KR101668112B1 - Dna 바코드를 이용한 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별법 및 이를 위한 유전자 마커 - Google Patents
Dna 바코드를 이용한 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별법 및 이를 위한 유전자 마커 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101668112B1 KR101668112B1 KR1020150010630A KR20150010630A KR101668112B1 KR 101668112 B1 KR101668112 B1 KR 101668112B1 KR 1020150010630 A KR1020150010630 A KR 1020150010630A KR 20150010630 A KR20150010630 A KR 20150010630A KR 101668112 B1 KR101668112 B1 KR 101668112B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- angelica
- seq
- herbal medicine
- herb
- nucleotide sequence
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims description 20
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 claims abstract description 47
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 53
- 240000001810 Angelica gigas Species 0.000 claims description 51
- 235000018865 Angelica gigas Nutrition 0.000 claims description 45
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 45
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 45
- 241000125175 Angelica Species 0.000 claims description 31
- 235000001287 Guettarda speciosa Nutrition 0.000 claims description 30
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 25
- 241000544270 Angelica acutiloba Species 0.000 claims description 24
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 claims description 16
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 claims description 13
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 claims description 13
- 241001105098 Angelica keiskei Species 0.000 claims description 4
- 244000131316 Panax pseudoginseng Species 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 18
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 240000004371 Panax ginseng Species 0.000 description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 244000189548 Chrysanthemum x morifolium Species 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 244000184734 Pyrus japonica Species 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700031407 Chloroplast Genes Proteins 0.000 description 3
- 235000009604 Chrysanthemum X morifolium Nutrition 0.000 description 3
- 235000002789 Panax ginseng Nutrition 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- UIERETOOQGIECD-ARJAWSKDSA-N angelic acid group Chemical group C(\C(\C)=C/C)(=O)O UIERETOOQGIECD-ARJAWSKDSA-N 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 3
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000289527 Cordyline terminalis Species 0.000 description 2
- 235000009091 Cordyline terminalis Nutrition 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- XMGQYMWWDOXHJM-UHFFFAOYSA-N limonene Chemical compound CC(=C)C1CCC(C)=CC1 XMGQYMWWDOXHJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- IQVQXVFMNOFTMU-FLIBITNWSA-N (Z)-ligustilide Chemical compound C1CC=CC2=C1C(=C/CCC)/OC2=O IQVQXVFMNOFTMU-FLIBITNWSA-N 0.000 description 1
- WMBOCUXXNSOQHM-UHFFFAOYSA-N 3-butylidene-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=CC=C2C(=CCCC)OC(=O)C2=C1 WMBOCUXXNSOQHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000605445 Anemarrhena asphodeloides Species 0.000 description 1
- 241000382455 Angelica sinensis Species 0.000 description 1
- 241000208173 Apiaceae Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004998 Chloroplast DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- CUKSFECWKQBVED-INIZCTEOSA-N Decursin Chemical compound C1=CC(=O)OC2=C1C=C1C[C@H](OC(=O)C=C(C)C)C(C)(C)OC1=C2 CUKSFECWKQBVED-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- BGXFQDFSVDZUIW-UHFFFAOYSA-N Decursinol Natural products O1C(=O)C=CC2=C1C=C1OC(C)(C)C(O)CC1=C2 BGXFQDFSVDZUIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CUKSFECWKQBVED-UHFFFAOYSA-N Grandivittin Natural products C1=CC(=O)OC2=C1C=C1CC(OC(=O)C=C(C)C)C(C)(C)OC1=C2 CUKSFECWKQBVED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 description 1
- HXCGUCZXPFBNRD-DNLMCPORSA-N Nodakenin Chemical compound CC(C)([C@@H]1OC2=CC=3OC(=O)C=CC=3C=C2C1)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HXCGUCZXPFBNRD-DNLMCPORSA-N 0.000 description 1
- HXCGUCZXPFBNRD-QVYYAULWSA-N Nodakenin Natural products O(C(C)(C)[C@@H]1Oc2c(cc3c(OC(=O)C=C3)c2)C1)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HXCGUCZXPFBNRD-QVYYAULWSA-N 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000120541 Rhizophora Species 0.000 description 1
- 241000208422 Rhododendron Species 0.000 description 1
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000951376 Schizonepeta tenuifolia Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- IQVQXVFMNOFTMU-DHZHZOJOSA-N Z-ligustilide Natural products C1CC=CC2=C1C(=C/CCC)\OC2=O IQVQXVFMNOFTMU-DHZHZOJOSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- JXZWWIMXTVJNSF-UHFFFAOYSA-N decursin Natural products CC(=CC(=O)OC1Oc2cc3OC(=O)C=Cc3cc2CC1(C)C)C JXZWWIMXTVJNSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGXFQDFSVDZUIW-LBPRGKRZSA-N decursinol Chemical compound O1C(=O)C=CC2=C1C=C1OC(C)(C)[C@@H](O)CC1=C2 BGXFQDFSVDZUIW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 239000009588 dong quai Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 229940087305 limonene Drugs 0.000 description 1
- 235000001510 limonene Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- HXCGUCZXPFBNRD-UHFFFAOYSA-N nodakenine Natural products C1C2=CC=3C=CC(=O)OC=3C=C2OC1C(C)(C)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HXCGUCZXPFBNRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 229940124595 oriental medicine Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 241000215338 unidentified plant Species 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 유전자 마커, 삽입 및 결실(Indel)의 유전적 변이의 존재 여부를 검출하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 조성물 또는 키트, 및 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 개발한 유전자 마커 및 이를 이용한 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법은 PCR 산물의 사이즈 크기 확인만으로도 손쉽게 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 정확히 구별할 수 있는 특징이 있다.
본 발명에서 개발한 유전자 마커 및 이를 이용한 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법은 PCR 산물의 사이즈 크기 확인만으로도 손쉽게 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 정확히 구별할 수 있는 특징이 있다.
Description
본 발명은 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 품목 판별용 유전자 마커, 상기 유전자 마커의 존재 여부를 검출하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 조성물 또는 키트, 및 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법에 관한 것이다.
