KR20160090611A

KR20160090611A - Dna 바코드를 이용한 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별법 및 이를 위한 유전자 마커

Info

Publication number: KR20160090611A
Application number: KR1020150010630A
Authority: KR
Inventors: 이우규; 성락선; 왕진호; 한순영; 김종환; 문춘선; 강일현; 이규하; 최선아; 김예지; 박장미
Original assignee: 대한민국 (식품의약품안전처장)
Priority date: 2015-01-22
Filing date: 2015-01-22
Publication date: 2016-08-01
Also published as: KR101668112B1

Abstract

본 발명은 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 유전자 마커, 삽입 및 결실(Indel)의 유전적 변이의 존재 여부를 검출하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 조성물 또는 키트, 및 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 개발한 유전자 마커 및 이를 이용한 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법은 PCR 산물의 사이즈 크기 확인만으로도 손쉽게 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 정확히 구별할 수 있는 특징이 있다.

Description

DNA 바코드를 이용한 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별법 및 이를 위한 유전자 마커 {Method and Genetic marker for discriminating of Angelicae Gigantis Radix and Japanese Angelicae Radix by using DNA barcode}

본 발명은 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 품목 판별용 유전자 마커, 상기 유전자 마커의 존재 여부를 검출하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 조성물 또는 키트, 및 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법에 관한 것이다.

국내에서 생산 및 유통되고 있는 한약재는 기원이 부정확하거나 명칭이 유사하여 혼·오용되는 사례가 많다. 뿐만 아니라 한국, 중국, 일본 등의 한약재를 사용하는 나라에서 한약재의 기원종을 각 나라의 약전마다 다르게 규정하고 있어 80% 이상을 수입에 의존하고 있는 우리나라는 이러한 혼·오용의 위험이 높다. 이러한 혼·오용의 위험이 높은 한약재 중 하나인 당귀(當歸)는 그 기원에 대하여 한국, 중국 및 일본의 공정서에는 산형과(Umbelliferae)의 각기 다른 기원식물을 수재하고 있다.

우리나라에서는 당귀(當歸, Angelicae Gigantis Radix)의 기원식물로 대한민국약전 (KP10, 2012)에서 산형과(Umbelliferae)인 참당귀(Angelica gigas Nakai)의 뿌리로 수재되어 있고, 일당귀(日當歸, Japanese Angelicae Radix)는 대한민국약전외한약(생약)규격집 (KHP, 2012)에 산형과의 일당귀(Angelica acutiloba Kitagawa) 또는 북해도당귀(Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)의 뿌리로 수재하고 있다. 일본에서는 당귀의 기원식물로 일본약국방 (JP, 2011)에 일당귀 (Angelica acutiloba Kitagawa)와 북해도당귀(Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)로 수재되어 있고, 이것은 그 기원이 KHP의 일당귀와 동일하다.

또한 각국의 약전에 수재된 당귀의 기원식물 별로 이화학적 성분이 달라 약용으로 사용하기 위해서는 정확한 감별이 필요하다. 참당귀, 일당귀 및 북해도당귀는 같은 속(屬, genus) 식물이지만 뿌리에 함유되어 있는 주요성분이 달라서 한국, 일본, 중국에서 각각 다르게 이용되고 있다. 한약재 당귀의 성분은 데쿠르신(decursin), 데쿠르시놀(decursinol), 노다케닌(nodakenin), 리모넨(limonene) (Kim et al., 2008)이고, 한약재 일당귀에는 (Z)-리구스틸라이드((Z)-ligustilide), 부틸라이덴프탈라이드(butylidenphthalide) (Wang et al., 1999; Matsumoto et al., 1998)등이 함유되어 있어 그 성분이 각각 달라 약효의 차이가 있으므로 혼용과 오용의 방지를 위해 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 명확한 구별법의 확립이 필요하다. 특히 한약재 당귀와 한약재 일당귀는 절단된 상태의 한약재로 제조되었을 경우 식별하기가 쉽지 않다.

따라서 보다 정확한 한약재의 명확한 기원을 판단할 수 있는 방법으로 분자생물학적 방법들이 제시되고 있다. 분자생물학적 방법들은 비교적 짧은 시간과 저렴한 비용으로 정확한 정보를 얻을 수 있으며, 소량의 시료로 분석이 가능하다는 장점이 있다 (Ha et al., 2005). 과거에는 RAPD (random amplified polymorphic DNA), RFLP (restriction fragment length polymorphism), AFLP (amplified fragment length polymorphism) 등의 방법이 이용되어 왔고 당귀에 대해서도 RAPD 마커 개발에 대한 연구(Bang et al., 2002)가 발표되었으나, 분자생물학적 방법에 의한 구별은 미진한 실정이다.

