CN102888456B - 三七快速鉴定方法 - Google Patents
三七快速鉴定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102888456B CN102888456B CN201210357278.5A CN201210357278A CN102888456B CN 102888456 B CN102888456 B CN 102888456B CN 201210357278 A CN201210357278 A CN 201210357278A CN 102888456 B CN102888456 B CN 102888456B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ginseng
- pseudo
- seq
- sequence
- species
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种三七快速鉴定方法，其包括如下步骤：1）以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段；2）对扩增产物进行测序，分析SEQ ID No.1所示的序列，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位为T或207位为T，则鉴定为三七，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位和第207位不是T，则待鉴定样品不是三七。本发明能够实现三七原植物及其近缘种、药材、生饮片、粉未和混淆品的快速、准确鉴定。
Description
技术领域
本发明术语中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及用特异的SNP鉴定三七的方法。
背景技术
三七（Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen）是人参属多年生植物，是我国传统中药材，含有多种生物活性成分。三七是名贵中药材，具有散瘀止血，消肿定痛之功效。可治疗各种出血症，人参“补气第一”,三七“补血第一”,味同而功亦。三七与人参(Panax ginseng C.A.Mey)、西洋参（Panax quinquefolium L.）、竹节参（Panax japonicus C.A.Mey.）及其变种狭叶竹节参（Panax japonicus C.A.Mey.var.angustifius(Burk)Cheng et Chu）、珠子参（Panax japonicus C.A.Mey.var.major(Burk)C.Y.Wu et K.M.Feng）、姜状三七（Panaxzingiberensis C.Y.Wu et K.）、屏边三七（Panax stipuleanatus Tsai etFeng）和假人参（Panax pseudoginseng Wall.）均作为药物使用，它们来源于同科、同属，为亲缘关系相近的植物，这几种药物在药性和功效方面有很大区别，尤其是三七归为活血、止血类药物而非滋补性药物，在中医临床上也区别使用。三七药材价格昂贵，市场上常出现其混伪品。由于三七与其近缘种、混伪品外形类似，传统的性状鉴别对三七与其近缘种的鉴定有一定困难，尤其对于药材市场存在的三七切片、粉末、种子和种苗的鉴别具有更大障碍。这就需要寻找到一种稳定可靠的方法将三七药材、饮片、粉末加以鉴定区分。
发明内容
本发明第一个目的在于提供三七鉴定用SNP标记。
本发明第二个目的在于提供三七鉴定用SNP标记在三七鉴定中的应用。
本发明第三个目的在于提供三七快速鉴定方法
本发明提供的三七鉴定用SNP标记，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，其中，SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位三七为T，其他物种为A或缺失；第207位三七为T，其他物种为C或A。
本发明提供的SNP可用于鉴定三七，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位为T或第207位为T，则鉴定为三七，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位和第207位不为T，则待鉴定样品不是三七。
本发明提供的三七鉴定方法，其包括如下步骤：
1）以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段；
2）对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端5.8S和26S基因区，获得完整ITS2基因间隔区，通过分析SEQ ID No.1所示的序列，确定自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位或第207位的碱基。
其中，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位为T或第207位为T，则鉴定为三七，否则不是三七。
本发明扩增时使用的引物序列为：
ITS2F 5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′
ITS3R 5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′
上述引物用于扩增三七的ITS2序列。
本发明还提供含有上述引物的试剂盒。
本发明提供了上述试剂盒在三七鉴定中的应用。
本发明方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的三七任何样品。因此，能够实现三七原植物与近缘种、药材、生饮片、粉末与混淆品的快速、准确鉴定。
附图说明
图1所示为ITS2序列的扩增结果，其中1-11分别代表SN01-SN11的扩增结果，CK为阴性对照。
图2所示为三七（P.notoginseng）的三个种内变异类型。
图3所示为三七（P.notoginseng）和其他物种ITS2序列的比对结果，其中图3a为ITS2基因间隔区，5’端起第140位，三七为T，其他物种为A或缺失；图3b为在第207位，三七为T，其他物种为C或A。
图4所示为三七与混伪品构建NJ树结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1三七药材原料的鉴定方法
1）从不同药材商店和道地产地（云南）收集的24份三七样品，分别取20mg药材，在MM400球磨仪（德国Retsch）上进行研磨，用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA。
表1三七样品信息表
2）PCR扩增
引物序列为ITS2F：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；ITS3R：GACGCTTCTCCAGACTACAAT，由生工生物工程公司有限公司（北京）合成。引物用无菌去离子溶解并稀释至2μmol/μL。
25μL反应体系：PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg2+ 2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL（2.5mmol/L），引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 1μL(-约30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。
PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：
分别取5μL的PCR扩增产物上样，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果。（图1）
3）测序
PCR产物直接送中国农业科学院重大工程实验室测序。测序引物同本发明的ITS2F和ITS3R的PCR引物。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得DNA条形码序列。
4）序列拼接
本实施例采用应用软件CodonCode Aligner 3.7.1（CodonCode Co.,Germany）进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接，具体方法是：以20bp的窗口分别从序列5’端和3’端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。测序结果的剩余部分需大于150bp，且平均Q值大于等于30。最后进行序列拼接，根据Hidden Markov Model(HMM)模型，去除序列两端5.8S和26S基因区，获得完整的三七ITS2基因间隔区序列。从GenBank中下载药典规定的五种人参属药用植物及三七混伪品的ITS/ITS2序列，同样根据Hidden Markov Model(HMM)模型，去除序列两端5.8S和26S基因区，获得完整的ITS2基因间隔区序列。
5）序列比对
用MEGA 5软件对测序并拼接后的各个样品以及GenBank中人参属植物的ITS2基因间隔区序列进行比对，共获得2个SNP位点，所有三七样品的ITS2基因间隔区序列（SEQ ID No.1）的第140位为T，第207位为T，而其他物种（姜状三七、羽叶三七、竹节参、狭叶竹节参、西洋参、假人参）的ITS2基因间隔基因区序列的第140位为A或缺失，第207位为C或A，表明这两个SNP位点可特异性地用于三七的鉴定。这两个SNP位点存在于所有实验数据及GenBank数据中，由于数据较多，图3a和图3b仅显示了部分序列比对结果。三七存在较小种内变异（包括所有实验数据及GenBank数据），图2列出了三七的三个种内变异类型，种内变异位点不影响三七两个特异的SNP位点的鉴定。
6）构建系统发育树（NJ树）
由于三七的伪品莪术和高良姜的ITS2序列与三七的相差较大，可直接构建NJ树将其区分。将完整的三七及莪术（Curcumaphaeocaulis）、高良姜（Alpinia officinarum）的ITS2序列导入MEGA5软件中进行比对，用比对结果构建以K2P为模型的NJ树，结果如图4所示。
实施例2三七饮片的鉴定
基本同实施例1，所不同的是以三七饮片为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性地检测到上述的2个SNP位点。并且序列对比发现，三七饮片DNA的ITS2基因间隔区序列（SEQ ID No.1）的第140位为T，第207位为T。
实施例3三七粉末的鉴定
基本同实施例1，所不同的是以三七粉末为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性地检测到上述的两个SNP位点，并且序列对比发现，三七粉末DNA的ITS2基因间隔区序列（SEQ ID No.1）的第140位为T，第207位为T。
本发明序列表中SEQ ID No.1为三七（P.notoginseng）的一致序列(consensus sequence)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种利用SNP标记对三七及其近缘物种和混伪品进行快速鉴定的方法，其包括如下步骤：
1）以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段；
2）对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端5.8S和26S基因区，获得完整ITS2基因间隔区，通过分析SEQ ID No.1所示的序列，确定自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位或第207位的碱基；
3）如果SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位为T，则鉴定为三七，若在SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位为A或缺失，则鉴定为其他物种；或者，如果SEQ ID No.1所示序列的5’端起第207位为T，则鉴定为三七，若为C或A，则鉴定为其他物种；
其中，用于扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段的引物为：
正向ITS2F5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；
反向ITS3R5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′；
所述的其他物种选自姜状三七、羽叶三七、竹节参、狭叶竹节参、西洋参、假人参。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210357278.5A CN102888456B (zh) | 2012-09-21 | 2012-09-21 | 三七快速鉴定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210357278.5A CN102888456B (zh) | 2012-09-21 | 2012-09-21 | 三七快速鉴定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102888456A CN102888456A (zh) | 2013-01-23 |
| CN102888456B true CN102888456B (zh) | 2014-03-26 |
Family
ID=47532138
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210357278.5A Expired - Fee Related CN102888456B (zh) | 2012-09-21 | 2012-09-21 | 三七快速鉴定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102888456B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104611328A (zh) * | 2015-01-12 | 2015-05-13 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 东方泽泻和泽泻快速鉴定方法 |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104480105B (zh) * | 2014-08-29 | 2018-02-13 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 藏菖蒲快速鉴定方法 |
| CN104450905B (zh) * | 2014-12-02 | 2018-01-19 | 中国中医科学院中药研究所 | 一种凉粉草与溪黄草的dna鉴定方法 |
| CN104830969B (zh) * | 2015-03-17 | 2017-10-17 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 一种三七分子身份证及鉴定方法 |
| CN106701955B (zh) * | 2017-01-09 | 2020-03-03 | 中国中医科学院中药研究所 | 一种用于同时鉴定中药人参、西洋参和三七的引物组合及其应用 |
| CN106834497B (zh) * | 2017-03-03 | 2020-07-03 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 鉴定不同产地道地药材锁阳的方法及其试剂盒 |
| CN108384876A (zh) * | 2018-03-23 | 2018-08-10 | 云南农业大学 | 鉴定三七成分的环介导等温扩增荧光检测方法、引物、试剂盒及应用 |