국내에서 생산 및 유통되고 있는 한약재는 기원이 부정확하거나 명칭이 유사하여 혼·오용되는 사례가 많다. 뿐만 아니라 한국, 중국, 일본 등의 한약재를 사용하는 나라에서 한약재의 기원종을 각 나라의 약전마다 다르게 규정하고 있어 80% 이상을 수입에 의존하고 있는 우리나라는 이러한 혼·오용의 위험이 높다. 이러한 혼·오용의 위험이 높은 한약재 중 하나인 당귀(當歸)는 그 기원에 대하여 한국, 중국 및 일본의 공정서에는 산형과(Umbelliferae)의 각기 다른 기원식물을 수재하고 있다.
우리나라에서는 당귀(當歸, Angelicae Gigantis Radix)의 기원식물로 대한민국약전 (KP10, 2012)에서 산형과(Umbelliferae)인 참당귀(Angelica gigas Nakai)의 뿌리로 수재되어 있고, 일당귀(日當歸, Japanese Angelicae Radix)는 대한민국약전외한약(생약)규격집 (KHP, 2012)에 산형과의 일당귀(Angelica acutiloba Kitagawa) 또는 북해도당귀(Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)의 뿌리로 수재하고 있다. 일본에서는 당귀의 기원식물로 일본약국방 (JP, 2011)에 일당귀 (Angelica acutiloba Kitagawa)와 북해도당귀(Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)로 수재되어 있고, 이것은 그 기원이 KHP의 일당귀와 동일하다.
또한 각국의 약전에 수재된 당귀의 기원식물 별로 이화학적 성분이 달라 약용으로 사용하기 위해서는 정확한 감별이 필요하다. 참당귀, 일당귀 및 북해도당귀는 같은 속(屬, genus) 식물이지만 뿌리에 함유되어 있는 주요성분이 달라서 한국, 일본, 중국에서 각각 다르게 이용되고 있다. 한약재 당귀의 성분은 데쿠르신(decursin), 데쿠르시놀(decursinol), 노다케닌(nodakenin), 리모넨(limonene) (Kim et al., 2008)이고, 한약재 일당귀에는 (Z)-리구스틸라이드((Z)-ligustilide), 부틸라이덴프탈라이드(butylidenphthalide) (Wang et al., 1999; Matsumoto et al., 1998)등이 함유되어 있어 그 성분이 각각 달라 약효의 차이가 있으므로 혼용과 오용의 방지를 위해 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 명확한 구별법의 확립이 필요하다. 특히 한약재 당귀와 한약재 일당귀는 절단된 상태의 한약재로 제조되었을 경우 식별하기가 쉽지 않다.
따라서 보다 정확한 한약재의 명확한 기원을 판단할 수 있는 방법으로 분자생물학적 방법들이 제시되고 있다. 분자생물학적 방법들은 비교적 짧은 시간과 저렴한 비용으로 정확한 정보를 얻을 수 있으며, 소량의 시료로 분석이 가능하다는 장점이 있다 (Ha et al., 2005). 과거에는 RAPD (random amplified polymorphic DNA), RFLP (restriction fragment length polymorphism), AFLP (amplified fragment length polymorphism) 등의 방법이 이용되어 왔고 당귀에 대해서도 RAPD 마커 개발에 대한 연구(Bang et al., 2002)가 발표되었으나, 분자생물학적 방법에 의한 구별은 미진한 실정이다.
최근의 분자생물학적 방법을 이용한 종 감별 연구는 국제 생물바코드컨소시엄(CBOL; Consortium for Barcode of Life)이 제안하고 있는 엽록체(chloroplast) DNA 부위와 중국의과학연구원(Id1t-ITS2)에서 제안하고 있는 핵(nuclear) DNA의 ITS 부위를 이용한 표준화된 DNA 바코드를 종 감별에 활용하고 있다. 유전체 (genome) 상에 존재하는 엽록체 유전자(chloroplast gene)와 핵 리보솜 DNA 유전자(Nuclear Ribosomal DNA gene, nrDNA)의 nrDNA-ITS2 부위는 다른 유전자의 코딩 부위보다 빠르게 진화할 뿐만 아니라 일반성, 단순성, 높은 재현성 등의 이점으로 인해 널리 사용되고 있다(Kim et al., 2005).
이러한 DNA 바코드는 미지의 식물에 대한 종 동정(identification), 계통분류학적 유연관계 분석과 같은 식물분류학적 연구 뿐만 아니라 한약재의 기원종 감별에도 활용되고 있는데 지모(知母, Anemarrhena asphodeloides Bunge, Kim et al., 2008), 형개(荊芥, Schizonepeta tenuifolia Briquent, Jiden et al., 2009) 등에서 엽록체 유전자인 trnL-trnF 부위를 이용한 연구를 통해 DNA 바코드를 이용한 기원종 감별이 가능하고 유용하다는 것을 확인하였다.
본 발명과 유사하게 ITS (internal transcribed spacer) 부위의 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법을 이용한 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하기 위한 특허(출원번호 10-2005-0056866, 공개번호 10-2007-0001401)가 있으나, 염기서열분석은 고가의 염기서열분석기(sequencer)가 필요하고 분석 결과의 해석을 위한 전문적인 인력이 필요한 문제점이 있다.
이에, DNA 바코드를 이용하여 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 간단하게 판별할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 염기서열 분석보다 빠르게 육안으로 한약재 당귀를 정확하게 판별할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 한약재 당귀에 특이적으로 존재하는 염기서열 부위를 발견하고 이를 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 구별하는 유전자 마커로 개발하였다. 또한, 해당 유전자 마커의 존재여부를 확인할 수 있는 특정 프라이머 세트를 개발하고, 해당 프라이머 세트를 사용하여 육안으로 정확히 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 손쉽게 판별함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 한약재 당귀의 판별용 유전자 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열로 구성된 한약재 당귀 판별용 유전자 마커를 제공한다.
상기 마커는 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 마커의 존재 여부를 검출하기 위한, 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 5의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 프라이머를 포함할 수 있다.
상기 한약재 당귀의 기원식물은 참당귀(Angelica gigas Nakai)이며, 상기 한약재 일당귀의 기원식물은 일당귀(Angelica acutiloba Kitagawa) 또는 북해도당귀 (Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)이다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 조성물을 제공한다
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 분석하고자 하는 당귀 시료에서 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법은, 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀에서 서열번호 1을 얻고, 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀와 북해도당귀에서 서열번호 2와 서열번호 3을 얻은 후 이들을 비교해 서열번호 1 또는 서열번호 4로 구성된 염기서열의 존재가 확인되면 한약재 당귀인 것으로 판별하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법은, 분석하고자 하는 당귀 시료에서 추출한 DNA에 대해 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 PCR 산물의 크기를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법은 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 개발한 유전자 마커 및 이를 이용한 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법은, PCR 산물의 사이즈 크기 확인만으로도 간단하게 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 정확히 구별할 수 있다. 이에 따라 정확한 기원의 당귀 원료를 공급하고 당귀의 품질관리 방법으로 활용될 수 있다.
도 1은 서열번호 5 및 6의 염기서열로 구성된 Angelica indel-atpH-atpI-F/R 프라이머 세트를 이용하여 PCR 수행한 결과를 나타낸 것이다. PCR 산물의 크기 차이로 한약재 당귀(참당귀)와 한약재 일당귀(일당귀, 북해도당귀)가 명확히 구별되었다.
도 2는 한약재 당귀(참당귀), 한약재 일당귀(일당귀 및 북해도당귀)의 atpH-atpI 염기서열 비교 결과를 나타낸 것이다. 붉은 색으로 표시한 221 bp 의 삽입 및 결실(indel)이 확인되어 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀와 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀 및 북해도당귀가 명확히 구별되어 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 구별이 가능함을 나타낸다(A. gigas, 참당귀; A. acutiloba, 일당귀; A. acutiloba var sugiyamae, 북해도당귀).
도 2는 한약재 당귀(참당귀), 한약재 일당귀(일당귀 및 북해도당귀)의 atpH-atpI 염기서열 비교 결과를 나타낸 것이다. 붉은 색으로 표시한 221 bp 의 삽입 및 결실(indel)이 확인되어 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀와 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀 및 북해도당귀가 명확히 구별되어 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 구별이 가능함을 나타낸다(A. gigas, 참당귀; A. acutiloba, 일당귀; A. acutiloba var sugiyamae, 북해도당귀).
본 발명은 한약재 당귀(Angelicae Gigantis Radix)와 한약재 일당귀(Japanese Angelicae Radix)의 판별을 위한 DNA 바코드 염기서열과 유전자 마커(marker)에 관한 것이다.
과거 발표된 RAPD (Random amplified polymorphic DNA), RFLP (Restriction fragment length polymorphism) 및 AFLP (Amplified fragment length polymorphism)와 달리 새롭게 각광 받고 있는 식물의 엽록체 유전자 부위의 염기서열을 이용한 식물 DNA 바코드 방법을 이용해 정확성과 높은 재현성을 바탕으로 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀(Angelica gigas Nakai)와 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀(Angelica acutiloba Kitagawa) 및 북해도당귀(Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)에 대한 염기서열 분석 및 분자 마커 개발을 통해 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 구별하고자 한다.
구체적으로, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열로 구성된 한약재 당귀 판별용 유전자 마커에 관한 것이다.
본 발명에서는 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀에 존재하는 엽록체 상의 유전자인 atpH-atpI 염기서열을 분석하여 한약재 당귀(참당귀)에 특이적으로 존재하는 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열이 존재함을 처음으로 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 참당귀(Angelica gigas Nakai)의 atpH-atpI 염기서열은 서열번호 1의 염기서열로 구성되며, 일당귀(Angelica acutiloba Kitagawa)의 염기서열은 서열번호 2의 염기서열로 구성되고, 북해도당귀(Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)의 atpH-atpI 염기서열은 서열번호 3의 염기서열로 구성됨을 최초로 확인하였다. 또한, 본 발명에서는 참당귀의 염기서열과 비교했을 때, 일당귀와 북해도당귀에서 221 bp의 삽입 및 결실(indel)을 최초로 확인함으로써, 이를 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 구별할 수 있는 유전자 마커로 개발하였다.
이에 따라, 본 발명에서 처음 밝힌, 참당귀, 일당귀, 북해도당귀의 atpH-atpI 유전자 부위는 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별을 위한 DNA 바코드로 사용할 수 있다.
또한, 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열로 구성된 한약재 당귀 판별용 유전자 마커의 존재 여부를 검출하기 위한, 한약재 당귀와 한약재 일당귀 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 특정 유전자 서열을 증폭하기 위해 합성된 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀에 특이적으로 존재하는 염기서열로 구성된 유전자 마커를 확인한 후, 해당 유전자 마커가 포함되는 부위를 PCR 증폭하여 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 구별할 수 있는 프라이머 세트를 개발하였다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 또는 서열번호 4로 구성된 DNA의 염기서열을 증폭하여, PCR 산물의 사이즈 크기 또는 염기서열 분석을 통해 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 구별할 수 있는 프라이머 세트를 모두 포함한다. 바람직하게는, 서열번호 5의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 프라이머를 포함한다.
본 발명에서 한약재 당귀의 기원식물은 참당귀(Angelica gigas Nakai)이다. 또한, 한약재 일당귀의 기원식물은 일당귀(Angelica acutiloba Kitagawa) 또는 북해도당귀 (Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열로 구성된 한약재 당귀 판별용 유전자 마커의 존재 여부를 검출하기 위한 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별용 프라이머 세트를 포함하는, 한약재 당귀와 한약재 일당귀 판별용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.
상기 "한약재 당귀와 한약재 일당귀 판별용 조성물"은 한약재 당귀와 한약재 일당귀 판별용 프라이머 세트와 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는데 필요한 PCR 반응용 완충용액, DNA 중합효소, dNTP 또는 상기 조성물과 분자마커의 결합(hybridization) 반응을 수행하는데 필요한 버퍼 등을 포함할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
상기 “키트”는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 한약재 당귀와 한약재 일당귀 판별용 프라이머 세트를 포함하는 용기, PCR 반응용 완충용액 및 DNA 중합효소를 함유하는 용기를 포함한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.
상기 조성물 또는 키트에 포함되는 프라이머 세트는 서열번호 5 및 서열번호 6에 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머를 하나 이상 포함할 수 있다.
상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 포함하며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 분석하고자 하는 당귀 시료에서 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "당귀 시료"는 품목을 확인하고자 하는 당귀의 조직을 말하며, 당귀의 뿌리, 잎, 줄기 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법에서 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열의 존재가 확인되면 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀 품목인 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 분석하고자 하는 당귀 시료에서 추출한 DNA에 대해 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 PCR 산물의 크기를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 당귀 시료에서 추출한 DNA에 대해 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계는, 당귀 시료에서 분리된 지노믹 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 증폭반응을 수행하여, 표적 서열을 증폭하는 단계이다.
상기 증폭된 PCR 산물의 크기를 확인하는 단계는 전기 영동 등의 방법으로 확인할 수 있다. 전기영동의 구체적인 예로는 자동 전기영동장치(칩 및 모세관 방식포함), 아크릴아마이드 겔, 또는 아가로스 겔 전기영동일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트를 사용하여 당귀 시료에서 추출한 DNA를 중합효소 연쇄반응으로 증폭한 결과, 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀(A. gigas Nakai)에서 467 bp의 PCR 산물이 확인되었고, 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀(A. acutiloba Kitagawa)와 북해도당귀(Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)에서 246 bp의 PCR 산물이 확인되어 2개의 품목간 PCR 산물의 크기가 명확히 구별되었다(실시예 6).
전기영동에 의한 판독은 판독자에 따라 감별 결과가 달라질 수 있으나, 그 오차를 줄이는 방법으로는 PCR 산물의 사이즈 차이가 큰 마커(marker)를 이용하는 것이 한 방법이다. 본 발명은 도 1과 같이 비전문가가 판별하였을 때도 충분히 참당귀와 일당귀의 구별이 가능한 크기 차이(221 bp)를 보이는 PCR 산물을 얻을 수 있다. 따라서, 간단한 방법으로 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 정확하게 구별할 수 있다.
또한, 본 발명의 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법에서, 증폭된 PCR 산물의 크기를 확인하는 것에 추가로 상기 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계를 추가로 포함할 수있다.
증폭된 PCR 산물의 염기서열의 분석은 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 분석할 수 있다. 염기서열 분석 결과, 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열이 존재하게 되면 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀로 판별할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀, 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀 및 북해도당귀의 atpH-atpI 염기서열을 비교한 결과에서 221 bp의 삽입 및 결실(Indel)이 확인되어 명확히 구별됨에 따라, PCR 산물의 크기 차이 뿐만 아니라 추가적으로 염기서열 분석을 추가로 수행하면 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 보다 정확히 판별할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 실험재료로 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀의 경우 식품의약품안전처에서 분양하고 있는 기원이 명확한 표준생약과 전국 각지에서 수집된 다양한 개체를 사용하였고, 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀와 북해도당귀의 경우 국내 재배품목 뿐만 아니라 일본에서 재배되고 있는 품목까지 기원확인 후 분석하여 본 발명의 신뢰성을 높였다. 또한 본 발명에서는 발명에 이용된 실험재료 각각에서 얻어진 PCR 산물에 대한 염기서열을 분석함으로써 본 발명에 사용된 atpH-atpI 부위의 종내 염기서열변이 여부를 확인하여 PCR 산물의 크기에 영향을 줄 수 있는 요소가 없음을 검증함으로써 본 발명의 신뢰성이 높음을 입증하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 사용한 식물 재료
본 발명에서 이용한 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀는 식품의약품안전처에서 분양하고 있는 기원이 명확한 표준생약과 우리나라 각지에서 수집된 것을 기원확인 후 이용하였고, 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀와 북해도당귀는 국내 뿐만 아니라 일본에서 재배되고 유통되는 품목까지 기원확인 후 사용하였다. 하기 표 1은 본 발명에서 사용한 식물 재료를 나타낸 것이다.
| 기원식물 | 번호 | 검체 번호 | 구분 | 형태 | 수집지역 |
| 참당귀 Angelica gigas |
1 | ANG_GIG_130001 | 표준 생약 |
가루 | 식품의약품안전처 분양 |
| 2 | ANG_GIG_130009-2 | 재배 | 전초 | 강원도 평창군 | |
| 3 | ANG_GIG_130009-4 | 재배 | 전초 | ||
| 4 | ANG_GIG_130009-9 | 재배 | 전초 | ||
| 5 | ANG_GIG_130009-11 | 재배 | 전초 | ||
| 6 | ANG_GIG_130009-13 | 재배 | 전초 | ||
| 7 | ANG_GIG_130010-1 | 재배 | 전초 | 충청북도 제천시 | |
| 8 | ANG_GIG_130010-2 | 재배 | 전초 | ||
| 9 | ANG_GIG_130010-3 | 재배 | 전초 | ||
| 10 | ANG_GIG_130011-1 | 재배 | 전초 | 충청북도 제천시 | |
| 11 | ANG_GIG_130011-2 | 재배 | 전초 | ||
| 12 | ANG_GIG_130011-3 | 재배 | 전초 | ||
| 13 | ANG_GIG_130011-4 | 재배 | 전초 | ||
| 14 | ANG_GIG_130011-5 | 재배 | 전초 | ||
| 15 | ANG_GIG_130011-6 | 재배 | 전초 | ||
| 16 | ANG_GIG_130011-7 | 재배 | 전초 | ||
| 17 | ANG_GIG_130011-8 | 재배 | 전초 | ||
| 18 | ANG_GIG_130012-1 | 재배 | 전초 | 경상북도 봉화군 | |
| 19 | ANG_GIG_130012-3 | 재배 | 전초 | ||
| 20 | ANG_GIG_130013-1 | 재배 | 전초 | 경상북도 봉화군 | |
| 21 | ANG_GIG_130013-2 | 재배 | 전초 | ||
| 22 | ANG_GIG_130013-3 | 재배 | 전초 | ||
| 23 | ANG_GIG_130013-4 | 재배 | 전초 | ||
| 24 | ANG_GIG_130014-1 | 재배 | 전초 | 경상북도 봉화군 | |
| 25 | ANG_GIG_130014-2 | 재배 | 전초 | ||
| 26 | ANG_GIG_130014-3 | 재배 | 전초 | ||
| 27 | ANG_GIG_130015-1 | 재배 | 전초 | 경상북도 봉화군 | |
| 28 | ANG_GIG_130015-2 | 재배 | 전초 | ||
| 29 | ANG_GIG_130016-2 | 재배 | 전초 | 경상북도 안동시 | |
| 30 | ANG_GIG_130016-3 | 재배 | 전초 | ||
| 31 | ANG_GIG_130016-4 | 재배 | 전초 | ||
| 32 | ANG_GIG_130016-5 | 재배 | 전초 | ||
| 33 | ANG_GIG_130016-6 | 재배 | 전초 | ||
| 34 | ANG_GIG_130002 | 유통품 | 절편 | 중국 | |
| 35 | ANG_GIG_130003 | 유통품 | 절편 | 경상북도 | |
| 36 | ANG_GIG_130004 | 유통품 | 절편 | 충청북도 | |
| 37 | ANG_GIG_130005 | 유통품 | 절편 | 경상북도 | |
| 38 | ANG_GIG_130006 | 유통품 | 절편 | 충청북도 | |
| 39 | ANG_GIG_130007 | 유통품 | 절편 | 한국 | |
| 일당귀 Angelica acutiloba |
40 | ANG_ACU_130001-1 | 재배 | 전초 | 전라남도 장흥군 |
| 41 | ANG_ACU_130003 | 유통품 | 절편 | 강원도 | |
| 42 | ANG_ACU_130004 | 유통품 | 절편 | 경상북도 | |
| 43 | ANG_ACU_130006 | 유통품 | 절편 | 강원도 정선군 | |
| 44 | ANG_ACU_130007 | 유통품 | 절편 | 강원도 평창군 | |
| 45 | ANG_ACU_130009-3 | 재배 | 전초 | 강원도 평창군 | |
| 46 | ANG_ACU_130010-1 | 재배 | 전초 | 강원도 평창군 | |
| 47 | ANG_ACU_130010-2 | 재배 | 전초 | ||
| 48 | ANG_ACU_130011-1 | 재배 | 전초 | 충청북도 제천시 | |
| 49 | ANG_ACU_130012-1 | 재배 | 전초 | 경상북도 안동시 | |
| 50 | ANG_ACU_130013-1 | 재배 | 전초 | 강원도 평창군 | |
| 51 | ANG_ACU_130013-2 | 재배 | 전초 | ||
| 52 | ANG_ACU_130014-522 | 재배 | 전초 | 일본 훗카이도 나요로 |
|
| 53 | ANG_ACU_130014-523 | 재배 | 전초 | ||
| 54 | ANG_ACU_130014-524 | 재배 | 전초 | ||
| 55 | ANG_ACU_130014-525 | 재배 | 전초 | ||
| 56 | ANG_ACU_130015-618 | 재배 | 전초 | 일본 훗카이도 아바시리시 |
|
| 57 | ANG_ACU_130015-619 | 재배 | 전초 | ||
| 58 | ANG_ACU_130015-620 | 재배 | 전초 | ||
| 북해도당귀 Angelica acutiloba Kitagawa var. Sugiyamae |
59 | ANG_ACU_V.SUG 130001-4 |
재배 | 전초 | 충청북도 제천시 |
| 60 | ANG_ACU_V.SUG 130001-5 |
재배 | 전초 | ||
| 61 | ANG_ACU_V.SUG 130007-526 |
재배 | 전초 | 일본 훗카이도 나요로 |
|
| 62 | ANG_ACU_V.SUG 130007-527 |
재배 | 전초 | ||
| 63 | ANG_ACU_V.SUG 130007-528 |
재배 | 전초 |
실시예 2: DNA 추출(DNA extraction)-QIAGEN DNeasy plant mini kit (Cat No. 69109) 사용
기원이 확인된 당귀 약재 샘플 20-100 mg을 액체 질소로 얼려 막자와 막자사발로 곱게 갈아 분말 상태로 만들었다. 분말 시료를 2 mL 튜브에 옮겨 담아 400 ㎕의 AP1 용액과 4 ㎕ RNase A를 첨가한 후, 완전히 섞어주고(vortex) 65 ℃ 항온기에서 30 분간 처리하였다. 이 반응물에 P3용액을 130 ㎕ 첨가하여 완전히 섞이도록 흔들어 준 다음, 5-10 분간 아이스(ice)에 넣어 두고, 14,000 rpm으로 5 분간 원심분리하였다. 반응물의 상층액을 취하여 QIAshredder 스핀 컬럼(spin column)에 넣고 14,000 rpm으로 2 분간 원심분리 하였다.
걸러진 반응물을 취하여 새 1.5 mL 튜브에 옮겨 담고, 1.5 배의 AW1 용액을 넣어 뭉쳐짐(pellet)이 생기지 않도록 잘 섞어주었다. 이 반응물을 DNeasy 미니 스핀 컬럼(Mini spin column)에 넣고 8,000 rpm으로 1 분간 원심분리 하였다. 걸러진 용액은 버리고 500 ㎕의 AW2 용액을 컬럼에 넣고 14,000 rpm으로 2 분간 원심분리 하였다.
걸러진 용액은 버리고 500 ㎕의 AW2 용액을 컬럼에 한 번 더 넣고 8,000 rpm으로 1 분간 원심분리 하였다. 이후 걸러진 용액을 버리고 컬럼을 새 1.5 mL 튜브에 옮겨 끼우고 AE 용액 100 ㎕을 넣어 5 분간 상온(15-25 ℃)에 방치한 후 8,000 rpm으로 1 분간 원심분리 하여 DNA를 추출해냈다. 추출된 DNA를 1.5 % 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동(Electrophoresis)하여 확인한 후 DNA 순도 및 농도를 측정하였다. PCR에서 DNA의 농도가 높거나 순도가 낮으면 증폭이 되지 않을 수 있으므로 PCR을 위한 주형 DNA는 농도와 순도를 PCR 조건에 적합하도록 분리 정제하였다 (유전자 순도: A 260 nm/A 280 nm = 1.6 ~ 2.0).