최근의 분자생물학적 방법을 이용한 종 감별 연구는 국제 생물바코드컨소시엄(CBOL; Consortium for Barcode of Life)이 제안하고 있는 엽록체(chloroplast) DNA 부위와 중국의과학연구원(Id1t-ITS2)에서 제안하고 있는 핵(nuclear) DNA의 ITS 부위를 이용한 표준화된 DNA 바코드를 종 감별에 활용하고 있다. 유전체 (genome) 상에 존재하는 엽록체 유전자(chloroplast gene)와 핵 리보솜 DNA 유전자(Nuclear Ribosomal DNA gene, nrDNA)의 nrDNA-ITS2 부위는 다른 유전자의 코딩 부위보다 빠르게 진화할 뿐만 아니라 일반성, 단순성, 높은 재현성 등의 이점으로 인해 널리 사용되고 있다(Kim et al., 2005).

이러한 DNA 바코드는 미지의 식물에 대한 종 동정(identification), 계통분류학적 유연관계 분석과 같은 식물분류학적 연구 뿐만 아니라 한약재의 기원종 감별에도 활용되고 있는데 지모(知母, Anemarrhena asphodeloides Bunge, Kim et al., 2008), 형개(荊芥, Schizonepeta tenuifolia Briquent, Jiden et al., 2009) 등에서 엽록체 유전자인 trnL-trnF 부위를 이용한 연구를 통해 DNA 바코드를 이용한 기원종 감별이 가능하고 유용하다는 것을 확인하였다.

본 발명과 유사하게 ITS (internal transcribed spacer) 부위의 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법을 이용한 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하기 위한 특허(출원번호 10-2005-0056866, 공개번호 10-2007-0001401)가 있으나, 염기서열분석은 고가의 염기서열분석기(sequencer)가 필요하고 분석 결과의 해석을 위한 전문적인 인력이 필요한 문제점이 있다.

이에, DNA 바코드를 이용하여 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 간단하게 판별할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.

대한민국 공개특허공보 제10-2007-0001401호, 2007년 1월 4일 공개

본 발명자들은 염기서열 분석보다 빠르게 육안으로 한약재 당귀를 정확하게 판별할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 한약재 당귀에 특이적으로 존재하는 염기서열 부위를 발견하고 이를 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 구별하는 유전자 마커로 개발하였다. 또한, 해당 유전자 마커의 존재여부를 확인할 수 있는 특정 프라이머 세트를 개발하고, 해당 프라이머 세트를 사용하여 육안으로 정확히 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 손쉽게 판별함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 한약재 당귀의 판별용 유전자 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열로 구성된 한약재 당귀 판별용 유전자 마커를 제공한다.

상기 마커는 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 마커의 존재 여부를 검출하기 위한, 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머 세트는 서열번호 5의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 프라이머를 포함할 수 있다.

상기 한약재 당귀의 기원식물은 참당귀(Angelica gigas Nakai)이며, 상기 한약재 일당귀의 기원식물은 일당귀(Angelica acutiloba Kitagawa) 또는 북해도당귀 (Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)이다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 조성물을 제공한다

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 분석하고자 하는 당귀 시료에서 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법은, 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀에서 서열번호 1을 얻고, 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀와 북해도당귀에서 서열번호 2와 서열번호 3을 얻은 후 이들을 비교해 서열번호 1 또는 서열번호 4로 구성된 염기서열의 존재가 확인되면 한약재 당귀인 것으로 판별하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법은, 분석하고자 하는 당귀 시료에서 추출한 DNA에 대해 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 PCR 산물의 크기를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법은 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 개발한 유전자 마커 및 이를 이용한 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법은, PCR 산물의 사이즈 크기 확인만으로도 간단하게 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 정확히 구별할 수 있다. 이에 따라 정확한 기원의 당귀 원료를 공급하고 당귀의 품질관리 방법으로 활용될 수 있다.

도 1은 서열번호 5 및 6의 염기서열로 구성된 Angelica indel-atpH-atpI-F/R 프라이머 세트를 이용하여 PCR 수행한 결과를 나타낸 것이다. PCR 산물의 크기 차이로 한약재 당귀(참당귀)와 한약재 일당귀(일당귀, 북해도당귀)가 명확히 구별되었다.
도 2는 한약재 당귀(참당귀), 한약재 일당귀(일당귀 및 북해도당귀)의 atpH-atpI 염기서열 비교 결과를 나타낸 것이다. 붉은 색으로 표시한 221 bp 의 삽입 및 결실(indel)이 확인되어 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀와 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀 및 북해도당귀가 명확히 구별되어 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 구별이 가능함을 나타낸다(A. gigas, 참당귀; A. acutiloba, 일당귀; A. acutiloba var sugiyamae, 북해도당귀).

본 발명은 한약재 당귀(Angelicae Gigantis Radix)와 한약재 일당귀(Japanese Angelicae Radix)의 판별을 위한 DNA 바코드 염기서열과 유전자 마커(marker)에 관한 것이다.

과거 발표된 RAPD (Random amplified polymorphic DNA), RFLP (Restriction fragment length polymorphism) 및 AFLP (Amplified fragment length polymorphism)와 달리 새롭게 각광 받고 있는 식물의 엽록체 유전자 부위의 염기서열을 이용한 식물 DNA 바코드 방법을 이용해 정확성과 높은 재현성을 바탕으로 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀(Angelica gigas Nakai)와 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀(Angelica acutiloba Kitagawa) 및 북해도당귀(Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)에 대한 염기서열 분석 및 분자 마커 개발을 통해 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 구별하고자 한다.

구체적으로, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열로 구성된 한약재 당귀 판별용 유전자 마커에 관한 것이다.

본 발명에서는 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀에 존재하는 엽록체 상의 유전자인 atpH-atpI 염기서열을 분석하여 한약재 당귀(참당귀)에 특이적으로 존재하는 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열이 존재함을 처음으로 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 참당귀(Angelica gigas Nakai)의 atpH-atpI 염기서열은 서열번호 1의 염기서열로 구성되며, 일당귀(Angelica acutiloba Kitagawa)의 염기서열은 서열번호 2의 염기서열로 구성되고, 북해도당귀(Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)의 atpH-atpI 염기서열은 서열번호 3의 염기서열로 구성됨을 최초로 확인하였다. 또한, 본 발명에서는 참당귀의 염기서열과 비교했을 때, 일당귀와 북해도당귀에서 221 bp의 삽입 및 결실(indel)을 최초로 확인함으로써, 이를 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 구별할 수 있는 유전자 마커로 개발하였다.

이에 따라, 본 발명에서 처음 밝힌, 참당귀, 일당귀, 북해도당귀의 atpH-atpI 유전자 부위는 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별을 위한 DNA 바코드로 사용할 수 있다.

또한, 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열로 구성된 한약재 당귀 판별용 유전자 마커의 존재 여부를 검출하기 위한, 한약재 당귀와 한약재 일당귀 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 특정 유전자 서열을 증폭하기 위해 합성된 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀에 특이적으로 존재하는 염기서열로 구성된 유전자 마커를 확인한 후, 해당 유전자 마커가 포함되는 부위를 PCR 증폭하여 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 구별할 수 있는 프라이머 세트를 개발하였다.

상기 프라이머 세트는 서열번호 1 또는 서열번호 4로 구성된 DNA의 염기서열을 증폭하여, PCR 산물의 사이즈 크기 또는 염기서열 분석을 통해 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 구별할 수 있는 프라이머 세트를 모두 포함한다. 바람직하게는, 서열번호 5의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 프라이머를 포함한다.

본 발명에서 한약재 당귀의 기원식물은 참당귀(Angelica gigas Nakai)이다. 또한, 한약재 일당귀의 기원식물은 일당귀(Angelica acutiloba Kitagawa) 또는 북해도당귀 (Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열로 구성된 한약재 당귀 판별용 유전자 마커의 존재 여부를 검출하기 위한 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 프라이머 세트를 포함하는, 한약재 당귀와 한약재 일당귀 판별용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.

상기 "한약재 당귀와 한약재 일당귀 판별용 조성물"은 한약재 당귀와 한약재 일당귀 판별용 프라이머 세트와 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는데 필요한 PCR 반응용 완충용액, DNA 중합효소, dNTP 또는 상기 조성물과 분자마커의 결합(hybridization) 반응을 수행하는데 필요한 버퍼 등을 포함할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

상기 “키트”는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 한약재 당귀와 한약재 일당귀 판별용 프라이머 세트를 포함하는 용기, PCR 반응용 완충용액 및 DNA 중합효소를 함유하는 용기를 포함한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.

상기 조성물 또는 키트에 포함되는 프라이머 세트는 서열번호 5 및 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머를 하나 이상 포함할 수 있다.

상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 포함하며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 분석하고자 하는 당귀 시료에서 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "당귀 시료"는 품목을 확인하고자 하는 당귀의 조직을 말하며, 당귀의 뿌리, 잎, 줄기 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 방법에서 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열의 존재가 확인되면 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀 품목인 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로, 분석하고자 하는 당귀 시료에서 추출한 DNA에 대해 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 PCR 산물의 크기를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 당귀 시료에서 추출한 DNA에 대해 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계는, 당귀 시료에서 분리된 지노믹 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여, 표적 서열을 증폭하는 단계이다.

상기 증폭된 PCR 산물의 크기를 확인하는 단계는 전기 영동 등의 방법으로 확인할 수 있다. 전기영동의 구체적인 예로는 자동 전기영동장치(칩 및 모세관 방식포함), 아크릴아마이드 겔, 또는 아가로스 겔 전기영동일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트를 사용하여 당귀 시료에서 추출한 DNA를 중합효소 연쇄반응으로 증폭한 결과, 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀(A. gigas Nakai)에서 467 bp의 PCR 산물이 확인되었고, 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀(A. acutiloba Kitagawa)와 북해도당귀(Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)에서 246 bp의 PCR 산물이 확인되어 2개의 품목간 PCR 산물의 크기가 명확히 구별되었다(실시예 6).

전기영동에 의한 판독은 판독자에 따라 감별 결과가 달라질 수 있으나, 그 오차를 줄이는 방법으로는 PCR 산물의 사이즈 차이가 큰 마커(marker)를 이용하는 것이 한 방법이다. 본 발명은 도 1과 같이 비전문가가 판별하였을 때도 충분히 참당귀와 일당귀의 구별이 가능한 크기 차이(221 bp)를 보이는 PCR 산물을 얻을 수 있다. 따라서, 간단한 방법으로 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 정확하게 구별할 수 있다.

또한, 본 발명의 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법에서, 증폭된 PCR 산물의 크기를 확인하는 것에 추가로 상기 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계를 추가로 포함할 수있다.

증폭된 PCR 산물의 염기서열의 분석은 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 분석할 수 있다. 염기서열 분석 결과, 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열이 존재하게 되면 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀로 판별할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀, 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀 및 북해도당귀의 atpH-atpI 염기서열을 비교한 결과에서 221 bp의 삽입 및 결실(Indel)이 확인되어 명확히 구별됨에 따라, PCR 산물의 크기 차이 뿐만 아니라 추가적으로 염기서열 분석을 추가로 수행하면 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 보다 정확히 판별할 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 실험재료로 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀의 경우 식품의약품안전처에서 분양하고 있는 기원이 명확한 표준생약과 전국 각지에서 수집된 다양한 개체를 사용하였고, 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀와 북해도당귀의 경우 국내 재배품목 뿐만 아니라 일본에서 재배되고 있는 품목까지 기원확인 후 분석하여 본 발명의 신뢰성을 높였다. 또한 본 발명에서는 발명에 이용된 실험재료 각각에서 얻어진 PCR 산물에 대한 염기서열을 분석함으로써 본 발명에 사용된 atpH-atpI 부위의 종내 염기서열변이 여부를 확인하여 PCR 산물의 크기에 영향을 줄 수 있는 요소가 없음을 검증함으로써 본 발명의 신뢰성이 높음을 입증하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 사용한 식물 재료

본 발명에서 이용한 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀는 식품의약품안전처에서 분양하고 있는 기원이 명확한 표준생약과 우리나라 각지에서 수집된 것을 기원확인 후 이용하였고, 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀와 북해도당귀는 국내 뿐만 아니라 일본에서 재배되고 유통되는 품목까지 기원확인 후 사용하였다. 하기 표 1은 본 발명에서 사용한 식물 재료를 나타낸 것이다.

기원식물	번호	검체 번호	구분	형태	수집지역
참당귀 Angelica gigas	1	ANG_GIG_130001	표준 생약	가루	식품의약품안전처 분양
	2	ANG_GIG_130009-2	재배	전초	강원도 평창군
	3	ANG_GIG_130009-4	재배	전초
	4	ANG_GIG_130009-9	재배	전초
	5	ANG_GIG_130009-11	재배	전초
	6	ANG_GIG_130009-13	재배	전초
	7	ANG_GIG_130010-1	재배	전초	충청북도 제천시
	8	ANG_GIG_130010-2	재배	전초
	9	ANG_GIG_130010-3	재배	전초
	10	ANG_GIG_130011-1	재배	전초	충청북도 제천시
	11	ANG_GIG_130011-2	재배	전초
	12	ANG_GIG_130011-3	재배	전초
	13	ANG_GIG_130011-4	재배	전초
	14	ANG_GIG_130011-5	재배	전초
	15	ANG_GIG_130011-6	재배	전초
	16	ANG_GIG_130011-7	재배	전초
	17	ANG_GIG_130011-8	재배	전초
	18	ANG_GIG_130012-1	재배	전초	경상북도 봉화군
	19	ANG_GIG_130012-3	재배	전초	경상북도 봉화군
	20	ANG_GIG_130013-1	재배	전초	경상북도 봉화군
	21	ANG_GIG_130013-2	재배	전초
	22	ANG_GIG_130013-3	재배	전초
	23	ANG_GIG_130013-4	재배	전초
	24	ANG_GIG_130014-1	재배	전초	경상북도 봉화군
	25	ANG_GIG_130014-2	재배	전초
	26	ANG_GIG_130014-3	재배	전초
	27	ANG_GIG_130015-1	재배	전초	경상북도 봉화군
	28	ANG_GIG_130015-2	재배	전초	경상북도 봉화군
	29	ANG_GIG_130016-2	재배	전초	경상북도 안동시
	30	ANG_GIG_130016-3	재배	전초
	31	ANG_GIG_130016-4	재배	전초
	32	ANG_GIG_130016-5	재배	전초
	33	ANG_GIG_130016-6	재배	전초
	34	ANG_GIG_130002	유통품	절편	중국
	35	ANG_GIG_130003	유통품	절편	경상북도
	36	ANG_GIG_130004	유통품	절편	충청북도
	37	ANG_GIG_130005	유통품	절편	경상북도
	38	ANG_GIG_130006	유통품	절편	충청북도
	39	ANG_GIG_130007	유통품	절편	한국
일당귀 Angelica acutiloba	40	ANG_ACU_130001-1	재배	전초	전라남도 장흥군
	41	ANG_ACU_130003	유통품	절편	강원도
	42	ANG_ACU_130004	유통품	절편	경상북도
	43	ANG_ACU_130006	유통품	절편	강원도 정선군
	44	ANG_ACU_130007	유통품	절편	강원도 평창군
	45	ANG_ACU_130009-3	재배	전초	강원도 평창군
	46	ANG_ACU_130010-1	재배	전초	강원도 평창군
	47	ANG_ACU_130010-2	재배	전초	강원도 평창군
	48	ANG_ACU_130011-1	재배	전초	충청북도 제천시
	49	ANG_ACU_130012-1	재배	전초	경상북도 안동시
	50	ANG_ACU_130013-1	재배	전초	강원도 평창군
	51	ANG_ACU_130013-2	재배	전초	강원도 평창군
	52	ANG_ACU_130014-522	재배	전초	일본 훗카이도 나요로
	53	ANG_ACU_130014-523	재배	전초
	54	ANG_ACU_130014-524	재배	전초
	55	ANG_ACU_130014-525	재배	전초
	56	ANG_ACU_130015-618	재배	전초	일본 훗카이도 아바시리시
	57	ANG_ACU_130015-619	재배	전초
	58	ANG_ACU_130015-620	재배	전초
북해도당귀 Angelica acutiloba Kitagawa var. Sugiyamae	59	ANG_ACU_V.SUG 130001-4	재배	전초	충청북도 제천시
	60	ANG_ACU_V.SUG 130001-5	재배	전초	충청북도 제천시
	61	ANG_ACU_V.SUG 130007-526	재배	전초	일본 훗카이도 나요로
	62	ANG_ACU_V.SUG 130007-527	재배	전초
	63	ANG_ACU_V.SUG 130007-528	재배	전초

실시예 2: DNA 추출(DNA extraction)-QIAGEN DNeasy plant mini kit (Cat No. 69109) 사용

기원이 확인된 당귀 약재 샘플 20-100 mg을 액체 질소로 얼려 막자와 막자사발로 곱게 갈아 분말 상태로 만들었다. 분말 시료를 2 mL 튜브에 옮겨 담아 400 ㎕의 AP1 용액과 4 ㎕ RNase A를 첨가한 후, 완전히 섞어주고(vortex) 65 ℃ 항온기에서 30 분간 처리하였다. 이 반응물에 P3용액을 130 ㎕ 첨가하여 완전히 섞이도록 흔들어 준 다음, 5-10 분간 아이스(ice)에 넣어 두고, 14,000 rpm으로 5 분간 원심분리하였다. 반응물의 상층액을 취하여 QIAshredder 스핀 컬럼(spin column)에 넣고 14,000 rpm으로 2 분간 원심분리 하였다.

걸러진 반응물을 취하여 새 1.5 mL 튜브에 옮겨 담고, 1.5 배의 AW1 용액을 넣어 뭉쳐짐(pellet)이 생기지 않도록 잘 섞어주었다. 이 반응물을 DNeasy 미니 스핀 컬럼(Mini spin column)에 넣고 8,000 rpm으로 1 분간 원심분리 하였다. 걸러진 용액은 버리고 500 ㎕의 AW2 용액을 컬럼에 넣고 14,000 rpm으로 2 분간 원심분리 하였다.

걸러진 용액은 버리고 500 ㎕의 AW2 용액을 컬럼에 한 번 더 넣고 8,000 rpm으로 1 분간 원심분리 하였다. 이후 걸러진 용액을 버리고 컬럼을 새 1.5 mL 튜브에 옮겨 끼우고 AE 용액 100 ㎕을 넣어 5 분간 상온(15-25 ℃)에 방치한 후 8,000 rpm으로 1 분간 원심분리 하여 DNA를 추출해냈다. 추출된 DNA를 1.5 % 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동(Electrophoresis)하여 확인한 후 DNA 순도 및 농도를 측정하였다. PCR에서 DNA의 농도가 높거나 순도가 낮으면 증폭이 되지 않을 수 있으므로 PCR을 위한 주형 DNA는 농도와 순도를 PCR 조건에 적합하도록 분리 정제하였다 (유전자 순도: A 260 nm/A 280 nm = 1.6 ~ 2.0).

실시예 3: 참당귀 판별용 프라이머 제작 및 DNA 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 증폭

한약재 당귀의 기원식물인 참당귀와 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀, 북해도당귀에 존재하는 엽록체 유전자인 atpH-atpI의 염기서열을 분석하고 이를 비교하여 한약재인 당귀와 한약재 일당귀 사이에 221 bp의 삽입 및 결실(indel, insertion and deletion)을 확인하였다. 이에, 한약재 참당귀와 한약재 일당귀를 구별하기 위하여 상기 발견한 삽입과 결실(indel) 부분을 증폭할 수 있게 프라이머를 고안해냈다. 이 프라이머는 PCR 산물을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 얻어진 PCR 산물의 염기서열분석에도 사용할 수 있었다. 이 프라이머의 상세 염기서열은 아래와 같았다.

정방향 프라이머: CGCCTTTCTTCCATAACGTA (서열번호 5)

역방향 프라이머: CTGGTCGGCCAATCCTAATA (서열번호 6)

유전자 증폭반응을 위하여 상용화된 PCR 키트에 상기 서열번호 5의 정방향 프라이머(Forward primer(10 pmole)) 1 ㎕, 역방향 프라이머(Reverse primer(10 pmole)) 1 ㎕와 정량한 주형 DNA 1 ㎕ (농도 약 20 ng/㎕)를 혼합하고, 정제수를 첨가하여 최종반응 용량을 총 20 ㎕로 하였다. 반응조건은 94 ℃에서 3 분간 예비변성(pre-denaturation) 한 후 94 ℃에서 30 초 변성(denaturation), 55 ℃에서 30 초간 결합(annealing), 72 ℃에서 30 초간 증폭(extension)하고 변성부터 증폭까지의 과정을 34 회 반복한 다음, 72 ℃에서 5 분간 최종증폭(final extension)을 시켜 DNA 증폭산물을 얻었다. 구체적인 온도, 시간, 및 반복수는 하기 표 2와 같았다.

단계	온도(℃)	시간	반복 수 (Cycles)
예비변성(Predenaturation)	94 ℃	3 분	1
변성(Denaturation)	94 ℃	30 초	34
결합(Annealing)	55 ℃	30 초
증폭(Extension)	72 ℃	1 분
최종증폭(Final extension)	72 ℃	5 분	1
보존	8 ℃	-	-

실시예 3: 전기영동

아가로즈 겔의 첫 번째 홈에 PCR 증폭산물의 크기를 식별할 수 있는 사이즈 마커(100 bp)를 넣고, 두 번째 홈부터 PCR 증폭산물을 넣었다. 전기영동의 전압과 시간은 겔의 농도와 크기에 따라 조절하였다(아가로즈 겔 1.5-2 %, 전기영동 70~100 V, 30분). 전기영동이 끝난 겔은 브롬화 에티듐(Ethidium bromide(EtBr), 브로마이드) 염색법으로 처리하여 증폭산물을 확인하였다.

실시예 4: PCR 증폭산물의 정제

20 ㎕ PCR 증폭산물을 1.5 mL tube에 옮기고, 정제수를 넣어 총 100 ㎕로 하였다. 3 M 아세트산 나트륨(sodium acetate) 10 ㎕, 100 % 에탄올(냉장보관) 275 ㎕를 차례로 넣은 후, 수차례 교반한 뒤 4 ℃에서 30 분간 방치하였다. 이 반응물을 13,000 rpm으로 4 ℃에서 10 분간 원심분리한 뒤 상층액을 버리고, 침전된 DNA를 70 % 에탄올(냉장보관) 500 ㎕로 2 ~ 3회 세척하고 상온에서 자연건조 시켰다.

실시예 5: 염기서열 분석(Sequencing)

PCR 증폭산물을 EtOH 침전법으로 정제한 후 Tris-EDTA(TE) 완충용액에 녹였다. TE 완충용액에 녹인 DNA를 주형으로 하여 염기서열 분석용 PCR을 수행하였다. 염기서열 분석을 위한 PCR 반응액의 조성은 하기 표 3과 같았다.

	농도	분량
PCR 증폭산물	20 ng/㎕	1 ㎕
염기서열 분석용 프리믹스	-	4 ㎕
정방향 프라이머 (또는 역방향 프라이머)	10 pmole	1 ㎕
정제수(D.D.W.)		14 ㎕
전체량		20 ㎕

반응조건은 94 ℃에서 3 분간 예비변성(pre-denaturation) 한 후 94 ℃에서 30 초 변성(denaturation), 52 ℃에서 30 초간 결합(annealing), 72 ℃에서 30 초간 증폭(extension)하고 변성부터 증폭까지의 과정을 34 회 반복한 다음, 72 ℃에서 5 분간 최종증폭(final extension)을 시켜 DNA 증폭산물을 얻었다.

PCR 증폭산물을 EtOH 침전법으로 정제한 후 포름아미드(formamide) 10㎕에 DNA를 녹였다. 그 후 자동 염기서열 분석기를 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다.

Bioedit 7.0.9.0 및 MEGA 5.1 프로그램을 이용하여, PCR에 사용한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 분석한 염기서열과 크로마토그램을 직접 비교하여, 하나의 염기서열로 만드는 염기서열 정렬(Sequence alignment)을 하였다.

실시예 6: PCR 수행으로 참당귀와 일당귀의 구별

상기 설명한 실험방법에 명시한 조건으로 PCR한 결과, 도 1과 같이 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀(A. gigas Nakai)에서 467 bp의 PCR 산물이 확인되었고, 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀(A. acutiloba Kitagawa)와 북해도당귀(Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)에서 246 bp 의 PCR 산물이 확인되어, 참당귀, 일당귀 및 북해도 당귀가 명확히 구별되었다. 이는 간단한 PCR 수행을 통해 비전문가라도 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 육안으로 명확히 구별할 수 있음을 시사하는 것이다.

실시예 7: 염기서열 분석 결과

상기 실시예 5를 통해 참당귀, 일당귀 및 북해도당귀의 atpH-atpI 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 참당귀의 atpH-atpI 염기서열은 서열번호 1(467 bp)로 표시된 서열과 같았으며, 일당귀 및 북해도당귀의 atpH-atpI 염기서열은 각각 서열번호 2(246 bp)와 3(246 bp)으로 표시된 서열과 같았다. 참당귀, 일당귀 및 북해도당귀 모두 PCR에 사용된 Angelica indel-atpH-atpI-F/R을 이용해 분석된 결과이고, 두 결과를 비교하였을 때 221 bp의 삽입 및 결실(indel) 부위(서열번호 4)를 발견하였다.

도 2는 참당귀, 일당귀 및 북해도당귀의 atpH-atpI 염기서열 비교한 결과를 나타낸 것으로서, 도면 상에서 붉은 색으로 표시한 221 bp의 삽입 및 결실(Indel)이 확인되어 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀와 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀 및 북해도당귀가 명확히 구별되어 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 구별이 가능함을 시사하는 것이다.

실시예 8: 종내 염기서열 변이 확인

본 발명에 이용된 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀 39 개체, 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀 19 개체 및 북해도당귀 5개체(표 1 참고)에서 atpH-atpI 구간의 염기서열분석 결과 종내 염기서열변이가 확인되지 않았다. 이 확인 시험 결과에서 볼 때 PCR 산물의 크기에 영향을 줄 요소가 없음이 확인되었고, 본 발명에서 개발한 프라이머를 통해 얻어진 PCR 산물의 크기 차이와 염기서열분석 모두에서 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 명확히 구별할 수 있음을 제시하는 바이다

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<110> KOREA FOOD & DRUG ADMINISTRATION <120> Gene marker for discriminating cultivars of Angelica gigas Nakai and Japanese Angelicae Radix <130> APC-14-0101 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 467 <212> DNA <213> Angelica gigas Nakai <400> 1 cgcctttctt ccataacgta aaccaactct tcattcatct taaattcaat cgaattcgag 60 aattatgcgt cgaaaaacaa gttgactttt agcatagcgc ttttttacat ataatatacc 120 tagtaaaacc tccctctccg atccgaatca ccctattttt tatgaatccc ttttttgttt 180 gtaaatactt cttccccttt ctttatcatt ctcccggacg gatacaatct aaatagacaa 240 attgcttagg ccgaatcagt ggatagaaat atcattattt gattgatcta agttcacgca 300 atttattatt tctgaaaatt ttattttggt caatcgctga agaaaatcaa ctgaaagggg 360 aatctttcta tagagcaccc ctcttttttt actcacactt cgtaaaccac aagaattctt 420 attcaaattc tgattccgaa taggaaatat taggattggc cgaccag 467 <210> 2 <211> 246 <212> DNA <213> Angelica acutiloba Kitagawa <400> 2 cgcctttctt ccataacgta aaccaactct tcattcatct taaattcaat cgaattcgag 60 aattatgcgt cgaaaaacaa gttgacttat agcatagcgc ttttttacat ataatatacc 120 tagtaaaacc tccctctccg atccgaatca ccctattttt tatgaatccc ttttttgttt 180 gtaaaccaca agaattctta ttcaaattct gattccgaat aggaaatatt aggattggcc 240 gaccag 246 <210> 3 <211> 246 <212> DNA <213> Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino <400> 3 cgcctttctt ccataacgta aaccaactct tcattcatct taaattcaat cgaattcgag 60 aattatgcgt cgaaaaacaa gttgacttat agcatagcgc ttttttacat ataatatacc 120 tagtaaaacc tccctctccg atccgaatca ccctattttt tatgaatccc ttttttgttt 180 gtaaaccaca agaattctta ttcaaattct gattccgaat aggaaatatt aggattggcc 240 gaccag 246 <210> 4 <211> 221 <212> DNA <213> Angelica gigas Nakai <400> 4 tacttcttcc cctttcttta tcattctccc ggacggatac aatctaaata gacaaattgc 60 ttaggccgaa tcagtggata gaaatatcat tatttgattg atctaagttc acgcaattta 120 ttatttctga aaattttatt ttggtcaatc gctgaagaaa atcaactgaa aggggaatct 180 ttctatagag cacccctctt tttttactca cacttcgtaa a 221 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Angelica indel-atpH-atpI <400> 5 cgcctttctt ccataacgta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Angelica indel-atpH-atpI <400> 6 ctggtcggcc aatcctaata 20

Claims

서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열로 구성된 한약재 당귀 판별용 유전자 마커.
제1항에 있어서, 상기 마커는 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 것인 유전자 마커.
제1항의 삽입 및 결실의 유전적 변이 여부를 검출하기 위한, 한약재 당귀와 한약재 일당귀 판별용 프라이머 세트.
제3항에 있어서, 서열번호 5의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 프라이머를 포함하는 것인 프라이머 세트.
제3항에 있어서, 상기 한약재 일당귀는 일당귀(Angelica acutiloba Kitagawa) 또는 북해도당귀 (Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)인 것인 프라이머 세트.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 한약재 당귀와 한약재 일당귀 판별용 조성물.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 한약재 당귀와 한약재 일당귀 판별용 키트.
품목을 분석하고자 하는 당귀 시료에서 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법.
제8항에 있어서, 서열번호 1 또는 서열번호 4로 구성된 염기서열의 존재가 확인되면 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀인 것으로 판별하는 단계를 포함하는, 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 품목을 분석하고자 하는 당귀 시료에서 추출한 DNA에 대해 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 PCR 산물의 크기를 확인하는 단계를 포함하는 것인, 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법.