| CN110317894B (zh) * | 2018-03-29 | 2023-05-26 | 深圳市华大农业应用研究院 | 与三七总根重紧密连锁的snp分子标记及其应用 |
| CN110317893B (zh) * | 2018-03-29 | 2023-06-27 | 深圳市华大农业应用研究院 | 一种与三七总根重紧密连锁的snp分子标记及其应用 |
| CN113462668A (zh) * | 2018-09-19 | 2021-10-01 | 云南农业大学 | 齐墩果酸葡糖醛酸转移酶及其编码基因和应用 |
| CN112877462A (zh) * | 2021-03-10 | 2021-06-01 | 宁波城市职业技术学院 | 一种不同产地竹节参快速鉴定的分子方法 |
| CN113684265A (zh) * | 2021-09-27 | 2021-11-23 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 鉴定钩吻及易混淆品和待测样本是否掺入钩吻的方法 |
| CN114182036A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-03-15 | 天津师范大学 | 用于鉴定三七或含三七制品的引物对、探针及方法 |
| CN114182002A (zh) * | 2021-11-22 | 2022-03-15 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 一种检测中成药中三七的方法及应用 |
| CN116334188B (zh) * | 2023-05-24 | 2023-08-15 | 云南珩柯生物科技有限公司 | 鉴别屏边三七的方法、引物、探针及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101654709A (zh) * | 2008-08-18 | 2010-02-24 | 韩国农村振兴厅 | 利用sts引物鉴定人参品种的方法 |
-
2012
- 2012-09-21 CN CN201210357278.5A patent/CN102888456B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101654709A (zh) * | 2008-08-18 | 2010-02-24 | 韩国农村振兴厅 | 利用sts引物鉴定人参品种的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 李美妮等.基于ITS2 序列的女贞子原植物及其混伪品的分子鉴定.《世界科学技术（中医药现代化）》.2011,第13卷(第4期),方法和结果部分. * |
| 石林春等.豆蔻属药用植物DNA条形码鉴定研究.《世界科学技术(中医药现代化)》.2010,第12卷(第3期),全文. * |
| 陈士林.中药DNA条形码分子鉴定.《中药DNA条形码分子鉴定》.人民卫生出版社,2012,(第1版),第65－66页. * |
| 陈士林等.中药DNA条形码鉴定体系及研究方向.《世界科学技术(中医药现代化)》.2011,第13卷(第5期),全文. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104611328A (zh) * | 2015-01-12 | 2015-05-13 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 东方泽泻和泽泻快速鉴定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102888456A (zh) | 2013-01-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102888456B (zh) | 三七快速鉴定方法 | |
| Gao et al. | DNA mini-barcoding: a derived barcoding method for herbal molecular identification | |
| CN106591459B (zh) | 快速鉴定屏边三七及西洋参等人参属中药的snp标记、试剂盒及方法 | |
| CN102505045B (zh) | 人参和西洋参快速鉴定方法 | |
| Sun et al. | The potential power of Bar-HRM technology in herbal medicine identification | |
| JP7131086B2 (ja) | 生薬鑑別用プライマーセット及びそれを用いた生薬鑑別方法 | |
| CN106701955B (zh) | 一种用于同时鉴定中药人参、西洋参和三七的引物组合及其应用 | |
| WO2018072064A1 (zh) | 一种基于单分子测序技术及dna条形码分子鉴定技术联用的生物物种组成的监测方法 | |
| CN103173532A (zh) | 一种鉴别金银花和山银花的方法及其应用 | |
| Dian-Yun et al. | Molecular identification of Corni Fructus and its adulterants by ITS/ITS2 sequences | |
| CN104830969B (zh) | 一种三七分子身份证及鉴定方法 | |
| CN104611445A (zh) | 肉桂快速分子鉴定方法 | |
| CN105543373B (zh) | 乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草及其杂交品种的快速分子鉴定方法 | |
| CN107630102B (zh) | 安白芍pcr鉴定试剂盒及鉴定方法 | |
| CN107475359A (zh) | 一种药食同源药材酸枣仁及其混伪品的dna条形码鉴定方法 | |
| CN106048020A (zh) | 动物药材僵蚕的基因身份证 | |
| CN105567799A (zh) | 一种当归分子身份证及鉴定方法 | |
| Grazina et al. | Towards authentication of Korean ginseng-containing foods: Differentiation of five Panax species by a novel diagnostic tool | |
| CN104480105B (zh) | 藏菖蒲快速鉴定方法 | |
| KR101948389B1 (ko) | Ssr 마커를 이용한 더덕 및 잔대의 감별방법 | |
| CN106399474B (zh) | 一种铁皮石斛干药材分子鉴定方法及其应用 | |
| Xie et al. | Biological ingredient analysis of Traditional Herbal Patent Medicine Fuke Desheng Wan using the shotgun metabarcoding approach | |
| Zhokhova et al. | Current state and prospects of DNA barcoding and DNA fingerprinting in the analysis of the quality of plant raw materials and plant-derived drugs | |
| CN104830971A (zh) | 一种西洋参分子身份证及鉴定方法 | |
| Xiong et al. | Identification of Andrographis Herba and its common products using mini-barcode |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140326 Termination date: 20200921 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |