CN114457188B - 额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母的鉴别方法 - Google Patents

额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母的鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种鉴别额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母的方法，包括以待测样品DNA为模板，使用序列为SEQ ID No.2的正向引物和序列为SEQ ID No.3的反向引物，进行扩增；对扩增产物进行测序并获得完整扩增片段；将所述完整扩增片段与SEQ ID No.1相比对，如果所述完整扩增片段在相应于SEQ ID No.1的5′端起第145位为G、第171位为T、第172位为G，则鉴定所述待测样品为来自额敏贝母的样品；如果所述完整扩增片段，在相应于SEQ ID No.1的5′端起第145位为T、第171位为C、第172位为A，则鉴定所述待测样品为来自药材川贝母或伊贝母的样品。

Description

额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母的鉴别方法
技术领域
本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及用SNP分子标记鉴定额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母的方法，可以有效将额敏贝母与药材川贝母或药材伊贝母区分开。
背景技术
贝母为我国一类传统药材，具清热化痰、止咳散结的功效，其来源为百合科Liliaceae贝母属Fritillaria多种植物干燥鳞茎。贝母在临床配伍和中成药生产中使用广泛，如川贝枇杷露、安嗽化痰丸、蛇胆川贝液等。2020版《中国药典》收载贝母类药材共5种：川贝母、伊贝母、浙贝母、湖北贝母、平贝母，5类贝母药材基原植物多达11种(含变种)。正是由于贝母类药材非单基原植物，加之药用部位为鳞茎，而贝母属同属物种鳞茎形态差异较小，所以贝母类药材临床使用混伪现象较为常见。
额敏贝母F.meleagroides分布于新疆北部地区，在当地额敏贝母鳞茎个头小者，与药材川贝母相似，在市场上使用和销售时较难区分；个头大者与药材伊贝母相似，在市场上使用和销售时较难区分。但额敏贝母并非药典收载川贝母或伊贝母的基原植物(药材川贝母基原植物：川贝母F.cirrhosa、甘肃贝母F.przewalskii、瓦布贝母F.wabuensis、梭砂贝母F.delavayi、太白贝母F.taipaiensis、暗紫贝母F.unibracteata；药材伊贝母基原植物：伊犁贝母F.pallidiflora、新疆贝母F.walujewii)。市场上，存在将额敏贝母个头小者冒充为药材川贝母，个头大者冒充为药材伊贝母的现象，对药材川贝母、药材伊贝母临床使用的有效性、一致性造成很大影响。
针对上述混伪现象，传统方法凭借经验区分，难以准确鉴别，因此，亟需找到一种稳定可靠的方法将额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母加以鉴别区分，以避免额敏贝母混入上述贝母类药材，影响临床使用的有效性。
发明内容
额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母的性状相似，亲源关系较近，采用性状鉴别等传统鉴别方法难以区分，无法快速可靠地实现对额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母的鉴别。本发明通过分析多种不同贝母的核苷酸序列，本发明人意外地发现在matK基因里面存在特征性SNP，通过扩增matK片段，并鉴定所述SNP，可以将额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母区分开来。本发明人确定了具体用以区分额敏贝母和药材川贝母、药材伊贝母的SNP标记位点。
本发明提供了额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母鉴定用SNP标记位点。
在一个实施方式中，本发明提供一种来自额敏贝母的多核苷酸，所述多核苷酸包含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
在一个实施方式中，本发明提供一种来自药材川贝母、药材伊贝母的多核苷酸，所述多核苷酸包含如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
在一个实施方式中，本发明提供一种鉴别额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母的方法，其包括如下步骤：
1)以待测贝母样品DNA为模板，使用正向引物和反向引物进行扩增，得到扩增产物，所述正向引物包含SEQ ID No.2的核苷酸序列或由SEQ ID No.2的核苷酸序列构成，所述反向引物包含SEQ ID No.3的核苷酸序列或由SEQ ID No.3的核苷酸序列构成；
2)对所述扩增产物进行测序，测序后拼接并去除引物区获得完整扩增片段；
3)将所述完整扩增片段序列与SEQ ID No.1进行序列比对，
其特征在于，
a.如果所述完整扩增片段序列在相应于所述SEQ ID No.1的5′端起第145位为G、第171位为T、第172位为G，则鉴定所述待测贝母样品为来自额敏贝母的样品；
b.如果所述完整扩增片段序列在相应于所述SEQ ID No.1的5′端起第145位为T、第171位为C、第172位为A，则鉴定所述待测贝母样品为来自药材川贝母或伊贝母的样品。
在一个实施方式中本发明提供一种鉴定川贝母药材或伊贝母药材中是否混有额敏贝母的方法，其包括如下步骤：
1)以来自待测药材的多个样品的DNA为模板，使用正向引物和反向引物进行扩增，得到多个扩增产物，所述正向引物包含SEQ ID No.2的核苷酸序列或由SEQ ID No.2的核苷酸序列构成，所述反向引物包含SEQ ID No.3的核苷酸序列或由SEQ ID No.3的核苷酸序列构成；
2)对所述多个扩增产物进行测序，测序后拼接并去除引物区并获得多个完整扩增片段序列；和
3)将所述多个完整扩增片段序列分别与SEQ ID No.1进行序列比对，其特征在于，
a.如果所述多个完整扩增片段序列在相应于所述SEQ ID No.1的5′端起第145位均为T、第171位均为C、第172位均为A，则鉴定所述待测药材为川贝母药材或伊贝母药材；
b.如果所述多个完整扩增片段序列在相应于所述SEQ ID No.1的5′端起第145位均为G、第171位均为T、第172位均为G，则鉴定所述待测药材为额敏贝母；以及
c.如果所述多个完整扩增片段序列中的至少一种在相应于所述SEQ ID No.1的5′端起第145位为G、第171位为T、第172位为G，而至少另一种在相应于所述SEQ ID No.1的5′端起第145位为T、第171位为C、第172位为A，则鉴定所述待测药材为混有额敏贝母的川贝母药材或伊贝母药材。
在一个实施方式中本发明提供引物对在制备用于根据上述方法鉴别额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母的检测剂中的用途，所述引物对包括正向引物和反向引物；
所述正向引物包含SEQ ID No.2的核苷酸序列或由SEQ ID No.2的核苷酸序列构成；
所述反向引物包含SEQ ID No.3的核苷酸序列或由SEQ ID No.3的核苷酸序列构成。
在一个实施方式中本发明提供用于上述方法的试剂盒，所述试剂盒包含引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中：
所述正向引物包含SEQ ID No.2的核苷酸序列或由SEQ ID No.2的核苷酸序列构成；
所述反向引物包含SEQ ID No.3的核苷酸序列或由SEQ ID No.3的核苷酸序列构成。
本发明提供的鉴别方法不仅可以对基原植物样品进行鉴别，也可以用于对基原植物经加工后的产品样品进行鉴别，包括但不限于药材饮片的样品。
附图说明
图1为额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母基原植物序列的比对图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式、附图对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐述发明，而不是对本发明应用范围的限制。
实施例1
1)从主产地收集基原植物，其中额敏贝母样品10份，川贝母F.cirrhosa(《中国药典》收录为药材川贝母基原植物)样品4份，甘肃贝母F.przewalski(《中国药典》收录为药材川贝母基原植物)样品、瓦布贝母F.wabuensis(《中国药典》收录为药材川贝母基原植物)样品、梭砂贝母F.delavayi(《中国药典》收录为药材川贝母基原植物)样品、暗紫贝母F.unibracteata(《中国药典》收录为药材川贝母基原植物)样品各3份，太白贝母F.taipaiensis(《中国药典》收录为药材川贝母基原植物)样品2份，伊犁贝母F.pallidiflora样品(《中国药典》收录为药材伊贝母基原植物)、新疆贝母F.walujewii样品(《中国药典》收录为药材伊贝母基原植物)各6份样品；分别取20mg叶片，在MM400球磨仪(德国Retsh)上进行研磨粉碎后，先用700μL的核酚清洗1次，再用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取总DNA。
表1样品信息表
2)PCR扩增
引物序列正向引物：matK-19F CGTTCTGACCATATTGCACTATG；反向引物：matK-1326RTCTAGCACACGAAAGTCGAAGT，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物用无菌去离子溶解并稀释至2.5mol/μL。
25μL反应体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，引物各1.0μL(2.5mol/μL)，模板DNA2μL(-约30ng)，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。
PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：
3)测序
PCR产物经正反向测序，测序引物同PCR引物，然后将正反向测序结果进行拼接获得核苷酸序列(北京美吉桑格生物医药科技有限公司)。
4)序列拼接
本实施例采用应用软件Codon Code Aligner v.3.7(CodonCode Co.,USA)进行序列拼接，去除序列两端的引物，获得完整的额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母基原植物的matK基因扩增片段。
5)序列比对
用Bio Edit v.7.0.9.0软件对测序拼接后的各样品的matK序列进行比对，结果如图1所示。图1显示，共获得三个SNP位点。所有额敏贝母基原植物样品均具有SEQ ID No.1所示的matK核苷酸序列，所述matK序列在SEQ ID No.1的第145位为G、第171位为T、第172位为G。而所有药材川贝母、药材伊贝母基原植物均具有SEQ ID No.4所示的matK序列，所述SEQID No.4的matK序列在相应于SEQ ID No.1的第145位为T、第171位为C、第172位为A。因此可以确定，这三个SNP标记位点可特异性地用于鉴别额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母基原植物。
实施例2
基本同实施例1，所不同的是将实施例1中的额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母基原植物鳞茎晒干制成饮片，以饮片为样品，提取DNA进行鉴定。
结果显示，所有额敏贝母饮片样品的matK序列均具有SEQ ID No.1所示的matK核苷酸序列，所述matK序列在SEQ ID No.1的第145位为G、第171位为T、第172位为G。而所有药材川贝母、伊贝母饮片样品的matK序列均具有SEQ ID No.4所示的序列，所述SEQ ID No.4的matK序列在相应于SEQ ID No.1的第145位为T、第171位为C、第172位为A。因此可以确定，这三个SNP标记位点不仅可以用于鉴别额敏贝母和药材川贝母、药材伊贝母的基原植物，也可以用于鉴别额敏贝母和川贝母、伊贝母中药饮片。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院药用植物研究所
<120> 额敏贝母与药材川贝母、伊贝母鉴别方法
<130> 2018
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 187
<212> DNA
<213> 额敏贝母基原植物(Fritillaria meleagroides)matK片段
<400> 1
atgagaaaga tttctacata tccgaccaaa tcgatcaata atatcaaaat ctgataaatc 60
tgcccatatc ggcttactaa tcggatgtcc cgagaaagta caaaattttg ctttagataa 120
tgatccaata agagaaataa tggggattat agtatcaaat ttcttaataa tggtatctat 180
tagaaat 187
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cgttctgacc atattgcact atg 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tctagcacac gaaagtcgaa gt 22
<210> 4
<211> 187
<212> DNA
<213> 川贝母基原植物(Fritillaria cirrhosa)matK片段
<400> 4
atgagaaaga tttctacata tccgaccaaa tcgatcaata atatcaaaat ctgataaatc 60
tgcccatatc ggcttactaa tcggatgtcc cgagaaagta caaaattttg ctttagataa 120
tgatccaata agagaaataa tgggtattat agtatcaaat ttcttaataa cagtatctat 180
tagaaat 187