실시예 3: 참당귀 판별용 프라이머 제작 및 DNA 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 증폭
한약재 당귀의 기원식물인 참당귀와 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀, 북해도당귀에 존재하는 엽록체 유전자인 atpH-atpI의 염기서열을 분석하고 이를 비교하여 한약재인 당귀와 한약재 일당귀 사이에 221 bp의 삽입 및 결실(indel, insertion and deletion)을 확인하였다. 이에, 한약재 참당귀와 한약재 일당귀를 구별하기 위하여 상기 발견한 삽입과 결실(indel) 부분을 증폭할 수 있게 프라이머를 고안해냈다. 이 프라이머는 PCR 산물을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 얻어진 PCR 산물의 염기서열분석에도 사용할 수 있었다. 이 프라이머의 상세 염기서열은 아래와 같았다.
정방향 프라이머: CGCCTTTCTTCCATAACGTA (서열번호 5)
역방향 프라이머: CTGGTCGGCCAATCCTAATA (서열번호 6)
유전자 증폭반응을 위하여 상용화된 PCR 키트에 상기 서열번호 5의 정방향 프라이머(Forward primer(10 pmole)) 1 ㎕, 역방향 프라이머(Reverse primer(10 pmole)) 1 ㎕와 정량한 주형 DNA 1 ㎕ (농도 약 20 ng/㎕)를 혼합하고, 정제수를 첨가하여 최종반응 용량을 총 20 ㎕로 하였다. 반응조건은 94 ℃에서 3 분간 예비변성(pre-denaturation) 한 후 94 ℃에서 30 초 변성(denaturation), 55 ℃에서 30 초간 결합(annealing), 72 ℃에서 30 초간 증폭(extension)하고 변성부터 증폭까지의 과정을 34 회 반복한 다음, 72 ℃에서 5 분간 최종증폭(final extension)을 시켜 DNA 증폭산물을 얻었다. 구체적인 온도, 시간, 및 반복수는 하기 표 2와 같았다.
| 단계 | 온도(℃) | 시간 | 반복 수 (Cycles) |
| 예비변성(Predenaturation) | 94 ℃ | 3 분 | 1 |
| 변성(Denaturation) | 94 ℃ | 30 초 | 34 |
| 결합(Annealing) | 55 ℃ | 30 초 | |
| 증폭(Extension) | 72 ℃ | 1 분 | |
| 최종증폭(Final extension) | 72 ℃ | 5 분 | 1 |
| 보존 | 8 ℃ | - | - |
실시예 3: 전기영동
아가로즈 겔의 첫 번째 홈에 PCR 증폭산물의 크기를 식별할 수 있는 사이즈 마커(100 bp)를 넣고, 두 번째 홈부터 PCR 증폭산물을 넣었다. 전기영동의 전압과 시간은 겔의 농도와 크기에 따라 조절하였다(아가로즈 겔 1.5-2 %, 전기영동 70~100 V, 30분). 전기영동이 끝난 겔은 브롬화 에티듐(Ethidium bromide(EtBr), 브로마이드) 염색법으로 처리하여 증폭산물을 확인하였다.
실시예 4: PCR 증폭산물의 정제
20 ㎕ PCR 증폭산물을 1.5 mL tube에 옮기고, 정제수를 넣어 총 100 ㎕로 하였다. 3 M 아세트산 나트륨(sodium acetate) 10 ㎕, 100 % 에탄올(냉장보관) 275 ㎕를 차례로 넣은 후, 수차례 교반한 뒤 4 ℃에서 30 분간 방치하였다. 이 반응물을 13,000 rpm으로 4 ℃에서 10 분간 원심분리한 뒤 상층액을 버리고, 침전된 DNA를 70 % 에탄올(냉장보관) 500 ㎕로 2 ~ 3회 세척하고 상온에서 자연건조 시켰다.
실시예 5: 염기서열 분석(Sequencing)
PCR 증폭산물을 EtOH 침전법으로 정제한 후 Tris-EDTA(TE) 완충용액에 녹였다. TE 완충용액에 녹인 DNA를 주형으로 하여 염기서열 분석용 PCR을 수행하였다. 염기서열 분석을 위한 PCR 반응액의 조성은 하기 표 3과 같았다.
| 농도 | 분량 | |
| PCR 증폭산물 | 20 ng/㎕ | 1 ㎕ |
| 염기서열 분석용 프리믹스 | - | 4 ㎕ |
| 정방향 프라이머 (또는 역방향 프라이머) |
10 pmole | 1 ㎕ |
| 정제수(D.D.W.) | 14 ㎕ | |
| 전체량 | 20 ㎕ |
반응조건은 94 ℃에서 3 분간 예비변성(pre-denaturation) 한 후 94 ℃에서 30 초 변성(denaturation), 52 ℃에서 30 초간 결합(annealing), 72 ℃에서 30 초간 증폭(extension)하고 변성부터 증폭까지의 과정을 34 회 반복한 다음, 72 ℃에서 5 분간 최종증폭(final extension)을 시켜 DNA 증폭산물을 얻었다.
PCR 증폭산물을 EtOH 침전법으로 정제한 후 포름아미드(formamide) 10㎕에 DNA를 녹였다. 그 후 자동 염기서열 분석기를 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다.
Bioedit 7.0.9.0 및 MEGA 5.1 프로그램을 이용하여, PCR에 사용한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 분석한 염기서열과 크로마토그램을 직접 비교하여, 하나의 염기서열로 만드는 염기서열 정렬(Sequence alignment)을 하였다.
실시예 6: PCR 수행으로 참당귀와 일당귀의 구별
상기 설명한 실험방법에 명시한 조건으로 PCR한 결과, 도 1과 같이 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀(A. gigas Nakai)에서 467 bp의 PCR 산물이 확인되었고, 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀(A. acutiloba Kitagawa)와 북해도당귀(Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)에서 246 bp 의 PCR 산물이 확인되어, 참당귀, 일당귀 및 북해도 당귀가 명확히 구별되었다. 이는 간단한 PCR 수행을 통해 비전문가라도 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 육안으로 명확히 구별할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 7: 염기서열 분석 결과
상기 실시예 5를 통해 참당귀, 일당귀 및 북해도당귀의 atpH-atpI 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 참당귀의 atpH-atpI 염기서열은 서열번호 1(467 bp)로 표시된 서열과 같았으며, 일당귀 및 북해도당귀의 atpH-atpI 염기서열은 각각 서열번호 2(246 bp)와 3(246 bp)으로 표시된 서열과 같았다. 참당귀, 일당귀 및 북해도당귀 모두 PCR에 사용된 Angelica indel-atpH-atpI-F/R을 이용해 분석된 결과이고, 두 결과를 비교하였을 때 221 bp의 삽입 및 결실(indel) 부위(서열번호 4)를 발견하였다.
도 2는 참당귀, 일당귀 및 북해도당귀의 atpH-atpI 염기서열 비교한 결과를 나타낸 것으로서, 도면 상에서 붉은 색으로 표시한 221 bp의 삽입 및 결실(Indel)이 확인되어 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀와 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀 및 북해도당귀가 명확히 구별되어 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 구별이 가능함을 시사하는 것이다.
실시예 8: 종내 염기서열 변이 확인
본 발명에 이용된 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀 39 개체, 한약재 일당귀의 기원식물인 일당귀 19 개체 및 북해도당귀 5개체(표 1 참고)에서 atpH-atpI 구간의 염기서열분석 결과 종내 염기서열변이가 확인되지 않았다. 이 확인 시험 결과에서 볼 때 PCR 산물의 크기에 영향을 줄 요소가 없음이 확인되었고, 본 발명에서 개발한 프라이머를 통해 얻어진 PCR 산물의 크기 차이와 염기서열분석 모두에서 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 명확히 구별할 수 있음을 제시하는 바이다
.
<110> KOREA FOOD & DRUG ADMINISTRATION
<120> Gene marker for discriminating cultivars of Angelica gigas Nakai
and Japanese Angelicae Radix
<130> APC-14-0101
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 467
<212> DNA
<213> Angelica gigas Nakai
<400> 1
cgcctttctt ccataacgta aaccaactct tcattcatct taaattcaat cgaattcgag 60
aattatgcgt cgaaaaacaa gttgactttt agcatagcgc ttttttacat ataatatacc 120
tagtaaaacc tccctctccg atccgaatca ccctattttt tatgaatccc ttttttgttt 180
gtaaatactt cttccccttt ctttatcatt ctcccggacg gatacaatct aaatagacaa 240
attgcttagg ccgaatcagt ggatagaaat atcattattt gattgatcta agttcacgca 300
atttattatt tctgaaaatt ttattttggt caatcgctga agaaaatcaa ctgaaagggg 360
aatctttcta tagagcaccc ctcttttttt actcacactt cgtaaaccac aagaattctt 420
attcaaattc tgattccgaa taggaaatat taggattggc cgaccag 467
<210> 2
<211> 246
<212> DNA
<213> Angelica acutiloba Kitagawa
<400> 2
cgcctttctt ccataacgta aaccaactct tcattcatct taaattcaat cgaattcgag 60
aattatgcgt cgaaaaacaa gttgacttat agcatagcgc ttttttacat ataatatacc 120
tagtaaaacc tccctctccg atccgaatca ccctattttt tatgaatccc ttttttgttt 180
gtaaaccaca agaattctta ttcaaattct gattccgaat aggaaatatt aggattggcc 240
gaccag 246
<210> 3
<211> 246
<212> DNA
<213> Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino
<400> 3
cgcctttctt ccataacgta aaccaactct tcattcatct taaattcaat cgaattcgag 60
aattatgcgt cgaaaaacaa gttgacttat agcatagcgc ttttttacat ataatatacc 120
tagtaaaacc tccctctccg atccgaatca ccctattttt tatgaatccc ttttttgttt 180
gtaaaccaca agaattctta ttcaaattct gattccgaat aggaaatatt aggattggcc 240
gaccag 246
<210> 4
<211> 221
<212> DNA
<213> Angelica gigas Nakai
<400> 4
tacttcttcc cctttcttta tcattctccc ggacggatac aatctaaata gacaaattgc 60
ttaggccgaa tcagtggata gaaatatcat tatttgattg atctaagttc acgcaattta 120
ttatttctga aaattttatt ttggtcaatc gctgaagaaa atcaactgaa aggggaatct 180
ttctatagag cacccctctt tttttactca cacttcgtaa a 221
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for Angelica indel-atpH-atpI
<400> 5
cgcctttctt ccataacgta 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for Angelica indel-atpH-atpI
<400> 6
ctggtcggcc aatcctaata 20
Claims (11)
- 서열번호 4의 염기서열로 구성된 한약재 당귀 판별용 유전자 마커.
- 제1항에 있어서, 상기 마커는 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 것인 유전자 마커.
- 제1항의 유전자 마커의 삽입 및 결실의 유전적 변이 여부를 검출하기 위한, 한약재 당귀와 한약재 일당귀 판별용 프라이머 세트.
- 제3항에 있어서, 서열번호 5의 염기서열로 구성된 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 구성된 프라이머를 포함하는 것인 프라이머 세트.
- 제3항에 있어서, 상기 한약재 일당귀는 일당귀(Angelica acutiloba Kitagawa) 또는 북해도당귀 (Angelica acutiloba Kitagawa var. sugiyamae Hikino)인 것인 프라이머 세트.
- 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 한약재 당귀와 한약재 일당귀 판별용 조성물.
- 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 한약재 당귀와 한약재 일당귀 판별용 키트.
- 품목을 분석하고자 하는 당귀 시료에서 서열번호 4의 염기서열의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법.
- 제8항에 있어서, 서열번호 4의 염기서열의 존재가 확인되면 한약재 당귀의 기원식물인 참당귀인 것으로 판별하는 단계를 포함하는, 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 품목을 분석하고자 하는 당귀 시료에서 추출한 DNA에 대해 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 PCR 산물의 크기를 확인하는 단계를 포함하는 것인, 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 한약재 당귀와 한약재 일당귀를 판별하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150010630A KR101668112B1 (ko) | 2015-01-22 | 2015-01-22 | Dna 바코드를 이용한 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별법 및 이를 위한 유전자 마커 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150010630A KR101668112B1 (ko) | 2015-01-22 | 2015-01-22 | Dna 바코드를 이용한 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별법 및 이를 위한 유전자 마커 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20160090611A KR20160090611A (ko) | 2016-08-01 |
| KR101668112B1 true KR101668112B1 (ko) | 2016-10-21 |
Family
ID=56706848
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020150010630A KR101668112B1 (ko) | 2015-01-22 | 2015-01-22 | Dna 바코드를 이용한 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별법 및 이를 위한 유전자 마커 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101668112B1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11941604B2 (en) | 2018-12-17 | 2024-03-26 | Hanwha Vision Co., Ltd. | Automatic payment system |
| US12223503B2 (en) | 2018-12-17 | 2025-02-11 | Hanwha Vision Co., Ltd. | Camera control device and method to process captured image using at least one camera |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102163239B1 (ko) * | 2019-09-10 | 2020-10-08 | 충북대학교 산학협력단 | 당귀 속 식물로부터 참당귀를 판별하기 위한 엽록체 서열 기반 분자마커 및 이의 용도 |
| KR102163234B1 (ko) * | 2019-09-10 | 2020-10-08 | 충북대학교 산학협력단 | 당귀 속 식물로부터 구릿대를 판별하기 위한 엽록체 서열 기반 분자마커 및 이의 용도 |
| KR102163235B1 (ko) * | 2019-09-10 | 2020-10-08 | 충북대학교 산학협력단 | 당귀 속 식물로부터 바디나물을 판별하기 위한 엽록체 서열 기반 분자마커 및 이의 용도 |
| KR102163238B1 (ko) * | 2019-09-10 | 2020-10-08 | 충북대학교 산학협력단 | 당귀 속 식물로부터 일당귀를 판별하기 위한 엽록체 서열 기반 분자마커 및 이의 용도 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100720864B1 (ko) | 2005-06-29 | 2007-05-22 | 대구한의대학교산학협력단 | 당귀의 종간 유전자 감별 키트 |
-
2015
- 2015-01-22 KR KR1020150010630A patent/KR101668112B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100720864B1 (ko) | 2005-06-29 | 2007-05-22 | 대구한의대학교산학협력단 | 당귀의 종간 유전자 감별 키트 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Chenyang Liao et al., Systemic Botany, 38(1):266-281.2013 (2013) |
| 김영화 외., "미각센서와 DNA 염기서열을 이용한 당귀류 비교",Kor. J. Herbology 2012:27(6):37-42 |
| 서열번호 1, 4 NCBI Blast |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11941604B2 (en) | 2018-12-17 | 2024-03-26 | Hanwha Vision Co., Ltd. | Automatic payment system |
| US12223503B2 (en) | 2018-12-17 | 2025-02-11 | Hanwha Vision Co., Ltd. | Camera control device and method to process captured image using at least one camera |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20160090611A (ko) | 2016-08-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101668112B1 (ko) | Dna 바코드를 이용한 한약재 당귀와 한약재 일당귀의 판별법 및 이를 위한 유전자 마커 | |
| JP7131086B2 (ja) | 生薬鑑別用プライマーセット及びそれを用いた生薬鑑別方法 | |
| CN103484558B (zh) | 滇重楼的分子鉴定方法 | |
| KR101811539B1 (ko) | InDel 마커를 이용한 당귀 품종의 감별방법 | |
| KR101860232B1 (ko) | Ssr 마커를 이용한 대추 품종의 감별방법 | |
| KR20140039866A (ko) | 참외 계통 또는 품종의 구별을 위한 ｓｓｒ 프라이머 세트 및 이들의 용도 | |
| KR101821040B1 (ko) | 백수오와 이엽우피소 판별용 바이오마커 | |
| CN106929600B (zh) | 一种快速鉴别重楼品种的试剂盒 | |
| KR101668515B1 (ko) | 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하기 위한 다형성 분자 마커 및 이를 이용한 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 구별 방법 | |
| KR102283638B1 (ko) | 담배 품종 판별용 rapd 프라이머 | |
| Araki et al. | Identification of hop cultivars by DNA marker analysis | |
| KR101948389B1 (ko) | Ssr 마커를 이용한 더덕 및 잔대의 감별방법 | |
| KR101936721B1 (ko) | 당귀의 종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 당귀의 종을 판별하는 방법 | |
| CN114807413B (zh) | 一种橄榄issr-pcr分子标记组合及其应用 | |
| KR102255610B1 (ko) | 왕지네의 기원종 감별용 유전자 마커 | |
| KR101795262B1 (ko) | Ssr 마커를 이용한 참당귀, 일당귀 및 중국당귀의 판별방법 | |
| KR101699518B1 (ko) | 인삼 품종 금풍과 황숙 재래종을 판별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| 문병철 et al. | Development of SCAR Markers for the Authentication of Acori Rhizoma Based on the Analysis of RAPD and Multiplex-PCR | |
| KR101919605B1 (ko) | 인삼 속 5종의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| CN109929943B (zh) | 甘草issr荧光分子标记引物及其应用 | |
| CN113817864A (zh) | 一种基于丹参叶绿体基因组多态性基因片段制备的条形码及其应用 | |
| CN107815503B (zh) | 一种黄连的分子鉴定方法 | |
| KR102743970B1 (ko) | 초롱꽃과 식물 7종의 종 판별용 유전자 마커 | |
| KR102743971B1 (ko) | 반하 속 식물의 종 판별용 유전자 마커 | |
| CN110923304A (zh) | 一种用于鉴别银杏性别的分子标记、引物对和方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20150122 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20160225 Patent event code: PE09021S01D |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20160829 |
|
| PR0702 | Registration of establishment of national patent |
Patent event code: PR07021E01D Comment text: Registration of Establishment of National Patent Patent event date: 20161014 |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20161014 End annual number: 20 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration |