CN106048020A - 动物药材僵蚕的基因身份证 - Google Patents

动物药材僵蚕的基因身份证 Download PDF

Info

Publication number
CN106048020A
CN106048020A CN201610415063.2A CN201610415063A CN106048020A CN 106048020 A CN106048020 A CN 106048020A CN 201610415063 A CN201610415063 A CN 201610415063A CN 106048020 A CN106048020 A CN 106048020A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
seq
bombyx batryticatus
animal
silkworm
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610415063.2A
Other languages
English (en)
Inventor
宋经元
贾静
石林春
姚辉
陈士林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Original Assignee
Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC filed Critical Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority to CN201610415063.2A priority Critical patent/CN106048020A/zh
Publication of CN106048020A publication Critical patent/CN106048020A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种动物药材僵蚕的基因身份证，其包括如下步骤：1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列；2)对扩增产物进行测序，分析SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列，分别鉴定为动物家蚕和真菌白僵菌。本发明能够实现僵蚕药材的准确鉴定，为其提供基因身份证。

Description

动物药材僵蚕的基因身份证
技术领域
本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及动物药材僵蚕的基因身份证。
背景技术
僵蚕(Bombyx Batryticatus)为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus 4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌Beauveria bassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥体，亦称白僵蚕、姜虫、天虫等，始载于《神农本草经》，为传统的平肝息风药。临床上僵蚕可作为单方或与其它中药配伍使用，在治疗糖尿病及其并发症、高血压、脂肪肝、前列腺增生、甲状腺瘤、哮喘和荨麻疹等疾病发挥良好疗效。据统计，513种常用成药中，含有僵蚕的有49种，64种儿科成药中含有僵蚕的有29种，如小儿奇应丸、七珍丸、小儿镇惊丸等。随着僵蚕在药用、保健食品和化妆品中的应用，僵蚕的药用价值备受关注，药材市场需求量剧增，每年国内需求量达到2500～3000t，且常年外销出口。市售僵蚕药材仅凭外观形态难以准确辨认，尤其是经麸炒加工后的药材，极易鉴定错误，这就需要寻找到一种稳定可靠的方法将僵蚕药材加以鉴定区分。
发明内容
本发明第一个目的在于提供用动物基因组DNA提取试剂盒可同时将动物家蚕和真菌白僵菌的DNA提取出来的方法。
本发明第二个目的在于提供用同一份混合DNA模板可分别扩增出动物家蚕COI序列和真菌白僵菌ITS序列的方法。
本发明第三个目的在于提供动物药材僵蚕的基因身份证。
本发明提供的僵蚕药材基因身份证，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，可同时鉴定动物家蚕和真菌白僵菌。
本发明提供的基因身份证可用于鉴定动物药材僵蚕。
本发明提供的动物药材僵蚕的基因身份证，其包括如下步骤：
1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的片段；
2)对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端引物区，获得完整COI序列和ITS序列，通过分析SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列，鉴定动物家蚕和真菌白僵菌。
COI扩增引物，其序列为：
正向引物：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；
反向引物：TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。
ITS扩增引物，其序列为：
正向引物：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；
反向引物：TCCTCCGCTTATTGATATGC。
上述引物分别用于扩增僵蚕COI序列和白僵菌ITS序列。
本发明还提供含有上述引物的僵蚕和白僵菌鉴定试剂盒。
本发明方法适用性广，能检测所有能提取出DNA的僵蚕和白僵菌任何样品。因此，能够实现僵蚕药材的准确鉴定，为其提供基因身份证。
附图说明
图1所示为市售僵蚕药材(注：a：YC2069MT01；b：YC2069MT10；c：YC2069MT24；d：YC2069MT61；e：YC2069MT75)
图2所示为基于ITS序列构建的白僵菌及其混伪品的邻接(NJ)树
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1)从不同药材市场收集的23份僵蚕样品，用75％乙醇擦拭药材表面后，放置45℃烘箱中充分干燥，然后用已灭菌的小锤子，避开头尾，将样品敲碎成小块，取30mg，在MM400球磨仪(德国Retsch)上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的动物基因组DNA试剂盒提取总DNA。
表1僵蚕样品信息
序号 样品编号 购买地点
1 YC2069MT01 僵蚕 安徽亳州药市
2 YC2069MT02 僵蚕 安徽毫州药市
3 YC2069MT03 僵蚕 安徽亳州药市
4 YC2069MT04 僵蚕 安徽毫州药市
5 YC2069MT05 僵蚕 安徽毫州药市
6 YC2069MT06 僵蚕 安徽亳州药市
7 YC2069MT07 僵蚕 安徽亳州药市
8 YC2069MT08 僵蚕 安徽亳州药市
9 YC2069MT09 僵蚕 安徽毫州药市
10 YC2069MT10 僵蚕 安徽亳州药市
11 YC2069MT11 僵蚕 安徽毫州药市
12 YC2069MT12 僵蚕 安徽亳州药市
13 YC2069MT13 僵蚕 安徽亳州药市
14 YC2069MT14 僵蚕 安徽毫州药市
15 YC2069MT15 僵蚕 安徽亳州药市
16 YC2069MT16 僵蚕 四川成都荷花池药市
17 YC2069MT17 僵蚕 四川成都荷花池药市
18 YC2069MT18 僵蚕 四川成都荷花池药市
19 YC2069MT19 僵蚕 四川成都荷花池药市
20 YC2069MT57 僵蚕 重庆储奇门药市
21 YC2069MT58 僵蚕 重庆储奇门药市
22 YC2069MT59 僵蚕 重庆储奇门药市
23 YC2069MT60 僵蚕 重庆储奇门药市
2)COI序列扩增
引物序列正向引物：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；反向引物：TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA，由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用无菌去离子溶解并稀释至2μmol/μL。
25μL反应体系：PCRmix 12.5μL，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 20～100ng，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。
PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：
分别取3μL的PCR扩增产物上样，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果。
3)ITS序列扩增
引物序列正向引物：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；反向引物：TCCTCCGCTTATTGATATGC，由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用无菌去离子溶解并稀释至2μmol/μL。
25μL反应体系：PCRmix 12.5μL，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 20～100ng，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。
PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：
分别取3μL的PCR扩增产物上样，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果。
4)测序
PCR产物直接送中国农业科学院重大工程实验室测序。测序引物同PCR引物。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得DNA条形码序列。
5)序列拼接
本实施例采用应用软件CodonCode Aligner V 6.0.2(CodonCode Co.，USA)进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接，具体方法是：以20bp的窗口分别从序列5’端和3’端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。测序结果的剩余部分需大于150bp，且平均Q值大于等于30(Chen et al.2010)。最后进行序列拼接，去除序列两端引物区，获得完整的僵蚕COI和白僵菌ITS序列。
6)序列比对
用MEGA6.0软件进行序列拼接，分别将COI和ITS序列提交至中药材DNA条形码鉴定系统进行鉴定，并基于ITS序列构建邻接树，结果如图2所示。该技术可以准确鉴定家蚕，并且基于ITS序列构建的邻接树能够明显区分白僵菌与其它致病菌株，表明基因身份证可特异性地用于鉴定动物药材僵蚕。
实施例2
基本同实施例1，所不同的是将购买自药店的66份僵蚕药材(表2)，以该药材为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能为动物药材僵蚕提供基因身份证。
表2僵蚕样品信息
实施例3
基本同实施例2，所不同的是将购买自医院的26份僵蚕药材(表3)，以该药材为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能为动物药材僵蚕提供基因身份证。
表3僵蚕样品信息
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.动物药材僵蚕的基因身份证，其特征在于，可同时提供动物家蚕和真菌白僵菌的基因身份证，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的基因身份证在鉴定动物药材僵蚕中的应用，其特征在于，使用动物基因组DNA提取试剂盒可同时将动物家蚕和真菌白僵菌的DNA提取出来，并且同一份混合DNA模板可分别扩增出动物家蚕COI序列和真菌白僵菌ITS序列。
3.僵蚕鉴定方法，其包括如下步骤：
1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的片段；
2)对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端引物区，获得完整COI和ITS序列，通过分析SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列，鉴定家蚕和白僵菌。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，使用动物基因组DNA提取试剂盒可同时将动物家蚕和真菌白僵菌的DNA提取出来，并且同一份混合DNA模板可分别扩增出动物家蚕COI序列和真菌白僵菌ITS序列。
5.权利要求1所述的基因身份证在鉴定僵蚕中的应用，无论通过何种方式获得包含SEQID No.1和SEQ ID No.2所示的序列，均可用基因身份证鉴定僵蚕。
6.含有权利要求中5中所述的方式鉴定僵蚕试剂盒。
CN201610415063.2A 2016-06-15 2016-06-15 动物药材僵蚕的基因身份证 Pending CN106048020A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610415063.2A CN106048020A (zh) 2016-06-15 2016-06-15 动物药材僵蚕的基因身份证

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610415063.2A CN106048020A (zh) 2016-06-15 2016-06-15 动物药材僵蚕的基因身份证

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106048020A true CN106048020A (zh) 2016-10-26

Family

ID=57170949

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610415063.2A Pending CN106048020A (zh) 2016-06-15 2016-06-15 动物药材僵蚕的基因身份证

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106048020A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107164471A (zh) * 2017-05-18 2017-09-15 华南农业大学 一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法
CN107937567A (zh) * 2017-12-29 2018-04-20 江苏大学 一组鉴定僵蚕的特异性引物及其鉴定方法
CN112824542A (zh) * 2019-11-20 2021-05-21 东莞市东阳光冬虫夏草研发有限公司 鉴别白僵菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用
WO2023082512A1 (zh) * 2021-11-10 2023-05-19 广东一方制药有限公司 僵蚕特征多肽以及僵蚕、僵蚕水提物制品和其他僵蚕制品的鉴别方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112525A (zh) * 2015-08-27 2015-12-02 中国医学科学院药用植物研究所 一种用于动物药材dna条形码鉴定的方法及pcr试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112525A (zh) * 2015-08-27 2015-12-02 中国医学科学院药用植物研究所 一种用于动物药材dna条形码鉴定的方法及pcr试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIANG L等: "DNA barcoding the commercial Chinese caterpillar fungus", 《FEMS MICROBIOL LETT》 *
何劲等: "一株虫生真菌的分离鉴定及杀虫活性初探", 《安徽农业科学》 *
张龙霏等: "利用DNA条形码检验中药制剂中的羚羊角药材", 《中草药》 *
陈士林等: "中药DNA条形码鉴定体系及研究方向", 《世界科学技术(中医药现代化)》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107164471A (zh) * 2017-05-18 2017-09-15 华南农业大学 一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法
CN107164471B (zh) * 2017-05-18 2020-08-07 华南农业大学 一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法
CN107937567A (zh) * 2017-12-29 2018-04-20 江苏大学 一组鉴定僵蚕的特异性引物及其鉴定方法
CN107937567B (zh) * 2017-12-29 2020-09-25 江苏大学 一组鉴定僵蚕的特异性引物及其鉴定方法
CN112824542A (zh) * 2019-11-20 2021-05-21 东莞市东阳光冬虫夏草研发有限公司 鉴别白僵菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用
WO2023082512A1 (zh) * 2021-11-10 2023-05-19 广东一方制药有限公司 僵蚕特征多肽以及僵蚕、僵蚕水提物制品和其他僵蚕制品的鉴别方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sgamma et al. DNA barcoding for industrial quality assurance
JP7131086B2 (ja) 生薬鑑別用プライマーセット及びそれを用いた生薬鑑別方法
CN102888456B (zh) 三七快速鉴定方法
CN106048020A (zh) 动物药材僵蚕的基因身份证
Chen et al. Characterization of the Lycium barbarum fruit transcriptome and development of EST-SSR markers
CN104762409A (zh) 采用重组酶介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法
CN107164471B (zh) 一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法
Li et al. Application of molecular genetics method for differentiating Martes zibellina L. heart from its adulterants in traditional Chinese medicine based on mitochondrial cytochrome b gene
CN109868324A (zh) 一种特异性引物及其检测方法
CN105087798A (zh) 红木中降香黄檀的分子鉴定方法及其引物和探针
CN104611445A (zh) 肉桂快速分子鉴定方法
Zhang et al. A simple and effective method to discern the true commercial Chinese cordyceps from counterfeits
Lima et al. Seasonal change in main alkaloids of jaborandi (Pilocarpus microphyllus Stapf ex Wardleworth), an economically important species from the Brazilian flora
Álvarez-Pérez et al. Polyphasic characterization of fungal isolates from a published case of invasive aspergillosis reveals misidentification of Aspergillus felis as Aspergillus viridinutans
KR20210038410A (ko) 한 세트의 자영지와 적영지 균종 감별용 특이적 분자 마커 및 감별 방법과 응용
KR101748566B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 국화 품종식별 방법
Jiang et al. TMT-Based Proteomic Analysis of Continuous Cropping Response in Codonopsis tangshen Oliv.
Xie et al. Biological ingredient analysis of Traditional Herbal Patent Medicine Fuke Desheng Wan using the shotgun metabarcoding approach
CN104498593A (zh) 鉴定或辅助鉴定仓储豆象的引物对及其试剂盒
CN106282390A (zh) 宁夏枸杞和枸杞snp快速鉴定方法
Korobkova et al. Permanent spreading of 1RS. 1AL and 1RS. 1BL translocations in modern wheat breeding
Liu et al. Illumina MiSeq sequencing investigation of Chanhua (Cordyceps cicadae Shing) fungal community structures in different regions
CN104830971A (zh) 一种西洋参分子身份证及鉴定方法
CN111979352A (zh) 一种用于mRT-PCR检测半夏侵染病毒的体系及其应用
CN105567842B (zh) 鉴定猴头菇猴杰2号的引物对及方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20161026

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication