CN107937567A

CN107937567A - 一组鉴定僵蚕的特异性引物及其鉴定方法

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Publication number: CN107937567A
Application number: CN201711487245.1A
Authority: CN
Inventors: 杨欢; 周莹; 沈玉萍; 杨娅娅; 吴啟南; 夏国华; 陈宇菲; 鹿蓓蓓
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2018-04-20
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN107937567B

Abstract

本发明涉及一组鉴定僵蚕的特异性引物及其鉴定方法，属于中药鉴定技术领域；本发明将僵蚕样品粉碎后采用CTAB法同时提取家蚕和菌物中的DNA，并以此为模板，选用经设计与筛选得到的特异性核苷酸序列为引物进行PCR扩增，继而将产物进行琼脂糖凝胶电泳分析与凝胶成像系统检测，最终依据检测结果判别僵蚕的真伪和掺伪情况；通过本发明的方法判断样品是否为僵蚕伪品或掺伪品，操作简单、无需测序、专属性强、快速准确，在僵蚕样品真伪鉴定中具有独特的优势及重要的应用价值。

Description

一组鉴定僵蚕的特异性引物及其鉴定方法

技术领域

本发明涉及一组鉴定僵蚕的特异性引物及其鉴定方法，属于中药鉴定领域。

背景技术

僵蚕，为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus 4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌Beauveria bassiana(Bals.)Vuilknt而致死的干燥体。多于春、秋季生产，将感染白僵菌病死的蚕干燥。僵蚕始载于《神农本草经》，应用历史悠久，咸、辛，平，归肝、肺、胃经，具有息风止痉、祛风止痛和化痰散结等功效。现代药理研究表明，僵蚕具有抗凝、抗惊厥、抗癌和镇静催眠等作用。

僵蚕是常见的中药动物药，疗效确实、药用价值高，年需求量在400吨以上，且常年外销出口。由于僵蚕的使用量较大，市面上出现了不少伪品或掺伪品，例如用石灰水将死家蚕掺白加工而成，或将绿僵菌感染致死的家蚕、黑死蚕等冒充正品使用，对僵蚕质量造成了不良影响，也给消费者带来了不可忽视的安全隐患。因此，采用合适的技术鉴别僵蚕的真伪是很关键的问题。

近年来，有学者运用分子生物学技术开展了对僵蚕的鉴定研究，例如基于COI序列和ITS序列的DNA条形码技术，主要利用动物基因组DNA提取试剂盒同时提取家蚕和白僵菌的DNA，然后分别扩增COI序列和ITS序列，并进行扩增产物测序，继而建立NJ类聚树分析，对鉴定同时含有动物和真菌的复合型药材起到了一定效果。但是，在普通PCR技术利用DNA序列进行物种的鉴定过程中，由于采用了通用引物，因此在完成扩增后，需要进行产物测序并与基因数据库比对，从而判断种属，步骤较多、耗时长、需要专门设备；此外，还无法实现对于掺伪品的检识，或者由于掺伪现象而影响鉴定结果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，本发明针对僵蚕正品以及常见伪品的物种设计特异性引物，并提供了利用特异性引物扩增技术鉴别僵蚕的方法。

该法操作简单、专属性强、鉴别快速、无需测序，能准确直观地鉴别僵蚕的真伪(包括掺伪)。本发明为僵蚕的专属性鉴定提供一条新的途径，有助于监控僵蚕药材的质量，从而有利于保障临床用药的安全性、有效性，具有重要的应用价值。

本发明通过以下步骤达到快速鉴定僵蚕真伪的目的：

本发明首先提供一组鉴定僵蚕的特异性引物，所述引物为PBM-1或PBM-2和PBB-1或PBB-2；PBM-1上下游引物如SEQ.ID.NO.1和2所示，PBM-2上下游引物如SEQ.ID.NO.3和4所示；PBB-1上下游引物如SEQ.ID.NO.5和6所示，PBB-2上下游引物如SEQ.ID.NO.7和8所示。

进一步的，在上述特异性引物鉴定过程中，若受试样品为完整的僵蚕且结果显示为阳性，则判断为正品僵蚕，若受试样品经切片或粉碎，为非完整的僵蚕(如碎片、粉末)且结果显示为阳性，则需进一步鉴定是否为掺伪品(含绿僵菌)。

所述鉴定僵蚕的特异性引物还包括引物PMA-1或PMA-2，PMA-1上下游引物如SEQ.ID.NO.9和10所示；PMA-2上下游引物如SEQ.ID.NO.11和12所示。

所述引物PBM-1或PBM-2均来自于家蚕(Bombyx mori)，PBB-1或PBB-2均来自于白僵菌(Beauveria bassiana)，并且引物PBM-1或PBM-2和PBB-1或PBB-2均能达到鉴定僵蚕的目的；引物PMA-1或PMA-2均来自于绿僵菌(Metarhizium anisopliae)，并且均能达到鉴定僵蚕中是否掺伪含绿僵菌的僵蚕的目的。

具体的，各引物序列信息如下表所示：

本发明还提供一种特异性鉴定僵蚕的试剂盒，所述试剂盒包括上述的特异性引物PBM-1或PBM-2引物对、PBB-1或PBB-2引物对、DNA阳性对照、PCR反应体系、电泳鉴定体系。

进一步的，所述试剂盒还包括上述的特异性引物PMA-1或PMA-2引物对。

本发明还提供一种利用特异性引物扩增技术鉴定僵蚕的方法，首先采用CTAB法制备供试品溶液，利用CTAB在高离子强度的缓冲溶液中与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但不沉淀核酸的特性，不仅能同时获取家蚕、白僵菌和绿僵菌的DNA，且DNA浓度和纯度较高，具有操作便捷、成本较低等优势，然后利用PCR及琼脂糖凝胶电泳技术快速检测目标片段。

其中供试品溶液的制备方法按照下述步骤进行：

(1)精密称取僵蚕粉末10mg～60mg，加入2×CTAB提取液500μL～1000μL，55℃～65℃水浴1h～6h后，12000r/min离心10min，取上清液；

(2)加入与上清液等体积的氯仿/Tris-饱和酚(1:1)混合液，混匀后于12000r/min离心10min，取上清液，加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合液，混匀后再次离心，取上清液；

(3)加入3M醋酸钾溶液80μL～100μL，再加与上清液等体积的预冷异丙醇，混匀后置于-20℃下冷冻1h或4℃下冷藏过夜；

(4)12000r/min离心10min，弃上清液，加入70％乙醇500μL～1000μL洗涤沉淀，再次离心，弃上清液，收集沉淀，室温干燥30min；

(5)加入25μL～50μL的TE溶液溶解，-20℃或4℃下保存，备用。

一组特异性引物及其鉴定僵蚕的方法，检测方法按照下述步骤进行：

(1)以制备的DNA供试品溶液为模板，配制PCR反应体系，设置扩增程序，进行PCR扩增；

(2)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，于凝胶成像分析系统判定结果。

步骤(1)中所述的PCR反应体系，以25μL为例，包括：1×PCR缓冲液、2.0mM MgCl₂、0.2mM dNTPs、0.1μM～0.4μM引物对、0.625U Taq DNA聚合酶、模板DNA1ng～600ng，加灭菌双蒸水补足至25μL。PCR扩增程序为：95℃3min；95℃30s，56℃～65℃30s，72℃1min，循环数30～40；72℃5min～7min。

步骤(2)中所述的电泳检测是指扩增产物采用含EB染料的2％～3％TBE琼脂糖凝胶分离后凝胶成像判定结果，上样量为3μL～10μL。

本发明的有益效果如下：

本发明直接从分子水平对动物类中药进行鉴定，提供了快速准确鉴定僵蚕真伪的特异性引物及检测方法。该方法中以僵蚕DNA为模板，采用所设计并经筛选后确定的三组特异性引物进行PCR反应，由于目的产物很短(<80bp)，非常有益于扩增的进行；所采用的CTAB法可以同时提取出家蚕和菌物中的DNA；此外，通过凝胶电泳分析，根据电泳条带的有无及分子量大小即可快速鉴定僵蚕的真伪和掺伪情况。本发明具有操作简单、无需测序、专属性强、快速准确的特点，在动物类药材真伪品快速检测方面具有独特的优势，具有重要的应用价值。

附图说明

图1是筛选特异性引物PBM-1、PBM-2和PMA-1及PMA-2的电泳结果图。

图2是筛选特异性引物PBB-1和PBB-2的电泳结果图。

图3是各引物特异性和优化PCR条件的电泳结果图。

图4是采用PBM-2和PBB-1对10批自制僵蚕药材进行鉴定的电泳结果图。

图5是采用PMA-1对10批自制僵蚕药材进行鉴定的电泳结果图。

图6采用PBM-2、PBB-1和PMA-1对自制僵蚕饮片进行鉴定的电泳结果图。

图7是采用PBM-1和PBB-2对10批自制僵蚕药材进行鉴定的电泳结果图。

图8是采用PMA-2对10批自制僵蚕药材进行鉴定的电泳结果图。

图9是采用PBM-2和PBB-1对10批自制的僵蚕药材伪品(由绿僵菌接种)进行鉴定的电泳结果图。

图10是采用PMA-1对10批自制的僵蚕药材伪品(由绿僵菌接种)进行鉴定的电泳结果图。

图11是采用PBM-2、PBB-1和PMA-1对15批市售僵蚕饮片进行鉴定的电泳结果图。

图中，BB：白僵菌；BM：家蚕对照品；MA：绿僵菌；L：Low ladder SN127；N：阴性对照；T₁～T₁₀：10批自制僵蚕药材；SP₁～SP₁₀：10批自制僵蚕饮片；F₁～F₁₀：10批僵蚕药材伪品；，S₁～S₁₅：15批市售僵蚕饮片。

具体实施方式

为更好的使本领域技术人员理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式进一步阐述。

本发明中所用样品材料包括自制药材和饮片以及市售饮片。

白僵菌，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心；家蚕对照品，来自中国药品生物制品检定所；绿僵菌，来自中国农业微生物菌种保藏管理中心。

15批市售僵蚕饮片：S_1～S₁₁来自安徽亳州盛海堂中药饮片有限公司，S₁₂来自安徽亳州蜀中药业有限公司，S₁₃～S₁₅来自安徽亳州佰世信中药饮片公司，各批次产地和批号分别为：S₁：安徽140924；S₂：四川141022；S₃：江苏150112；S₄：四川150212；S₅：四川150406；S₆：安徽150420；S₇：广西150420；S₈：山东150420；S₉：广西150510；S₁₀：山东150510；S₁₁：四川150510；S₁₂：江苏150701；S₁₃：广东151211；S₁₄：浙江160301；S₁₅：四川160601。

实施例1：特异性引物的设计与筛选

(1)试剂

Tris平衡酚(Solarbio LIFE SCIENCES T0250)、乙二胺四乙酸二钠、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、十二烷基硫酸钠、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、硼酸、Dream Taq Green DNAPolymerase(Thermo Scientific#EP0712)、dNTP Mix(Thermo Scientific#R0192)、Agarose(SunShineBio A0009-3)、Ethidium Bromide(SunShineBio SN314-1)。试剂均为分析纯，引物由上海生工有限公司合成。

(2)方法

a.设计特异性引物：

在GenBank数据库中搜索下载家蚕(GU966628.1、GU966626.1、GU966625.1、GU966624.1、GU966623.1、GU966622.1、GU966620.1、GU966618.1、GU966617.1、GU966615.1、GU966614.1、GU966613.1、GU966612.1、GU966611.1、GU966610.1、GU966609.1、GU966608.1、GU966607.1、GU966605.1、GU966604.1、GU966603.1、GU966602.1、GU966600.1、GU966599.1、GU966596.1、GU966595.1、GU966594.1、KM347743.1、NC_002355.1、NC_003395.1、AF149768.1、AY048187.1、GU966630.1、KM279431.1、KM875545.1、KP192478.1、KP192479.1、KP244370.1、KP313778.1)白僵菌(EU371503.2、KT201148.1、KT201149.1、KU869769.1、NC_010652.2)以及绿僵菌(AY884128.1、NC_008068.1)的基因组序列，根据DNAMAN软件比对家蚕、白僵菌和绿僵菌的基因差异，利用Oligo 7软件设计特异性引物，由上海生工有限公司合成。

b.特异性引物的筛选

精密称取僵蚕粉末10mg，加入2×CTAB提取液500μL，65℃水浴1h后，12000r/min离心10min，取上清液。加入与上清液等体积的氯仿/Tris-饱和酚(1:1)混合液，12000r/min离心10min，取上清液，加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合液，再次离心，取上清液。加入3M醋酸钾溶液100μL，再加与上清液等体积的预冷异丙醇，混匀后置于-20℃下冷冻1h或4℃下冷藏过夜。12000r/min离心10min，弃上清液，加入70％乙醇500μL洗涤沉淀，再次离心，弃上清液，收集沉淀，室温干燥30min。加入25μL的TE溶液溶解，-20℃或4℃下保存，备用。

PCR反应体系：包括1×PCR缓冲液、2.0mmol/L MgCl₂、0.2mmol/L dNTPs、0.2μmol/L引物对、0.625U Taq DNA聚合酶、模板DNA 50ng、灭菌dd H₂O补足至25μL。扩增程序为95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸7min。扩增产物采用2.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测，制胶及电泳缓冲液为TBE，荧光染料为EB，直接加入胶内，上样量为8μL。根据各电泳条带的有无及亮度、分子量大小以筛选特异性引物。

结果如图1和图2所示，采用特异性引物PBM-1、PBM-2、PBB-1、PBB-2、PMA-1和PMA-2对其相应物种进行扩增，所有引物分析结果均产生了对应物种的条带，其分子量与预期扩增的目的片段长度相一致。其中，引物PBM-2对应的家蚕及僵蚕样品均有明显的扩增，且条带亮度均高于PBM-1，故优先选择引物PBM-2；引物PMA-2对应的绿僵菌物种的条带亮度低于引物PMA-1对应的绿僵菌物种的条带亮度，说明引物PMA-1的扩增效果优于引物PMA-2，故优先选择引物PMA-1；引物PBB-2对白僵菌物种只产生了微弱的条带，远不及PBB-1对应的白僵菌物种的条带亮度，说明扩增效果不及引物PBB-1，故筛除引物PBB-2，选择引物PBB-1。通过各扩增参数的优化有望用于僵蚕样品的真伪鉴定。

c.特异性引物PCR条件的优化

根据特异性引物的筛选结果，通过退火温度对筛选出的特异性引物PBM-2、PBB-1和PMA-1进行PCR条件的优化。如图3，PBM-2、PBB-1引物在退火温度为55℃时产生了非特异性扩增，当退火温度提高至56℃时可避免非特异性扩增的产生，且退火温度升高至65℃时，各引物的特异性依旧较好(结合退火温度可能对灵敏度产生的影响，后续实验中的退火温度均采用56℃)。上述结果表明，特异性引物PBM-2、PBB-1和PMA-1在扩增条件为95℃3min；95℃30s，56～65℃30s，72℃1min，35个循环；72℃7min时扩增效果较好，且在少量样品情况下可通过一次反应鉴定真伪及掺伪。

实施例2：僵蚕试剂盒引物于自制僵蚕样品的检测应用

参照15版药典，将10批由4～5龄的蚕蛾科昆虫家蚕的幼虫感染(或人工接种)白僵菌致死的干燥体粉碎，作为备用的僵蚕药材。将10批由4～5龄的蚕蛾科昆虫家蚕的幼虫感染(或人工接种)绿僵菌致死的干燥体粉碎，作为备用的僵蚕药材伪品。

将不同批次自制僵蚕样品粉碎，称取样品粉末10mg，通过CTAB法进行提取纯化制备供试品溶液，按照下述步骤进行：

(5)加入25μL～50μL的TE溶液溶解，-20℃或4℃下保存，备用。

此后，配制PCR反应体系，将其置于PCR仪中按优化的条件进行扩增。

PCR反应体系25μL，包括：1×PCR缓冲液、2.0mM MgCl₂、0.2mM dNTPs、0.1μM～0.4μM引物对、0.625U Taq DNA聚合酶、模板DNA 1ng～600ng，加灭菌双蒸水补足至25μL。

随后，将8μL扩增产物采用含EB的2.0％琼脂糖凝胶及TBE缓冲液进行分析，电泳结束后，通过凝胶成像系统检测，并根据电泳条带的有无以及分子量大小以判定僵蚕的真伪。

结果如图4和图5所示，10批自制僵蚕(家蚕+白僵菌)药材通过僵蚕试剂盒引物检测后，均与PBM-2引物和PBB-1引物反应，分别在61和69bp处产生条带，即样品与PBM-2引物和PBB-1引物反应呈阳性，故鉴定该10批僵蚕药材来源于家蚕和白僵菌；10批样品与PMA-1引物均未产生条带，结果呈阴性，故鉴定10批僵蚕药材不含绿僵菌；因此，鉴定10批自制样品全部为正品僵蚕。

如图6所示，10批自制僵蚕(家蚕+白僵菌)饮片通过僵蚕试剂盒引物检测后，与PBM-2引物和PBB-1引物反应，分别在61bp和69bp处产生条带，与PMA-1引物均未产生条带，故鉴定10批僵蚕药材不含绿僵菌；因此，鉴定10批自制样品全部为正品僵蚕，与预期结果一致。

如图7和图8所示，10批自制僵蚕(家蚕+白僵菌)药材均与PBM-1引物和PBB-2引物反应，分别在76和73bp处产生条带，与PMA-1引物均未产生条带，故鉴定10批僵蚕药材不含绿僵菌；因此，鉴定10批自制样品全部为正品僵蚕，与预期结果一致。

如图9和图10，10批僵蚕药材伪品(家蚕+绿僵菌)，由三种特异性引物(PBM-2、PBB-1和PMA-1)对相应物种进行引物扩增分析，结果显示，引物PBM-2和PMA-1对应的家蚕和绿僵菌物种均产生了明显的条带，呈阳性反应，其条带位置与预期扩增的目的片段长度相一致，而引物PBB-1没有对应条带产生，呈阴性反应，说明10批僵蚕药材伪品均来源于家蚕和绿僵菌两个物种而不是来源于白僵菌，与预期结果一致，上述结果表明这三种特异性引物能鉴定出伪品中的相应物种。

实施例3：本发明的特异性引物对实际市售僵蚕样品的检测

将不同批次市售僵蚕饮片粉碎，称取样品粉末10mg，按照实施例2的方法，通过CTAB法进行提取纯化。此后，配制PCR反应体系，将其置于PCR仪中按上述优化的条件进行扩增。随后，将8μL扩增产物采用含EB的2.0％琼脂糖凝胶及TBE缓冲液进行分析，电泳结束后，通过凝胶成像系统检测，并根据电泳条带的有无以及分子量大小以判定僵蚕的真伪。此外，家蚕、白僵菌及绿僵菌的阳性对照物质通过分别称取样品粉末10mg，通过CTAB法进行提取纯化及质量检查后，冻干制备DNA阳性对照物质，并注明其中DNA的质量。

结果如图11所示，15批市售僵蚕饮片通过僵蚕试剂盒引物检测后，均与PBM-2引物和PBB-1引物反应，分别在61和69bp处产生条带，即样品与PBM-2引物和PBB-1引物反应呈阳性，故鉴定该15批僵蚕样品全部来源于家蚕和白僵菌；但是其中，有1批僵蚕样品(S₁₁，四川150510)与PMA-1引物反应，在69bp处产生条带，呈阳性，故鉴定该批次样品还同时来源于绿僵菌；因此，鉴定结果说明该批次僵蚕样品中掺杂了绿僵菌，而其余批次中不含绿僵菌，故鉴定14批市售僵蚕饮片为正品，而1批市售僵蚕饮片属掺伪品。

实施例4：现有公开分子鉴定方法与本发明试剂盒的比较

现有的DNA条形码技术利用相应的通用引物分别扩增家蚕COI序列和真菌白僵菌ITS序列，对扩增产物进行测序获得COI序列和ITS序列，通过对序列进行分析，鉴定动物家蚕和真菌白僵菌。

采用家蚕COI序列和真菌白僵菌ITS序列鉴定僵蚕真伪，相较本发明试剂盒，存在以下几点不足：(1)家蚕COI序列和真菌白僵菌ITS序列，能对动物家蚕和真菌白僵菌进行鉴定，却无法鉴定僵蚕的掺伪品，而本发明试剂盒能在相同的扩增条件下采用不同的特异性引物对掺伪品实现快速准确的鉴定；(2)现有的发明中，仅解决了僵蚕药材的真伪鉴别，未能解决僵蚕饮片的真伪鉴定问题，而本发明试剂盒能同时解决僵蚕药材和饮片的真伪鉴定问题；(3)家蚕COI序列和真菌白僵菌ITS序列的扩增条件不一，需要分别进行，步骤较为繁琐；(4)二者的扩增结果均需测序及比对分析，费时且不够直观；

综上所述，本发明中的检测方法操作简单、专属性强、鉴别快速、无需测序，比DNA条形码研究技术更为直观、经济、快速，且具有适用范围广、抗干扰能力强、可识别掺伪品等特点，为僵蚕产品真伪的快速鉴定提供了一种新的方案，有助于监控僵蚕药材的质量，从而有利于保障临床用药的安全性、有效性，具有重要的应用价值。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一组鉴定僵蚕的特异性引物及其鉴定方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 1

taccagcttg aatacgctct 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 2

tttgaggcga gtttaattcc c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 3

acaggatgaa cagtttaccc c 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 4

ctacggatct tcctctatgt gc 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 白僵菌(Beauveria bassiana)

<400> 5

aagagatcgt cggttatcca t 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 白僵菌(Beauveria bassiana)

<400> 6

taagcagcat ttcagctacc ca 22

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 白僵菌(Beauveria bassiana)

<400> 7

ctttggcaat actagtgaaa acga 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 白僵菌(Beauveria bassiana)

<400> 8

gcgattatat ggataaccga cgat 24

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 绿僵菌(Metarhizium anisopliae)

<400> 9

tcctgcctag tctaagcgga t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 绿僵菌(Metarhizium anisopliae)

<400> 10

gcaccaatat ctttcgggca t 21

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 绿僵菌(Metarhizium anisopliae)

<400> 11

tgatttccac tcagcgtgt 19

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 绿僵菌(Metarhizium anisopliae)

<400> 12

ctgataacgc agcaattata cgg 23

Claims

1.一组鉴定僵蚕的特异性引物，所述引物为PBM-1或PBM-2和PBB-1或PBB-2；PBM-1上下游引物如SEQ.ID.NO.1和2所示，BM-2上下游引物如SEQ.ID.NO.3和4所示；PBB-1上下游引物如SEQ.ID.NO.5和6所示，PBB-2上下游引物如SEQ.ID.NO.7和8所示。

2.根据权利要求1所述的鉴定僵蚕的特异性引物，所述引物还包括引物PMA-1或PMA-2；PMA-1上下游引物如SEQ.ID.NO.9和10所示；PMA-2上下游引物如SEQ.ID.NO.11和12所示。

3.权利要求1或2所述的引物在鉴定僵蚕真伪或掺伪中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为首先鉴定僵蚕是否来源于家蚕和白僵菌，其次权利要求1所述引物结合权利要求2所述引物鉴定其中是否掺杂绿僵菌。

5.一种特异性鉴定僵蚕的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对、DNA阳性对照、PCR反应体系、电泳鉴定体系。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求2所述的引物对。

7.一种特异性鉴定僵蚕的方法，其特征在于，采用权利要求5或6中所述的试剂盒进行，按照下述步骤进行：

(1)采用CTAB法提取僵蚕样品的DNA；

(2)将僵蚕样品的DNA模板与特异性引物进行PCR扩增；

(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析和凝胶成像系统检测条带。

8.根据权利要求7所述的一种特异性鉴定僵蚕的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的PCR扩增，其反应体系1×PCR缓冲液、2.0mmol/L MgCl₂、0.2mmol/L dNTPs、0.1μmol/L～0.4μmol/L引物对、0.625U Taq DNA聚合酶、模板DNA 1ng～600ng，以灭菌dd H₂O补足至25μL。

9.根据权利要求7所述的一种特异性鉴定僵蚕的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃～65℃退火30s，72℃延伸1min，循环数30～40；72℃延伸7min。