기원종인 왕지네 감별용 조성물, 또는 왕지네의 감별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 한약재 오공(蜈蚣)의 기원종인 왕지네 감별 방법을 제공한다: 왕지네로부터 총 DNA를 추출하는 DNA 추출 단계; 추출된 총 DNA를 주형으로 상기 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 상기 유전자 마커를 증폭하는 증폭 단계; 및 증폭된 산물을 전기영동하여 밴드의 유무를 확인하는 단계.

본 발명의 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커와, 이를 이용한 왕지네의 기원종을 감별하는 방법을 이용하여 왕지네의 기원종을 정확하게 구별할 수 있다.

도 1은 왕지네 라이브러리 제작 흐름도를 나타낸다.
도 2는 왕지네에서 추출된 DNA의 전기영동 결과이다: 한국(샘플 번호: 1~25), 중국 절강성(샘플 번호: 26~45), 중국 호북성(샘플 번호: 46~65), 중국 유통품(샘플 번호: 66~83), 인도네시아(샘플 번호: 84~101), 라오스(샘플 번호: 102).
도 3은 왕지네 라이브러리 제작시 제한효소를 이용한 타겟팅에 대한 개략도를 나타낸다.
도 4는 왕지네 DNA에 제한효소를 처리하여 제작한 라이브러리의 전기영동 결과이다: 위쪽은 듀얼 제한효소를 이용한 라이브러리의 전기영동 결과이고, 아래쪽은 싱글 제한효소를 이용한 라이브러리 전기영동 결과이다.
도 5 내지 도 9는 라이브러리 구축 및 NGS 시퀀싱 후, 샘플별 데이터 생산 결과를 나타낸다.
도 10은 왕지네의 그룹간 PCA 결과를 나타낸다: "유통품"은 중국 유통품을 나타낸다.
도 11은 왕지네의 그룹간 상관성 히트맵 결과를 나타낸다: kor; 한국, julkang; 중국 절강성, hobuk; 중국 호북성, laos; 라오스, trade; 중국 유통품, indonesia; 인도네시아.
도 12는 왕지네의 기원종 감별용 마커(변이)의 성능을 검증한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상술한 바와 같이, 왕지네의 유전체에서 나타나는 초위성체, 유전적 변이를 유전자 마커로 사용하는 것에 대한 연구는 미비하였다.

본 발명은 아시아의 각 지역에서 수집한 왕지네 샘플로부터 얻은 DNA로 라이브러리를 구축하고, 이 라이브러리에 대해 차세대 염기서열 분석을 적용하여 시퀀싱하여 데이터를 생산하며, 이 데이터를 기반으로 각 지역의 그룹이 공유하는 초위성체 영역을 탐색하여 동북아 지역의 왕지네를 감별할 수 있는 초위성체 영역을 확인하였다. 기원종에 해당하는 왕지네가 공유하는 초위성체 또는 유전적 변이를 유전자 마커로 사용함으로써 왕지네의 기원종을 효율적으로 평가할 수 있다.

본 발명은 서열번호 20의 염기서열로 구성된 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커를 제공한다.

상기 서열번호 20의 염기서열은 초위성체(microsatellite) 또는 유전변이를 포함한다. 왕지네 기원종 집단에서 초위성체(microsatellite)를 포함하며, 다른 집단에서는 해당 영역이 존재하지 않는다. 구체적으로, 해당 영역은 실험에 사용된 왕지네 샘플의 비교 조합에 따라 초위성체 또는 유전변이로 구별될 수 있다. 기원종 내(한국, 중국 호북성, 중국 절강성의 비교)에서는 초위성체의 길이에 차이가 있고, 기원종 및 비기원종간 비교(한국, 중국 호북성, 중국 절강성과 유통품, 인도네시아, 라오스의 비교)에서는 유전변이, 즉 초위성체의 유무가 차이점이다. 초위성체를 먼저 설명하고, 유전변이에 대해서는 하기 '유전변이'서술 부분에서 상세하게 설명한다.

초위성체는 단순 반복 염기 서열(simple sequence repeat, SSR) 또는 단연쇄 반복(short tandem repeats, STR)라고도 불리는 DNA 다형성의 일종이다. SSR은 일반적으로 중립이고 공우성(co-dominant)이며, 혈통이나 군집에서 표현형과 유전형을 매개할 수 있는 유전학적인 마커로 사용되는 유전체 내의 2-6개의 반복되는 염기서열이다.

상기 초위성체는 아데닌-티민-아데닌(ATA) 모티프가 n회 반복된 것일 수 있고, 예를 들면 2회 내지 50회, 4회 내지 40회, 6회 내지 30회, 8회 내지 20회, 8회 내지 15회 반복된 것일 수 있다. 또한, 상기 (ATA)n 모티프 외에도 본 명세서의 표 7에 나타낸 서열번호 17의 염기서열로 구성된 인접서열 및 초위성체; 내지 서열번호 29의 염기서열로 구성된 인접서열 및 초위성체;에 포함된 각 초위성체도 왕지네의 기원종을 감별하는데 사용될 수 있다.

상기 유전변이는 초위성체 및 이의 양 측면에 위치하는 인접 서열이 왕지네의 유전체(genome) DNA에 존재하는 것일 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어'유전변이'는 초위성체의 유무를 나타낸다. 예를 들면, 서열번호 20의 염기서열의 경우 왕지네 기원종 집단에서는 존재하지만, 기원종이 아닌 다른 집단에서는 해당 영역이 존재하지 않는다. 통상 본 기술 분야에서 용어 '유전변이'는 초위성체를 포함하여 개체간/종간 DNA 차이를 보이는 돌연변이나 유전적 재조합을 의미하지만, 본 발명에서는 초위성체의 유무의 의미로 사용된다.

초위성체와 유전변이에 대해서 종합하면, 본 발명에 따른 서열번호 20의 염기서열은 동북아 집단의 개체들 사이에서는 초위성체의 반복수 차이로 길이의 다형성을 나타내며, 동북아 집단과 동남아 집단 사이에서는 서열번호 20의 염기서열이 존재하거나, 존재하지 않는 구조적 유전 변이를 나타낸다. 결과적으로, 서열번호 20의 염기서열은 2가지로 이용가능하다. 초위성체의 반복수 차이로는 동북아 집단 내의 서브그룹(subgroup)(한국, 중국 절강성, 중국 호북성)을 구분할 수 있고, 초위성체의 유무로는 동북아 집단과 동남아 집단을 구분할 수 있는 효과가 있다.

왕지네(Scolopendra subspinipes mutilans)는 한약재에서 오공의 원료로 사용되고 있다. 중국, 한국, 일본 등 여러 아시아권 국가에 분포한다. 크게 다리의 색은 노란색, 빨강색, 주황색이다. 빛깔은 흑록색이고 머리는 붉은색이다. 몸은 수많은 마디로 이루어져 있으며 마디마다 1쌍 또는 2쌍의 다리가 있다. 다리는 21쌍이고 마지막 1쌍의 다리는 다른 다리보다 길고 보행에는 쓰이지 않는다. 머리 양옆에 4개씩의 홑눈이 있다. 구기에 턱다리가 있고 그 끝이 날카로운 발톱으로 되어 있으며, 독샘이 있다. 자웅이체로 난생이고, 포란 기간은 약 8주이며, 갓 태어난 새끼(pedeling)는 2회의 탈피를 거쳐 유체가 된다.

본 발명에서 사용된 용어 '기원'은 한약재에서 기원종에서 사용되는 부위를 의미한다. 본 발명에서 사용된 용어 '기원종'은 기원이 되는 종을 나타내며, 본 발명에서는 왕지네의 기원종이 동북아 지역의 왕지네일 수 있고, 구체적으로 한국, 중국에서 수집된 왕지네일 수 있으며, 보다 구체적으로 한국, 중국 절강성, 중국 호북성에서 수집된 왕지네일 수 있다.

상기 유전자 마커는 동북아 지역의 왕지네 그룹에서 특이적으로 공유된 초위성체, 유전변이에 해당하므로 기원종인지 불확실한 왕지네 샘플이 동북아 지역의 왕지네에 해당하는 기원종인지 검증하는데 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커를 검출하기 위한, 왕지네의 기원종 감별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어 '프라이머'는 상보적인 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머 세트란 정방향(forward) 프라이머와 역방향(reverse) 프라이머의 조합을 의미한다.

본 발명에서 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 DNA 중합효소에 의한 중합 반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 디옥시뉴클레오타이드의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자에 특이적인 프라이머로 10개 내지 30개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산일 수 있으며, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 가질 수 있다.

상기 왕지네의 기원종 감별용 프라이머 세트는 서열번호 36의 염기서열로 구성된 프라이머; 및 서열번호 37의 염기서열로 구성된 프라이머;를 포함할 수 있다. 또한, 상기 서열번호 36의 염기서열로 구성된 프라이머; 및 서열번호 37의 염기서열로 구성된 프라이머;로 이루어진 프라이머 세트 외에도 본 명세서의 표 7에 나타낸 서열번호 17의 염기서열로 구성된 인접서열 및 초위성체; 내지 서열번호 29의 염기서열로 구성된 인접서열 및 초위성체;에 포함된 각 초위성체를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트도 왕지네의 기원종을 감별하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서의 표 8에 나타낸 프라이머 세트 중에서, 서열번호 36의 염기서열로 구성된 프라이머; 및 서열번호 37의 염기서열로 구성된 프라이머;로 이루어진 프라이머 세트 외의 다른 프라이머 세트들도 왕지네의 기원종을 감별하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 한 실시예에서는, 상기 서열번호 20의 염기서열로 구성된 유전자 마커를 증폭시킬 수 있는 서열번호 36의 염기서열로 구성된 프라이머; 및 서열번호 37의 염기서열로 구성된 프라이머;를 포함하는 프라이머 세트를 이용함으로써, 왕지네의 기원종인 동북아 지역의 왕지네를 감별할 수 있었다(실시예 4, 도 12 참조).

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 왕지네의 기원종 감별용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 왕지네의 기원종 감별용 조성물은 상기 프라이머 세트 외에도 시료 내에 왕지네의 기원 감별을 위하여 필요한 반응완충용액, 중합효소, dNTP, 안정화제 및 모든 생물학적 또는 화학적 시약을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 왕지네의 기원종 감별용 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 왕지네의 기원종 감별용 키트는 상기 프라이머 세트 외에도 시료 내에 왕지네의 기원 감별을 위하여 필요한 반응완충용액, 중합효소, dNTP, 안정화제 및 모든 생물학적 또는 화학적 시약, 사용설명서 등을 포함할 수 있다. 이러한 키트의 다른 구성은 본 기술 분야의 통상의 기술자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 왕지네의 기원종 감별 방법을 제공한다: 왕지네로부터 총 DNA를 추출하는 DNA 추출 단계; 추출된 총 DNA를 주형으로 상기 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 상기 유전자 마커를 증폭하는 증폭 단계; 및 증폭된 산물을 전기영동하여 밴드의 유무를 확인하는 단계.

상기 프라이머 세트는 서열번호 36의 염기서열로 구성된 프라이머; 및 서열번호 37의 염기서열로 구성된 프라이머;를 포함하는 프라이머 세트일 수 있다.

상기 전기영동하여 밴드의 유무를 확인하는 단계에서, 밴드가 나타나는 경우 왕지네의 기원종인 것으로 판단한다. 상기 왕지네의 기원종은 동북아 지역의 왕지네일 수 있다.

상기 PCR 수행을 통해 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 예를 들면, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될수 있다. 또한, 방사선 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사선이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사선으로 표지될 수 있다.

상기 증폭된 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 증폭된 산물을 정제하는 방법은 본 기술 분야에 알려진 일반적인 방법이면 모두 이용가능하며, 젤 필터레이션, 컬럼을 이용한 방법 및 전자기장을 이용한 방법으로 구성된 군에서 선택되는 방법을 이용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

왕지네 유래의 유전자 라이브러리 제작

왕지네의 학명에 근거하여 6개 집단(한국, 중국 절강성, 중국 호북성, 중국 유통품, 인도네시아, 라오스)에 대한 샘플을 수집하였다. 한국산 왕지네와 연관된 종이며, 위품이 포함된 중국, 인도네시아, 라오스에서 수득한 왕지네 샘플을, 기원종(한국산, 중국 호북성, 중국 절강성 왕지네 샘플)과 위품(유통품, 인도네시아, 라오스 샘플)을 비교 분석하여 왕지네의 기원종을 감별하는 마커를 제작하였다(도 1 참조).

1-1. DNA 추출

왕지네 샘플에서 DNA 추출시에 QIAGEN DNeasy Blood ＆ mini kit (Cat No. 69504)를 사용하였다. 왕지네 약재 조직 샘플 0.4-0.6 cm를 액체 질소로 얼려 막자와 막자사발로 곱게 갈아 분말 상태로 만들었다. 분말 시료를 2 mL 튜브에 옮겨 담아 180 ㎕의 ATL 용액과 20 ㎕ Proteinase K를 첨가한 후, 완전히 섞어주고(vortex) 56 ℃ 항온기에서 완전히 시료를 분해한 뒤, 시료를 15초 섞어준다. 이 반응물에 AL 용액을 200 ㎕ 첨가하여 완전히 섞이도록 흔들어 준 다음, 56 ℃ 항온기 10 분 처리해 준다. 200 ㎕ 에탄올 (96-100%)를 첨가 후 완전히 섞어준다. 반응물의 상층액을 취하여 DNeasy 미니 스핀 컬럼에 넣고 8,000 rpm으로 1 분간 원심분리 하고, 걸러진 용액은 버리고, 미니 스핀 컬럼을 새 2 mL 튜브에 옮겨 담고, 200 ㎕ AW1 용액을 컬럼에 넣고 8,000 rpm으로 3 분간 원심분리 하였다. 걸러진 용액은 버리고 500 ㎕의 AW2 용액을 컬럼에 한 번 더 넣고 14,000 rpm으로 3 분간 원심분리 하였다. 이후 걸러진 용액을 버리고 컬럼을 새 1.5 mL 튜브에 옮겨 끼우고 AE 용액 200 ㎕을 넣어 1 분간 상온(15-25 ℃)에 방치한 후 8,000 rpm으로 1 분간 원심분리 하여 DNA를 추출해냈다.

1-2. DNA 품질 확인

추출된 DNA를 1.2 % 아가로즈 겔에서 전기영동하여 품질을 확인하였다. 전기영동은 하기의 조건에서 수행하였다: 200V, 25 min. 1kb Plus marker(M) 5㎕, DNA 2㎕. 왕지네 샘플 번호는 하기와 같다: 한국(샘플 번호: 1~25), 중국 절강성(샘플 번호: 26~45), 중국 호북성(샘플 번호: 46~65), 중국 유통품(샘플 번호: 66~83), 인도네시아(샘플 번호: 84~101), 라오스(샘플 번호: 102). 도 2에 DNA 품질 결과를 나타낸다.

도 2에서 알 수 있듯이, 한국(샘플 번호: 1~25), 중국 절강성(샘플 번호: 26~45), 중국 호북성(샘플 번호: 46~65), 라오스(샘플 번호: 102)의 경우 왕지네 샘플 유래의 DNA는 밴드가 뚜렷하여 DNA 안정성을 확인하였지만, 중국 유통, 인도네시아(66번 개체부터 101번 개체) 샘플은 DNA 밴드가 뚜렷하지 않았다(도 2 참조).

1-3. 바코딩을 이용한 라이브러리 구축

실시예 1-2에서 품질을 확인한 DNA에 바코딩하여 라이브러리를 구축하였다. 개체를 구분하기 위해 인덱스를 각 DNA 단편(fragment)에 부착하여 라이브러리를 구축하였다. 어뎁터는 Illimina 플랫폼 장비에 적합한 어뎁터를 사용하였으며, 어뎁터에는 인덱스가 포함되어 있다. 한국(샘플 수: 23개), 중국 절강성(샘플 수: 20개), 중국 호북성(샘플 수: 20개), 중국 기타 지역(유통품, 샘플 수: 18개), 인도네시아(유통품, 샘플 수: 14개), 라오스(유통품, 샘플 수: 1개) 검체를 활용하였다. 2x300 염기서열 (Mi-Seq ver.3 플랫폼) 분석을 위해서 단편 크기를 조정하였다.

참조 서열이 없는 왕지네에 대해 비교 그룹간 공통 영역을 최대한 많이 확보하기 위해 제한효소를 이용하여 라이브러리를 제작하였다(도 3 참조). 라이브러리는 사용된 제한효소의 개수에 따라 2가지로 제작하였으며, 하나는 ApekⅠ을 사용한 싱글 제한효소(single enzyme) 라이브러리이고, 다른 하나는 2개의 제한효소(pst1 및 msp1)를 이용한 듀얼 제한효소(dual enzyme) 라이브러리이다. 라이브러리 제작 후 전기영동하여 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 500~1000bp에서 메인 라이브러리가 제작된 것을 확인하였다. 도 4의 위쪽은 듀얼 제한효소 라이브러리의 전기영동 결과를 나타내며(1번 레인, 2번 레인 동일 샘플), 도 4의 아래쪽은 싱글 제한효소 라이브러리의 전기영동 결과를 나타낸다(1번 레인 내지 4번 레인 동일 샘플).

차세대 염기서열 분석(Next Generation sequencing, NGS)를 통한 대용량 유전체 서열 확보

2-1. 어뎁터 및 저품질 서열 트리밍(trimming)

실시예 1-3에서 얻은 왕지네 DNA 라이브러리에 대해 트리밍하는 전처리를 수행하였다. NGS서열 트리밍 전용 프로그램인 cutadapt를 사용하여 어뎁터 및 저품질 서열을 트리밍하였으며, 각 제한효소(ApekI, pst1+msp1)에 대해 아래 표 1 내지 표 5와 같이 트리밍되었다.

sample		Passing Filter
		ApekI		pst1+msp1		pst1+ msp1 (R1)	pst1+msp1 (low QC)
		%read1	%read2	%read1	%read2	%read1	%read1	%read2
한국	1	99.8	96.5	99.9	98.3	99.80	99.6	96.7
	2	99.8	96.9	99.8	98.4	99.80	99.6	97.2
	3	99.8	96.4	99.9	98.4	99.80	99.6	97.2
	4	99.8	96.3	99.8	98.2	99.80	99.6	96.8
	5	99.8	96.8	99.9	98.6	99.80	99.6	97.4
	6	99.8	97.1	99.9	98.7	99.80	99.7	97.7
	7	99.8	96.5	99.8	97.9	99.80	99.6	96.4
	8	99.7	96.7	99.7	98.8	99.70	99.5	97.9
	9	99.8	96.9	99.9	98.6	99.80	99.7	97.4
	10	99.8	96.8	99.8	98.6	99.80	99.7	97.5
	11	99.8	96.7	99.9	98.6	99.80	99.6	97.1
	12	99.7	96.6	99.8	98.8	99.70	99.5	97.8
	13	99.7	96.2	99.8	98.2	99.70	99.5	96.9
	14	99.7	96.2	99.8	98.6	99.80	99.5	97.4
	15	99.8	96.5	99.8	98	99.80	99.6	96.4
	16	99.8	96.4	99.8	98.3	99.80	99.6	97.1
	17	99.7	96.5	99.7	98.6	99.60	99.4	97.3
	18	99.7	97	99.8	98.7	99.70	99.5	97.8
	19	99.7	96.6	99.7	98.7	99.70	99.5	97.8
	20	99.7	96.3	99.8	98.2	99.80	99.5	97
	21	99.8	96.7	99.8	98.3	99.80	99.6	97.1
	22	99.8	96.5	99.8	98.4	99.80	99.7	97.4
	25	99.8	96.9	99.3	97.6	99.40	99	96.3

sample		Passing Filter
		ApekI		pst1+msp1		pst1+ msp1 (R1)	pst1+msp1 (low QC)
		%read1	%read2	%read1	%read2	%read1	%read1	%read2
중국 절강성	26	99.9	97.4	99.8	98.5	99.70	99.6	97.6
	27	99.8	96.8	99.8	98.6	99.80	99.7	97.6
	28	99.8	96.8	99.8	98.3	99.80	99.6	96.9
	29	99.8	96.2	99.9	98	99.80	99.6	96.5
	30	99.8	96.9	99.7	98.4	99.70	99.7	97.6
	31	99.8	96.8	99.6	98.3	99.60	99.6	97.4
	32	99.8	96.7	99.8	98.5	99.80	99.6	97.5
	33	99.7	96.5	99.7	98.3	99.70	99.1	96.6
	34	99.8	96.6	99.8	98.4	99.80	99.4	97.1
	35	99.8	96.6	99.8	98.3	99.80	98.7	95.2
	36	99.8	96.8	99.8	98.6	99.80	99.6	97.6
	37	99.8	96.4	99.9	98.2	99.80	99.5	96.4
	38	99.7	96.6	99.8	98.6	99.80	99.5	97.2
	39	99.8	96.8	99.7	96.1	99.80	99.4	94.8
	40	99.7	96.8	99.8	98.6	99.80	99.6	97.4
	41	99.8	96.3	99.8	98.1	99.80	99.5	96.3
	42	99.7	96.3	99.9	98.2	99.90	99.6	96.5
	43	99.8	97	99.8	98.9	99.80	99.6	98.1
	44	99.7	96.6	99.8	98.7	99.70	99.5	97.4
	45	99.8	97.6	99.7	98.6	99.70	99.6	97.9

sample		Passing Filter
		ApekI		pst1+msp1		pst1+ msp1 (R1)	pst1+msp1 (low QC)
		%read1	%read2	%read1	%read2	%read1	%read1	%read2
중국 호북성	46	99.7	96.4	99.8	98.6	99.80	99.5	97.5
	47	99.8	97	99.8	98.6	99.80	99.6	97.6
	48	99.8	96.6	99.8	98.5	99.80	99.6	97.3
	49	99.8	96.7	99.9	98.3	99.90	99.6	96.8
	50	99.8	96	99.9	97.5	99.80	99.5	96
	51	99.6	96.6	99.7	98.4	99.60	99.5	97.3
	52	99.7	96.6	99.8	98.7	99.80	99.5	97.6
	53	99.7	96.5	99.7	98.8	99.60	99.5	98
	54	99.8	96.6	99.8	98.5	99.80	99.5	97.3
	55	99.8	96.8	99.8	98.6	99.80	99.6	97.6
	56	99.8	96.4	99.8	98.5	99.80	99.5	97.2
	57	99.7	97	99.8	98.7	99.80	99.5	97.5
	58	99.7	97	99.8	98.5	99.80	99.4	97.4
	59	99.7	96.5	99.8	98.2	99.80	99.5	96.7
	60	99.6	96.4	99.7	98.7	99.70	99.4	97.7
	61	99.8	97.1	99.8	98.6	99.80	99.6	97.4
	62	99.8	97.1	99.8	98.7	99.70	99.5	97.5
	63	99.7	96.9	99.7	98.5	99.60	99.3	97.4
	64	99.7	97.1	99.7	98.9	99.70	99.4	98
	65	99.7	96.7	99.7	98.9	99.70	99.5	98.1

sample		Passing Filter
		ApekI		pst1+msp1		pst1+ msp1 (R1)	pst1+msp1 (low QC)
		%read1	%read2	%read1	%read2	%read1	%read1	%read2
중국 유통품	66	99.7	97.6	99.8	98.9	99.80	99.6	98
	67	99.8	98.4	99.8	98.8	99.70	99.5	98.2
	68	99.8	97.5	99.8	98.9	99.80	99.6	98
	69	99.8	98.5	99.5	98.5	99.80	99.3	97.2
	70	99.8	98.5	99.8	99	99.80	99.6	98.5
	71	99.8	97.6	99.7	98.2	99.70	99.7	97.8
	72	99.7	97	99.9	97.6	99.80	99.6	97.1
	73	99.7	98	98	93	99.00	97.4	88.3
	74	99.8	98.2	99.9	98.7	99.80	99.5	97.8
	75	99.7	98.2	99.8	98.7	99.60	99.6	97.7
	76	99.8	98.2	99.7	98.8	99.60	99.5	97.9
	77	99.7	98.1	99.8	98.7	99.80	98.5	96.2
	78	99.6	98.1	99.9	98.6	99.60	99.5	97.8
	79	99.8	98	99.8	98.8	99.80	99.4	97.8
	80	99.7	98.1	100	98.4	99.80	99	99
	81	99.5	97.7	99.5	98.9	99.50	99.5	98.2
	82	99.8	98	99.8	99.4	99.70	99.7	98.2
	83	99.8	97.8	99.8	98	99.60	99.4	97.2

sample		Passing Filter
		ApekI		pst1+msp1		pst1+ msp1 (R1)	pst1+msp1 (low QC)
		%read1	%read2	%read1	%read2	%read1	%read1	%read2
인도네시아	84	99.8	97.9	99.7	98.7	99.90	99.6	97.9
	85	99.8	97.7	99.9	98.9	99.80	99.6	98.1
	86	99.8	97.8	100	96.1	99.10	100	96.2
	87	99.7	97.6	99.8	96.9	99.90	99.6	96.1
	88	99.7	97.5	99.8	98.7	99.80	99.6	97.9
	89	99.8	97.7	99.8	98.8	99.80	99.6	98
	90	99.8	97.7	99.8	98.8	99.80	99.5	98.1
	91	99.9	98.6	99.8	98.5	99.80	99.5	97.5
	92	99.7	97.9	99.8	98	99.70	99.5	97.2
	93	99.7	96.2	99.7	96.1	99.70	99.7	98.2
	94	99.6	96.7	100	98.5	99.80	99.7	97.3
	95	99.8	98.1	99.8	99	100.00	100	98.2
	96	99.8	98.2	99.8	98.9	99.80	99.4	98
	98	99.9	98.2	99.8	98.7	99.80	99.6	97.9
라오스	102	99.8	96.8	99.8	98.5	99.80	99.5	97.2

표 1 내지 표 5에 나타낸 바와 같이, 트리밍 수행 후 최소 88.3%부터 최대 100%까지 필터 패싱(filter passing)된 것을 알 수 있었다.

2-2. 샘플별 데이터 생산량 확인

라이브러리 구축 및 NGS 시퀀싱 후, 샘플별 데이터 생산 결과를 도 5 내지 도 9에 나타낸다.

도 5 내지 도 9에서 알 수 있듯이, 한국, 중국 절강성, 중국 호북성, 라오스 샘플의 경우 데이터 생산량이 많았다. 하지만, 중국 유통품 및 인도네시아 샘플에 대한 데이터 생산량이 적었고, 이는 DNA 전기영동 결과와 일치하였다.

초위성체(microsatllite)/유전변이 탐색 및 그룹간 비교를 통한 감별 마커 발굴

인덱스 서열을 이용하여 샘플별로 fastq 데이터를 분류하였다. 초위성체를 탐색하여 인접 서열의 일치여부에 따라 마커 후보군의 영역을 추출하였다. 다형성을 확인하여 지역 및 기원종 그룹에 따라 차이가 나는 초위성체/유전변이의 다형성을 기반으로 랭크(rank) 기반의 마커 후보군을 얻었다. 각 마커 후보들에 대해서, 초위성체의 양 측면에 존재하는 인접 서열과, 프라이머 서열을 얻었다. 다양한 그룹간 비교(지역/기원종 여부)를 위해 기원종 여부를 외에도 특정 지역간 차이를 보이는 영역도 마커 탐색 영역에 포함하였다. 서열번호 20의 염기서열과 같이 기원종 그룹만 존재하는 유전변이도 마커 후보군으로 선발하였다.

3-1. 초위성체 반복수에 대한 매트릭스 작성

총 6개 집단에 대해 각 지역의 그룹을 기준으로 초위성체 반복수/유전변이에 대한 매트릭스를 작성하였다. 하기 표 6에 6개 집단에서 기원종 또는 지역적으로 차이를 보이는 정보를 갖는 초위성체/유전변이와, 이의 인접서열을 나타낸다. 하기 표 6에서 "seqID"는 초위성체와 이의 양 측면에 위치하는 인접서열이며, "인접서열|인접서열" 형식으로 나타내고, "|"는 초위성체/유전변이를 나타낸다.

본 명세서에 첨부되는 서열목록에는 하기 표 6의 서열번호 1 내지 서열번호 16을 인접서열, 초위성체(모티프의 반복수는 확인된 반복수 중 최소값만 입력), 인접서열의 형태로 입력하였다. 즉, 서열번호 1 내지 서열번호 16은 그룹에서 확인된 초위성체의 모티프 반복수의 최소값만 나타낸 대표 서열이며, 실제 서열은 하기 표 1에 개시된 각 그룹에서 확인된 여러 초위성체 반복수를 각각 포함하는 서열이다. 예를 들면, 서열번호 1의 경우 서열목록에는 인접서열과 인접서열 사이에 모티프 GA를 입력하되, 각 그룹에서 확인된 초위성체 반복수에서 가장 최소값에 해당되는 7개를 입력하며, AATATTTGCATAATGCGACACTTCATAAAC GAGAGAGAGAGAGATGGCGGCGCAACGAGCACGTGCGTCGGACC로 나타낸다(상기 서열에서 초위성체는 볼드체로 나타낸 부분임). 서열번호 1 내지 서열번호 16에 대해서 서열목록에 입력되지 않은 다른 반복수를 가지는 초위성체를 포함하는 서열들은 하기 표 1에 초위성체의 반복수를 기재함으로써 갈음한다.

seqID	초위성체(반복수)	한국	중국 절강성	중국 호북성	중국 유통품	인도네시아	라오스
AATATTTGCATAATGCGACACTTCATAAAC | TGGCGGCGCAACGAGCACGTGCGTCGGACC (서열번호 1)	GA(n)	14,17	12,13,14	11,13,14	7	7,8,9,13	8,9,11,12
ACACGGCGAAATTTCTGCATGACACCTCCA | CGTATATGGCACGACTATTCGGCCACCCTC (서열번호 2)	CCT(n)	8,9	8	6,8	6	6	7
AGATATCGGCGAAAGGCATCCGATCCGACG | AACGCACGTGCTGACGTTGACAGAATAAAA (서열번호 3)	AC(n)	8	8	8	6,9	6	6
AGGTCGACCGAGGGCACAAGGCAACGAGGA | AGTAGTTTTGGCAGCAGTTGCTGCAAATCC (서열번호 4)	AAC(n)	2,3,5,6	2,3,6,8	2,3,6	3	3	3
ATGAGAGCGAGCGACCAGTGCGGCAGAGGA | AACGAGAACGTGCGTGCCTCCGAGGCTTTT (서열번호 5)	AG(n)	9,12,13,14,19,20,21,22,23,24	9,11,12,13,14,20,21,24	10,11,12,13,16,17,19,20,21,22,23,24,25	9,15,21,22	10,20,21,22,23	12,13,16,17
ATGCGAGTGCTGTCACGACCTGTGTTGCTC | AGCGGGAATTGAAAAACGCGCGCGCTCCCA (서열번호 6)	TTG(n)	7,8,9,10	8,9	8,9	9,11,13	8,9,10,13	10,12
ATTGAAAGTTTATTTAATGTTTCTTTGTTG | AATTATGATTATTATTATTATACCTATGTG (서열번호 7)	TAT (n)	6	6	6,7	5	5	5
CAAGCCGACGCTCGCAATTTTAGGAAAATT | TTATAAAAAAGAAAAGTGAAAATGTTTTGA (서열번호 8)	TTG(n)	5,6	5,6	5,6,7	6	6	9
CACATAGGTATAATAATAATAATCATAATT | CAACAAAGAAACATTAAATAAACTTTCAAT (서열번호 9)	ATA (n)	6	6	6,7	5	5	5
CGAGCACGTAAGCTGTACTCGCCTCCTAAC | TTCTGTTCATCGCTCTTGGCAACAGTTAAA (서열번호 10)	CT(n)	7	7,8	7	5,6	5,6	5
CGCACGCACGCGTTTCTAATCACGGTTTCC | GACGAAAGAAAGTAGAGGATGAGAATACAA (서열번호 11)	CT(n)	13,14,15,16,17,20,21,22,23,24,25,26	13,14,15,16,18,19,21,25	11,12,14,15,16,18,19,20,21,22,24,25,26	9,14	10,13,21	16,17,22
GAAAAGCCTCGGAGGCACGCACGTTCTCGT | TTCCTCTGCCGCACTGGTCGCTCGCTCTCA (서열번호 12)	TC(n)	9,12,13,14,21,22	9,11,12,13,14,20	10,11,12,13,16,17,19,20,21	9,21	10,20,21,22	13,17
TCGCGCCACTGACGAACTGGATGGACGAAG | CCACCTCCTGGACGCTCCTTTTAATACGAC (서열번호 13)	GAA(n)	6	6	6	8	8	7
TGGGAGCGCGCGCGTTTTTCAATTCCCGCT | GAGCAACACAGGTCGTGACAGCACTCGCAT (서열번호 14)	CAA(n)	7,8,9,10	8,9	8,9	8,9,11	8,9,10,13	10,12
TGGTTTTAACGCTTGTGGAGAAAATGAGAT | AAGGGAAAAAGAAACTGATGATTCATTTGC (서열번호 15)	AG(n)	4	2,4	4	6,9,10	6,9,11	14
TTTAACTGTTGCCAAGAGCGATGAACAGAA | GTTAGGAGGCGAGTACAGCTTACGTGCTCG (서열번호 16)	AG(n)	7	7,8	5,7,8	5,6	5,6	5

표 6에 나타낸 바와 같이, 6 그룹이 모두 공유하는 경우는 16개 영역, 5 그룹은 26개 영역, 4 그룹은 152개 영역, 3 그룹은 1,465개 영역, 2 그룹은 644개 영역, 1 그룹만 갖는 영역은 170개였다.

3-2. 그룹별 클러스터링

총 6개 집단에 대해서 반복수가 복수인 경우, 평균을 취하여 PCA법과 히트맵을 이용하여 그룹별 클러스터링을 수행하였다.

도 10에 나타낸 바와 같이, PCA 결과에서 전반적으로 동북아 지역과 동남아 지역이 뚜렷이 구분되는 것을 알 수 있었으며, 하기 표 7과 같이 동북아와 동남아는 공유하고 있지 않은 유전체(genome)가 상당수 있을 것으로 추정된다.

또한, 도 11은 왕지네 6개 집단 간의 상관성(correlation)에 대한 히트맵을 나타낸다. 상관성 수치는 1부터 -1까지의 값을 갖는다. 1에 가까울수록 그룹간 상관성이 높고, 서로 가까운 그룹을 의미하며 붉은색으로 나타낸다. 0은 상관성이 없다는 것을 의미하고, 마이너스(-) 상관성 값은 파란색으로 나타낸다.

도 11에서 알 수 있듯이, 히트맵 결과는 PCA 결과와 같이 동북아 지역과 동남아 지역이 구분되는 것으로 나타났다. 한국, 중국 절강성, 중국 호북성은 서로 상관성이 있는 것으로 확인되었다. 하지만, 라오스, 중국 유통품(trade), 인도네시아 샘플은 위 한국, 중국 절강성, 중국 호북성 샘플과는 상관성이 없는 것으로 나타났다.

3-3. 최종 마커 후보군 및 프라이머 세트 제작

본 발명에서 NGS를 이용하여 얻은 왕지네 기원종 감별용 마커 후보군들이 실제로 기원종 감별이 가능한지 검증하기 위하여 각 후보 마커들에 대해 프라이머를 제작하였다. 하기 표 7에 총 2,842 후보군에서 최종 선발된 상위 14개의 후보인, 왕지네의 기원종 감별용 초위성체 마커 후보군을 나타낸다. 하기 표 7에서 "Sequence" 컬럼의 서열은 위 표 6의 "seqID"와 동일하게, 초위성체/유전변이와 이의 양 측면에 위치하는 인접서열을 기재한 것이며, "인접서열|인접서열" 형식으로 나타내고, "|"는 초위성체/유전변이를 나타낸다. 하기 표 7의 "(ID)반복수"는 초위성체의 모티프 종류와 반복수를 나타낸다. 예를 들면, (AATA)n은 아데닌-아데닌-티민-아데닌 모티프가 n회 반복된 것을 나타낸다. 본 명세서에 첨부되는 서열목록에는 하기 표 7의 서열번호 17 내지 서열번호 29를 인접서열, 초위성체(모티프의 반복수는 확인된 반복수 중 최소값만 입력)/유전변이, 인접서열의 형태로 입력하였고, 상기 실시예 3-1에서 언급한 바와 같이 서열번호 1 내지 서열번호 16과 같은 형태로 그룹에서 확인된 초위성체의 모티프 반복수의 최소값만 나타낸 대표 서열을 입력하였다.

Sequence	(ID)반복수	한국	중국 절강성	중국 호북성	중국 유통품	인도네시아	라오스
AAAATTATATATTTAATCTTATATTAGATT| AACCACTACTATCAGATTGTGAGATAAGCG (서열번호 17)	(AATA)n	-	-	-	7	7,8	10,11,12
AAACACTTTTAATATCCCACACCCATCTCC| CGATGTCTTCCTCTCTCCTTCAACCATCTT (서열번호 18)	(CT)n	-	-	-	13,20,21,23,24	11,12,13,20,21,22	17,18,19,25
AAACGGGGTGGTGCTGGGAGGAGGTGATGT| AGAACGAGGAGACGGATATACGGTGAGATT (서열번호 19)	(AGG)n	-	-	-	8,9	8,9,10,12	-
AACTTCCATTTCGATCAAATTTCATTTGAC |AAGATTATATAAAAAAAGTTAAAATTCATT (서열번호 20)	(ATA)n	14	8,11	8	-	-	-
AATGCTTCGAGAGCTCCTCGCGATATTTCA |CTCTTTCTCTACCCACAGACGTTACCAAAT (서열번호 21)	(TC)n	29	8	8	-	-	-
AATATTTGCATAATGCGACACTTCATAAAC |TGGCGGCGCAACGAGCACGTGCGTCGGACC (서열번호 22)	(GA)n	14,17	12,13,14	11,13,14	7	7,8,9,13	8,9,11,12
AGATATCGGCGAAAGGCATCCGATCCGACG| AACGCACGTGCTGACGTTGACAGAATAAAA (서열번호 23)	(AC)n	8	8	8	6,9	6	6
ATTGAAAGTTTATTTAATGTTTCTTTGTTG| AATTATGATTATTATTATTATACCTATGTG (서열번호 24)	(TAT)n	6	6	6,7	5	5	5
CACATAGGTATAATAATAATAATCATAATT| CAACAAAGAAACATTAAATAAACTTTCAAT (서열번호 25)	(ATA)n	6	6	6,7	5	5	5
TCGCGCCACTGACGAACTGGATGGACGAAG| CCACCTCCTGGACGCTCCTTTTAATACGAC (서열번호 26)	(GAA)n	6	6	6	8	8	7
TGGTTTTAACGCTTGTGGAGAAAATGAGAT| AAGGGAAAAAGAAACTGATGATTCATTTGC (서열번호 27)	(AG)n	4	2,4	4	6,9,10	6,9,11	14
AAAGTTAAGCAGGCACACGGAATTAGATCC| GCCAAGGGAGGATGAATTCCTTCGCTGTGA (서열번호28)	(GA)n	-	-	-	14,15	18	20
TCTTTTTTACACAGTGATTAACTTTTTTCA| TTCTTTCTTCTTTCATTACCACTTATAAAC (서열번호 29)	(TC)n	-	-	-	11,13	12	6

상기 표 7의 후보군에 대한 프라이머 세트를 표 7의 순서와 동일한 순서로 하기 표 8에 나타낸다.

ID	초위성체	FORWARD PRIMER0 (5'-3')	Tm (℃)	size		REVERSE PRIMER1 (5'-3')	Tm (℃)
seq_44814170_x1	(AATA)n	GTGGAAAGAGGTGGTCGTGA (서열번호 30)	59.608	20		AGCGCCGCTTATCTCACAAT (서열번호 31)	60.179
seq_12501694_x1	(CT)n	CCCAGCAAACACTTTTAATATCCCA (서열번호 32)	59.813	25		TCTCAGTCTGCAGAAGATGGT (서열번호 33)	58.466
seq_8495433_x1	(AGG)n	GGATAAAACGGGGTGGTGCT (서열번호 34)	60.323	20		ACACGAAGCTCAGTTGACACT (서열번호 35)	59.863
seq_17064426_x1	(ATA)n	CAGCTTTAAACTTCCATTTCGATCA (서열번호 36)	58.389	25		TGTCTTGTGTTATTTCCAGAAACAGT(서열번호 37)	59.398
seq_5316664_x1	(TC)n	CACCGCAAATGCTTCGAGAG (서열번호 38)	59.904	20		ATCAGTCCAGTCACGCGTAC (서열번호 39)	59.829
seq_8435848_x1	(GA)1n	GACGATTACGCCCAGACGTA (서열번호 40)	59.622	20		GTCGTCACGAGTCGCAGC (서열번호 41)	61.167
seq_6284008_x1	(AC)n	CGAGGAGAACGACCATCAGG (서열번호 42)	59.899	20		TTTATTCTGTCAACGTCAGCAC (서열번호 43)	57.274
seq_1822185_x1	(TAT)n	AAACCCCTCGTGTTAGGAGG (서열번호 44)	59.018	20		ATGTTCACAGGTTCACATAGGT (서열번호 45)	57.359
seq_12671094_x1	(ATA)n	TCACAATGTTCACAGGTTCACA (서열번호 46)	58.385	22		CGTGTTAGGAGGAATAAGAAATTGA (서열번호 47)	57.157
seq_11486506_x1	(GAA)n	TGGGGGACAGTCTTGAAGGA (서열번호 48)	60.105	20		TTAAAAGGAGCGTCCAGGAG (서열번호 49)	57.237
seq_38151980_x1	(AG)n	GAGGTGTTGGACGGAGAAGG (서열번호 50)	60.037	20		GGGGGAGTGGGAGTGAGATA (서열번호 51)	59.735
seq_3859255_x1	(GA)n	AGTTAAGCAGGCACACGGAA (서열번호 52)	59.892	20		GCAATCACATCACAGCGAAGG (서열번호 53)	60.202
seq_52036214_x1	(TC)n	TCGACTCCCCTCCACTCTTT (서열번호 54)	59.885	20		AGGGGAGAGGAAGGAACTCC (서열번호 55)	59.957

3-4. 왕지네의 기원종 마커 검증

제작된 마커 후보군 중 표 8의 ID: seq_17064426_x1에 해당하는 (ATA)n 초위성체/유전변이를 검증에 사용하였다(해당 서열은 표 7, 표 8에 볼드체로 표시). ID: seq_17064426_x1에 해당하는 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 하기 조건에서 수행하였다: (1) 95℃ 3분, (2) 95℃ 30초, (3) 60℃ 30초, (4) 72℃ 40초, (5) 72℃ 5분. (2) ~ (4)는 33회 수행하였다.

도 12에서 알 수 있듯이 왕지네 기원종 특이적인 밴드를 확인하였다. 1번부터 65번 검체는 왕지네 기원종(한국, 중국 절강성, 중국 호북성)이며, 66번부터 102번 검체는 중국 유통품, 인도네시아, 라오스 검체로써, 왕지네 기원종(1~66)에서만 밴드가 확인되었다. 전기영동 결과 중 9번, 57번은 왕지네 기원종으로 최초 분류되었으나 예상과 달리 밴드가 확인되지 않았고, 90, 94번 검체는 인도네시아 검체로 최초 분류되었으나 밴드가 형성되었다. 이에 따라 미토콘드리아 COI (Cytochrome oxidase subunit) gene 시퀀싱을 수행하여 동정한 결과 최초 샘플 분류에 이상이 있는 것을 확인하였다. 샘플 9번, 57번은 왕지네 기원종이 아니었고, 90번, 94번은 왕지네 기원종으로 확인되었다. 따라서, 해당 마커를 이용하여, 한국, 중국 절강성 및 중국 호북성 유래의 왕지네와, 중국 유통품, 인도네시아 왕지네를 감별할 수 있으므로, 해당 마커가 정확히 작용하고 있음을 확인하였다.

실시예 정리

왕지네가 공유하는 유전체 분포를 통해 지리적으로 동북아 지역과 동남아 지역이 뚜렷히 구분됨을 알 수 있었으며, 특이적인 타겟 영역을 통해 동북아 지역과 동남아 지역을 구분하는 지리적 특이 마커로 활용하고, 각 그룹 내에서는 동일 유전체 위치에서 길이의 다형성과 유전변이를 통해 구분 마커를 탐색할 수 있을 것으로 생각된다.

<110> themoagen KOREA FOOD & DRUG ADMINISTRATION <120> Genetic marker for discriminating original species of Scolopendra subspinipes mutilans <130> 1 <160> 55 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 74 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 1 aatatttgca taatgcgaca cttcataaac gagagagaga gagatggcgg cgcaacgagc 60 acgtgcgtcg gacc 74 <210> 2 <211> 78 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 2 acacggcgaa atttctgcat gacacctcca cctcctcctc ctcctcctcg tatatggcac 60 gactattcgg ccaccctc 78 <210> 3 <211> 72 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 3 agatatcggc gaaaggcatc cgatccgacg acacacacac acaacgcacg tgctgacgtt 60 gacagaataa aa 72 <210> 4 <211> 66 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 4 aggtcgaccg agggcacaag gcaacgagga aacaacagta gttttggcag cagttgctgc 60 aaatcc 66 <210> 5 <211> 78 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 5 atgagagcga gcgaccagtg cggcagagga agagagagag agagagagaa cgagaacgtg 60 cgtgcctccg aggctttt 78 <210> 6 <211> 81 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 6 atgcgagtgc tgtcacgacc tgtgttgctc ttgttgttgt tgttgttgtt gagcgggaat 60 tgaaaaacgc gcgcgctccc a 81 <210> 7 <211> 75 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 7 attgaaagtt tatttaatgt ttctttgttg tattattatt attataatta tgattattat 60 tattatacct atgtg 75 <210> 8 <211> 75 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 8 caagccgacg ctcgcaattt taggaaaatt ttgttgttgt tgttgttata aaaaagaaaa 60 gtgaaaatgt tttga 75 <210> 9 <211> 75 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 9 cacataggta taataataat aatcataatt ataataataa taatacaaca aagaaacatt 60 aaataaactt tcaat 75 <210> 10 <211> 70 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 10 cgagcacgta agctgtactc gcctcctaac ctctctctct ttctgttcat cgctcttggc 60 aacagttaaa 70 <210> 11 <211> 78 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 11 cgcacgcacg cgtttctaat cacggtttcc ctctctctct ctctctctga cgaaagaaag 60 tagaggatga gaatacaa 78 <210> 12 <211> 78 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 12 gaaaagcctc ggaggcacgc acgttctcgt tctctctctc tctctctctt cctctgccgc 60 actggtcgct cgctctca 78 <210> 13 <211> 78 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 13 tcgcgccact gacgaactgg atggacgaag gaagaagaag aagaagaacc acctcctgga 60 cgctcctttt aatacgac 78 <210> 14 <211> 81 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 14 tgggagcgcg cgcgtttttc aattcccgct caacaacaac aacaacaaca agagcaacac 60 aggtcgtgac agcactcgca t 81 <210> 15 <211> 64 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 15 tggttttaac gcttgtggag aaaatgagat agagaaggga aaaagaaact gatgattcat 60 ttgc 64 <210> 16 <211> 70 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 16 tttaactgtt gccaagagcg atgaacagaa agagagagag gttaggaggc gagtacagct 60 tacgtgctcg 70 <210> 17 <211> 88 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 17 aaaattatat atttaatctt atattagatt aataaataaa taaataaata aataaataaa 60 ccactactat cagattgtga gataagcg 88 <210> 18 <211> 82 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 18 aaacactttt aatatcccac acccatctcc ctctctctct ctctctctct ctcgatgtct 60 tcctctctcc ttcaaccatc tt 82 <210> 19 <211> 84 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 19 aaacggggtg gtgctgggag gaggtgatgt aggaggagga ggaggaggag gaggagaacg 60 aggagacgga tatacggtga gatt 84 <210> 20 <211> 84 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 20 aacttccatt tcgatcaaat ttcatttgac ataataataa taataataat aataaagatt 60 atataaaaaa agttaaaatt catt 84 <210> 21 <211> 76 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 21 aatgcttcga gagctcctcg cgatatttca tctctctctc tctctcctct ttctctaccc 60 acagacgtta ccaaat 76 <210> 22 <211> 74 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 22 aatatttgca taatgcgaca cttcataaac gagagagaga gagatggcgg cgcaacgagc 60 acgtgcgtcg gacc 74 <210> 23 <211> 72 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 23 agatatcggc gaaaggcatc cgatccgacg acacacacac acaacgcacg tgctgacgtt 60 gacagaataa aa 72 <210> 24 <211> 75 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 24 attgaaagtt tatttaatgt ttctttgttg tattattatt attataatta tgattattat 60 tattatacct atgtg 75 <210> 25 <211> 75 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 25 cacataggta taataataat aatcataatt ataataataa taatacaaca aagaaacatt 60 aaataaactt tcaat 75 <210> 26 <211> 78 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 26 tcgcgccact gacgaactgg atggacgaag gaagaagaag aagaagaacc acctcctgga 60 cgctcctttt aatacgac 78 <210> 27 <211> 64 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 27 tggttttaac gcttgtggag aaaatgagat agagaaggga aaaagaaact gatgattcat 60 ttgc 64 <210> 28 <211> 88 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 28 aaagttaagc aggcacacgg aattagatcc gagagagaga gagagagaga gagagagagc 60 caagggagga tgaattcctt cgctgtga 88 <210> 29 <211> 72 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Scolopendra subspinipes mutilans <400> 29 tcttttttac acagtgatta acttttttca tctctctctc tcttctttct tctttcatta 60 ccacttataa ac 72 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD <400> 30 gtggaaagag gtggtcgtga 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REVERSE <400> 31 agcgccgctt atctcacaat 20 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD <400> 32 cccagcaaac acttttaata tccca 25 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REVERSE <400> 33 tctcagtctg cagaagatgg t 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD <400> 34 ggataaaacg gggtggtgct 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REVERSE <400> 35 acacgaagct cagttgacac t 21 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD <400> 36 cagctttaaa cttccatttc gatca 25 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REVERSE <400> 37 tgtcttgtgt tatttccaga aacagt 26 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD <400> 38 caccgcaaat gcttcgagag 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REVERSE <400> 39 atcagtccag tcacgcgtac 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD <400> 40 gacgattacg cccagacgta 20 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REVERSE <400> 41 gtcgtcacga gtcgcagc 18 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD <400> 42 cgaggagaac gaccatcagg 20 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REVERSE <400> 43 tttattctgt caacgtcagc ac 22 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD <400> 44 aaacccctcg tgttaggagg 20 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REVERSE <400> 45 atgttcacag gttcacatag gt 22 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD <400> 46 tcacaatgtt cacaggttca ca 22 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REVERSE <400> 47 cgtgttagga ggaataagaa attga 25 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD <400> 48 tgggggacag tcttgaagga 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REVERSE <400> 49 ttaaaaggag cgtccaggag 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD <400> 50 gaggtgttgg acggagaagg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REVERSE <400> 51 gggggagtgg gagtgagata 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD <400> 52 agttaagcag gcacacggaa 20 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REVERSE <400> 53 gcaatcacat cacagcgaag g 21 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD <400> 54 tcgactcccc tccactcttt 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> REVERSE <400> 55 aggggagagg aaggaactcc 20

Claims (13)

1. 서열번호 20의 염기서열로 구성된 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 서열번호 20의 염기서열은 초위성체(microsatellite) 또는 유전변이를 포함하는 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커.
3. 청구항 2에 있어서,
   상기 초위성체는 아데닌-티민-아데닌 모티프가 n회 반복된 것인 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커.
4. 청구항 2에 있어서,
   상기 유전변이는 초위성체 및 이의 양 측면에 위치하는 인접 서열이 왕지네의 유전체(genome) DNA에 존재하는 것인 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커.
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 왕지네의 기원종은 동북아 지역의 왕지네인 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커.
6. 청구항 1의 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커를 검출하기 위한, 왕지네의 기원종 감별용 프라이머 세트.
7. 청구항 6에 있어서,
   상기 왕지네의 기원종 감별용 프라이머 세트는 서열번호 36의 염기서열로 구성된 프라이머; 및 서열번호 37의 염기서열로 구성된 프라이머;를 포함하는 프라이머 세트인 왕지네의 기원종 감별용 프라이머 세트.
8. 청구항 6의 프라이머 세트를 포함하는, 왕지네의 기원종 감별용 조성물.
9. 청구항 6의 프라이머 세트를 포함하는, 왕지네의 기원종 감별용 키트.
10. 왕지네로부터 총 DNA를 추출하는 DNA 추출 단계;
    추출된 총 DNA를 주형으로 청구항 1의 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 상기 유전자 마커를 증폭하는 증폭 단계; 및
    증폭된 산물을 전기영동하여 밴드의 유무를 확인하는 단계;를 포함하는 왕지네의 기원종 감별 방법.
11. 청구항 10에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 36의 염기서열로 구성된 프라이머; 및 서열번호 37의 염기서열로 구성된 프라이머;를 포함하는 프라이머 세트인 왕지네의 기원종 감별 방법.
12. 청구항 10에 있어서,
    상기 전기영동하여 밴드의 유무를 확인하는 단계에서, 밴드가 나타나는 경우 왕지네의 기원종인 것으로 판단하는 왕지네의 기원종 감별 방법.
13. 청구항 12에 있어서,
    상기 왕지네의 기원종은 동북아 지역의 왕지네인 왕지네의 기원종 감별 방법.
    
    

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