CN112730291A - 一种僵蚕伪品的定性定量标志物及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种僵蚕伪品的定性定量标志物及其检测方法，所述的标志物为硼砂或硼酸。本发明通过乙基己二醇‑正丁醇溶液对这种僵蚕伪品中的硼砂进行快速的富集、微波萃取，硼砂在酸性条件下转化成硼酸，硼酸可以与被硫酸质子化的姜黄素发生显色反应，通过比色法可以定性定量的测定僵蚕伪品中硼砂的含量。本方法僵蚕通过伪品中硼砂的定性定量检测，从而可以鉴定出僵蚕的真伪，其在僵蚕品种真伪鉴定应用方面有极大的应用前景和社会价值。本发明选择毒性较低的正丁醇为萃取溶剂，操作安全，适合大规模推广应用，具有快速、低毒、稳定、定性定量的检测僵蚕伪品中硼砂的特点，对于中药材僵蚕的质量标准化和规范化以及临床用药安全提供了技术支持。
Description
技术领域
本发明属于中药材真伪鉴别技术领域，涉及一种僵蚕伪品的定性定量标志物及其检测方法。
背景技术
2020版中国药典记载僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyxmori Linnaeus 4～5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌Beauveria bassiana (Bals.) Vuillant而致死的干燥，每年约有2000吨僵蚕用于临床用于治疗疾病，为临床常用动物类中药。近年来市场上充斥了大量的死蚕包裹上白僵菌的孢子粉代替僵蚕，现有的药典标准从性状上很难区分出伪品，浸出物检测项正品与伪品僵蚕皆是合格。本发明僵蚕通过伪品中硼砂的定性定量检测，从而可以鉴定出僵蚕的真伪，其在僵蚕品种真伪鉴定应用方面有极大的应用前景和社会价值。
硼砂在胃酸作用下可转变为硼酸，故一次摄入过多会导致急性中毒，长期过量摄入也会产生慢性健康损害。我国在2008年将硼酸与硼砂列入《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单》，硼酸与硼砂属于禁用的食品添加剂。采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICPAES）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）检测硼砂的方法，样品处理比较复杂，且对仪器的要求比较高，耗费的时间较长、费用较高，不适于大规模的基层快速检测僵蚕伪品；国家食品检测硼砂的标准（GB 5009.275-2016）中的硼砂姜黄比色法，采用的萃取溶剂是毒性较大的三氯甲烷，其在光的作用下，能被空气中的氧氧化成氯化氢和有剧毒的光气，且属于易制毒的管制类物品，不适应于现场监测以及大规模的推广。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种僵蚕伪品的定性定量标志物及其检测方法。本发明可为中药僵蚕的质量标准化和规范化以及临床用药安全提供技术支持。本发明通过大量实验筛选，选择毒性较低的乙基己二醇-正丁醇作为萃取溶剂，通过比色法测定僵蚕伪品中硼砂的含量，其具有快速、低毒、稳定、定性定量的检测僵蚕伪品中硼砂的特点，其在僵蚕品种真伪鉴定应用方面有极大的应用前景和社会价值。
技术方案，为实现以上目的，本发明采用的技术步骤如下：
一种僵蚕伪品的定性定量标志物，所述的标志物为硼砂或硼酸。
一种僵蚕伪品的定性定量检测方法，包括以下步骤：
（1）配置萃取溶液：
2-乙基-1，3-己二醇-正丁醇溶液：取2-乙基-1，3-己二醇，加正丁醇稀释；
稀硫酸溶液：取等体积的硫酸和水混溶；
亚铁氰化钾溶液：称取亚铁氰化钾，用水溶解；
乙酸锌溶液：称取乙酸锌，先加冰乙酸溶解，用水稀释；
（2）配置反应溶液：
姜黄-冰乙酸溶液：称取姜黄色素溶于冰乙酸中；
（3）配置硼酸标准溶液和制备标准曲线：
硼酸标准储备液：准确称取干燥的硼酸，溶于水并定容；
硼酸标准溶液：取硼酸标准储备液，加水定容，得到一定浓度的硼酸标准溶液；
准确吸取不同体积的硼酸标准溶液，各加水稀释至相同体积，加稀硫酸溶液，振荡混匀，然后加己二醇-正丁醇溶液，振摇，静置分层，吸取上层的己二醇-正丁醇溶液，滤纸过滤待用；分别取过滤液，各加入姜黄-冰乙酸溶液，硫酸，涡旋，静置，加无水乙醇，静置，于紫外分光光度计550 nm处1 cm比色皿测定吸光度；以硼酸含量μg为横坐标，以测定的吸光度为纵坐标绘制硼酸的标准曲线。
（4）中药僵蚕伪品的制备：取经硼砂泡制的死蚕，经自然风干、烘干、粉碎、过筛，得到中药僵蚕伪品粉末；
（5）僵蚕伪品中硼砂的测定：将僵蚕伪品粉末先在硫酸中超声溶解混合，再加入步骤（1）亚铁氰化钾溶液与乙酸锌溶液作为试样溶液，然后加入2-乙基-1，3-己二醇-正丁醇溶液萃取，取2-乙基-1，3-己二醇-正丁醇的萃取溶液，加入步骤（2）制备得到的姜黄-冰乙酸溶液进行显色反应，然后于紫外分光光度计550 nm处测定吸光度，然后根据步骤（3）的标准曲线定性定量测定僵蚕伪品中硼砂的含量。
作为优选方案，以上所述的一种僵蚕伪品的定性定量检测方法，步骤（1）配置萃取溶液为：
2-乙基-1，3-己二醇-正丁醇溶液：取2-乙基-1，3-己二醇10 mL，加正丁醇稀释至100 mL，稀释液保存于塑料容器中；
稀硫酸溶液：取等体积的硫酸和水混溶；
亚铁氰化钾溶液：称取10.3 g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至100 mL；
乙酸锌溶液：称取2.5 g乙酸锌，先加5 mL冰乙酸溶解，用水稀释至100mL；
步骤（2）配置反应溶液：
姜黄-冰乙酸溶液：称取姜黄色素0.15 g溶于100 mL冰乙酸中，此溶液保存于塑料容器中；
步骤（3）配置硼酸标准溶液和制备标准曲线：
硼酸标准储备液：准确称取干燥10 h以上的硼酸0.1 g，溶于水并定容至200 mL，保存于塑料容器中；
硼酸标准溶液：取硼酸标准储备液1 mL，加水定容至100 mL，保存于塑料容器中，得到浓度为5 μg/mL的硼酸标准溶液；
准确吸取浓度为5 μg/mL硼酸标准溶液0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00mL、5.00 mL于20 mL塑料试管中，分别加水稀释至5 mL；加稀硫酸溶液1 mL，振荡混匀，加己二醇-正丁醇溶液溶液5.00 mL，振摇1 min，静置分层，吸取上层的己二醇-正丁醇溶液，滤纸过滤待用；
分别取己二醇-正丁醇过滤液1.00 mL于20 mL塑料试管中，各加入姜黄-冰乙酸溶液1.0 mL，硫酸0.5 mL，涡旋1 min，静置20 min，加无水乙醇10 mL，静置10 min，于紫外分光光度计550 nm处1 cm比色皿测定吸光度；以硼酸含量μg为横坐标，以测定的吸光度为纵坐标绘制硼酸的标准曲线；得回归方程为y=0.07734X+0.1465×104，R 2 = 0.9896，线性范围0.234～0.531，如图1。
硼酸分析检测的方法学考察
1、精密度、重复性和稳定性试验
精密度试验：取硼酸对照品溶液，在上述标准曲线相同条件下重复进样6次，以其吸光度的相对标准偏差（RSD）来计算其精密度。结果显示硼酸的吸光度RSD为3.9%，表明该方法精密度良好。
重复性试验：按照僵蚕伪品供试液制备方法，取僵蚕伪品供试液平行6组，经检测分析，计算其含量及RSD。结果硼酸含量的RSD为2.6%，表明该方法重复性良好。
稳定性试验：取重复性试验中的一份僵蚕伪品供试液，分别于0、4、8、12、24 h时测定其吸光度，计算硼酸含量，结果峰面积RSD为2.7%，表明僵蚕伪品溶液在24 h内稳定性良好。
2、加样回收率试验
取已知含量的僵蚕伪品0.5 g，分别按已知含量的80%、100%、120%，3个水平加入硼酸对照品，制备僵蚕伪品溶液，550 nm处测定吸光度，计算加样回收率。结果显示硼酸的平均回收率为97.31%，RSD为3.7%，表明本方法准确性较好。
3、检测限与定量限
本方法的检出限为2.00 mg/kg，定量限为6.00 mg/kg。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）工业硼砂泡制的死蚕包裹上白僵菌的孢子粉代替僵蚕，现有的药典标准难以区分出伪品，本发明通过对僵蚕伪品中硼砂的定性定量检测，从而可以鉴定出僵蚕的真伪，本发明提供的检测方法经过方法学考察，结果精密度、稳定性、重复性和准确性好，可以申请作为中国药典中僵蚕的一项补充检测方法。
（2）国家食品检测硼砂的标准（GB 5009.275-2016）中的硼砂姜黄比色法，采用的萃取溶剂是毒性较大的三氯甲烷，其在光的作用下，能被空气中的氧氧化成氯化氢和有剧毒的光气，且属于易制毒的管制类物品，不适应于现场监测以及大规模的推广。本发明选择毒性较低的正丁醇作为萃取溶剂，僵蚕伪品中的硼酸（硼砂）在稀硫酸溶液中被迅速萃取出来，且因导向分离与溶解于正丁醇中的乙基己二醇生成络合物，并被浓硫酸质子化再与姜黄素生成稳定的络合产物，通过本方法可以定性定量的测定僵蚕伪品中硼砂的含量。本方法具有快速、低毒、稳定、定性定量的检测僵蚕伪品中硼砂的特点，适合大规模推广应用，不仅有着一定的经济价值，更具备良好的社会价值。
附图说明
图1为硼酸标准曲线图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
下述实施例所采用的6批僵蚕伪品：W1~W3采集自亳州中药材市场、W4~W6采集自广西玉林中药材市场；6批正品僵蚕：Z1~Z2采集自广西河池、Z3~Z4采集自四川延边、Z5~Z6采集自云南楚雄。
实施例1
一种僵蚕伪品的定性定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）按下列重量配置萃取、反应溶液：
2-乙基-1，3-己二醇-正丁醇溶液：取2-乙基-1，3-己二醇10 mL，加正丁醇稀释至100 mL，稀释液保存于塑料容器中；
稀硫酸溶液：取等体积的硫酸和水，将硫酸沿烧杯壁缓慢注入水中，并用玻璃棒不断搅拌，使热量及时散失。
亚铁氰化钾溶液：称取10.3 g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至100 mL。
乙酸锌溶液：称取2.5 g乙酸锌，先加5 mL冰乙酸溶解，用水稀释至100mL。
步骤（2）按下列重量配置反应溶液：
姜黄-冰乙酸溶液：称取姜黄色素0.15 g溶于100 mL冰乙酸中，此溶液保存于塑料容器中。
步骤（3）中药僵蚕伪品供试液的制备方法：
取经硼砂泡制的死蚕，经自然风干、烘干至水分8%、粉碎、过60目筛后所得的粉末。精确称取僵蚕伪品W1~W6于（W1 0.51 g；W2 0.60 g; W3 0.55 g；W4 0.62 g; W5 0.53 g；W60.57 g;）150 mL塑料烧杯中，加20 mL水混匀，缓慢滴加1 mL硫酸，超声10 min促进溶解混合。加乙酸锌溶液5 mL，亚铁氰化钾溶液5 mL，加水定容至50 mL，过滤后作为制备的试样溶液。根据样品含量取1.00 mL滤液，加水至5 mL。加稀硫酸溶液1 mL，振荡混匀，加2-乙基-1，3-己二醇-正丁醇溶液5.00 mL，涡旋振荡器振摇2 min，静置分层，吸取上层的2-乙基-1，3-己二醇-正丁醇溶液并通过ϕ7 cm干燥快速滤纸过滤，过滤液作为样品测试液。
步骤（4）中药僵蚕伪品供试液的硼酸测定方法：
各取1.00 mL过滤液于20 mL塑料试管中，各加入姜黄-冰乙酸溶液1.00 mL，硫酸0.5 mL，涡旋1 min，静置20 min，加无水乙醇50 mL，静置10 min，于紫外分光光度计550 nm处1 cm比色皿测定吸光度，根据上述回归方程：y=0.07734X+0.1465×104，R 2 = 0.9896，计算各批次僵蚕伪品中硼酸含量（W1 9.68 mg/g；W2 13.36 mg/g; W3 10.87 mg/g；W4 12.55mg/g; W5 8.43 mg/g；W6 11.21 mg/g;）。
实施例2
一种僵蚕正品的定性定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）按下列重量配置萃取、反应溶液：
2-乙基-1，3-己二醇-正丁醇溶液：取2-乙基-1，3-己二醇10 mL，加正丁醇稀释至100 mL，稀释液保存于塑料容器中；
稀硫酸溶液：取等体积的硫酸和水，将硫酸沿烧杯壁缓慢注入水中，并用玻璃棒不断搅拌，使热量及时散失。
亚铁氰化钾溶液：称取10.3 g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至100 mL。
乙酸锌溶液：称取2.5 g乙酸锌，先加5 mL冰乙酸溶解，用水稀释至100mL。
步骤（2）按下列重量配置反应溶液：
姜黄-冰乙酸溶液：称取姜黄色素0.15 g溶于100 mL冰乙酸中，此溶液保存于塑料容器中。
步骤（3）中药僵蚕正品供试液的制备方法：
取购买的僵蚕正品，经自然风干、烘干至水分8%、粉碎、过60目筛后所得的粉末。精确称取僵蚕Z1~Z6于（Z1 0.59 g；Z2 0.51 g; Z3 0.51 g；Z4 0.56 g; Z5 0.53 g；Z6 0.57g;）150 mL塑料烧杯中，加20 mL水混匀，缓慢滴加1 mL硫酸，超声10 min促进溶解混合。加乙酸锌溶液5 mL，亚铁氰化钾溶液5 mL，加水定容至50 mL，过滤后作为制备的试样溶液。根据样品含量取1.00 mL滤液，加水至5 mL。加稀硫酸溶液1 mL，振荡混匀，加2-乙基-1，3-己二醇-正丁醇溶液5.00 mL，涡旋振荡器振摇2 min，静置分层，吸取上层的2-乙基-1，3-己二醇-正丁醇溶液并通过ϕ7 cm干燥快速滤纸过滤。过滤液作为样品测试液。
步骤（4）中药僵蚕供试液的硼酸测定方法：
各取1.00 mL僵蚕Z1~Z6过滤液、空白过滤液三组K1~K3于20 mL塑料试管中，各加入姜黄-冰乙酸溶液1.00 mL，硫酸0.5 mL，涡旋1 min，静置20 min，加无水乙醇50 mL，静置10min，于紫外分光光度计550 nm处1 cm比色皿测定吸光度（Z1 0.028；Z2 0.056；Z3 0.041；Z40.051；Z5 0.043；Z6 0.031；K1 0.033；K2 0.054；K3 0.041），正品僵蚕与空白组吸光度均不在检测范围无显著性差异，硼酸含量未检出，说明此方法稳定有效适用于僵蚕伪品中硼砂的定性定量检测，可以作为僵蚕品种真伪鉴定的一种方法。
Claims (4)
1.一种僵蚕伪品的定性定量标志物，其特征在于，所述的标志物为硼砂或硼酸。
2.一种僵蚕伪品的定性定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）配置萃取溶液：
2-乙基-1，3-己二醇-正丁醇溶液：取2-乙基-1，3-己二醇，加正丁醇稀释；
稀硫酸溶液：取等体积的硫酸和水混溶；
亚铁氰化钾溶液：称取亚铁氰化钾，用水溶解；
乙酸锌溶液：称取乙酸锌，先加冰乙酸溶解，用水稀释；
（2）配置反应溶液：
姜黄-冰乙酸溶液：称取姜黄色素溶于冰乙酸中；
（3）配置硼酸标准溶液和制备标准曲线：
硼酸标准储备液：准确称取干燥的硼酸，溶于水并定容；
硼酸标准溶液：取硼酸标准储备液，加水定容，得到一定浓度的硼酸标准溶液；
准确吸取不同体积的硼酸标准溶液，各加水稀释至相同体积，加稀硫酸溶液，振荡混匀，然后加己二醇-正丁醇溶液，振摇，静置分层，吸取上层的己二醇-正丁醇溶液，滤纸过滤待用；分别取过滤液，各加入姜黄-冰乙酸溶液，硫酸，涡旋，静置，加无水乙醇，静置，于紫外分光光度计550 nm处1 cm比色皿测定吸光度；以硼酸含量μg为横坐标，以测定的吸光度为纵坐标绘制硼酸的标准曲线。
3.（4）中药僵蚕伪品的制备：取经硼砂泡制的死蚕，经自然风干、烘干、粉碎、过筛，得到中药僵蚕伪品粉末；
（5）僵蚕伪品中硼砂的测定：将僵蚕伪品粉末先在硫酸中超声溶解混合，再加入步骤（1）亚铁氰化钾溶液与乙酸锌溶液作为试样溶液，然后加入2-乙基-1，3-己二醇-正丁醇溶液萃取，取2-乙基-1，3-己二醇-正丁醇的萃取溶液，加入步骤（2）制备得到的姜黄-冰乙酸溶液进行显色反应，然后于紫外分光光度计550 nm处测定吸光度，然后根据步骤（3）的标准曲线定性定量测定僵蚕伪品中硼砂的含量。
4.根据权利要求1所述的一种僵蚕伪品的定性定量检测方法，其特征在于，步骤（1）配置萃取溶液：
2-乙基-1，3-己二醇-正丁醇溶液：取2-乙基-1，3-己二醇10 mL，加正丁醇稀释至100mL，稀释液保存于塑料容器中；
稀硫酸溶液：取等体积的硫酸和水混溶；
亚铁氰化钾溶液：称取10.3 g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至100 mL；
乙酸锌溶液：称取2.5 g乙酸锌，先加5 mL冰乙酸溶解，用水稀释至100mL；
（2）配置反应溶液：
姜黄-冰乙酸溶液：称取姜黄色素0.15 g溶于100 mL冰乙酸中，此溶液保存于塑料容器中；
（3）配置硼酸标准溶液和制备标准曲线：
硼酸标准储备液：准确称取干燥10 h以上的硼酸0.1 g，溶于水并定容至200 mL，保存于塑料容器中；
硼酸标准溶液：取硼酸标准储备液1 mL，加水定容至100 mL，保存于塑料容器中，得到浓度为5 μg/mL的硼酸标准溶液；
准确吸取浓度为5 μg/mL硼酸标准溶液0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL于20 mL塑料试管中，分别加水稀释至5 mL；加稀硫酸溶液1 mL，振荡混匀，加己二醇-正丁醇溶液溶液5.00 mL，振摇1 min，静置分层，吸取上层的己二醇-正丁醇溶液，滤纸过滤待用；
分别取己二醇-正丁醇过滤液1.00 mL于20 mL塑料试管中，各加入姜黄-冰乙酸溶液1.0 mL，硫酸0.5 mL，涡旋1 min，静置20 min，加无水乙醇10 mL，静置10 min，于紫外分光光度计550 nm处1 cm比色皿测定吸光度；以硼酸含量μg为横坐标，以测定的吸光度为纵坐标绘制硼酸的标准曲线；得回归方程为y=0.07734X+0.1465×104，R 2 = 0.9896，线性范围0.234～0.531。
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