Claims (4)

1.一种鉴别额敏贝母与药材川贝母、药材伊贝母的方法，其包括如下步骤：
1）以待测贝母样品DNA为模板，使用正向引物和反向引物进行扩增，得到扩增产物，所述正向引物序列如SEQ ID No.2所示，所述反向引物序列如SEQ ID No.3所示；
2）对所述扩增产物进行测序并获得完整扩增片段序列；和
3）将所述完整扩增片段序列与SEQ ID No.1进行序列比对，
a. 如果所述完整扩增片段序列在相应于所述SEQ ID No.1的5′端起第145位为G、第171位为T、第172位为G，则鉴定所述待测贝母样品为来自额敏贝母的样品，所述额敏贝母的基源植物为额敏贝母(F. meleagroides)；
b.如果所述完整扩增片段序列在相应于所述SEQ ID No.1的5′端起第145位为T、第171位为C、第172位为A，则鉴定所述待测贝母样品为来自药材川贝母或伊贝母的样品，所述药材川贝母的基原植物为川贝母(F. cirrhosa)、甘肃贝母(F. przewalskii)、瓦布贝母(F. wabuensis)、梭砂贝母(F. delavayi)、太白贝母(F. taipaiensis)或暗紫贝母(F. unibracteata)，所述药材伊贝母的基原植物为伊犁贝母(F. pallidiflora)或新疆贝母(F. walujewii)。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤2）还包括在对所述扩增产物进行测序后拼接并去除引物区。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于所述样品为基原植物样品。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于所述样品为药材饮片样品。
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