CN105675566A - 定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布的方法，该方法是一种基于荧光标记技术来定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布规律的方法，属于环境健康风险评价领域。其步骤为：合成具有荧光标记的微塑料；选取模式动物进行灌胃实验；解剖模式动物采集肝脏，肾脏和小肠组织等主要器官；冷冻干燥组织；取一定质量的冻干组织，采取湿发消解；配置不同浓度梯度的荧光微塑料悬浊溶液，根据荧光光谱仪测定的荧光值得到标准曲线；分别测定各个组织样品消解液的荧光值，依据标准曲线得到单位组织样品中微塑料含量；最终确定进入组织的微塑料含量。通过本方法可以准确定量微塑料在哺乳动物组织器官中的富集和分布。
Description
技术领域
本发明设计一种微塑料健康风险评价方法，更具体来说就是一种基于荧光标记技术定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布规律的方法，即一种基于现代荧光技术分析微塑料这种新兴污染物在哺乳动物体内富集和分布的新型检测方法。
背景技术
众所周知，塑料这种材料在当今生活中的重要作用。各种塑料制品在给人们生活带来各种便利的同时，也带来了各种潜在健康风险，其中最突出就是塑料制品在被丢弃后经过一定的物理、化学、生物等作用，会变成颗粒越来越小的塑料颗粒——微塑料。但是这种塑料颗粒不会被自然环境降解，而是一直存留在环境中，甚至会进入生物体内，带来环境健康风险。在评价微塑料的健康风险过程中，急需准确、灵敏、方便快捷的方法来检测微塑料在生物体内的富集和分布规律，这是准确评估微塑料健康危害的基本前提。
目前的研究多集中在证明微塑料是否能进入生物体内，其方法可总结为：水生动物进行一定量的微塑料暴露，然后采用高倍显微镜或者偏振光检测仪器检测生物体内是否具有微塑料。然而，这些研究主要针对水生生物，对哺乳动物体内微塑料含量缺乏有效的检测方法，且这些方法通常只能定性分析，不能进行准确的定量，也无法得到微塑料在不同组织器官的富集和分布规律。
因此，急需一种简单、灵敏、准确定量分析微塑料在哺乳动物生物体内富集和分布规律的方法。本发明整合材料合成技术和荧光检测技术，可以有效的采用荧光微塑料对模式动物进行暴露实验，准确进行生物体内微塑料含量的检测，为微塑料健康风险评价奠定基础。
发明内容
针对现在普遍缺乏对哺乳动物体内微塑料含量准确定量的方法，本发明提供一种基于荧光技术分析体内微塑料含量的方法，即基于荧光微塑料的制备和荧光检测方法结合的生物学检测方法，通过本发明可以对不同粒径的微塑料在生物体内分布及其富集规律进行准确的定量分析，为后续的微塑料毒性评价提供基础数据。
具体来说，本发明采用了以下技术方案：
一种定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)荧光微塑料颗粒的制备：首先配制10-20mL的三氯甲烷与异丙醇1：1体积比的混合溶剂，然后称取0.1-0.2g交联聚苯乙烯微球和5-10mg的4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑加入上述混合溶剂中，并在超声和氮气保护条件下分散溶解，充分溶解后的混合液体进行干燥，然后用于50-70%乙醇洗涤以去除多余荧光染料，接着离心回收荧光微塑料，制备出带绿色荧光的PS微球；
(2)哺乳动物暴露实验：选择上述合成的荧光标记微塑料作为受试样品，选取模式哺乳动物进行灌胃染毒实验，以健康哺乳动物作为空白对照组；
(3)样品采集：荧光微塑料染毒周期结束以后，受试动物解剖，采集组织样品；
(4)冷冻干燥组织样品：使用冷冻干燥仪，分别冷冻干燥空白组和染毒组的组织样品至恒重；
(5)湿法消解样品：称取一定量的冻干组织样品，采用湿法消解组织样品；
(6)荧光定量检测微塑料含量：采用空白组动物的组织消解液，加入已知含量的荧光微塑料，制备不同浓度梯度的悬浊液，在设定的最大激发波长和最大发射波长下，用荧光光谱仪检测其荧光值，以荧光强度和对应的微塑料浓度绘制出标准曲线，然后检测暴露组组织消解液的荧光值，根据标准曲线确定组织液微塑料浓度，并换算出各组织中微塑料含量。
其中，在步骤（1）中，超声分散条件为在100W超声下处理15-20分钟，干燥条件为真空干燥箱中在0.15Mpa、32℃-35℃下干燥12-16小时，以50-70%乙醇洗涤并随后在6000rpm/min下离心10-20分钟，洗涤和离心重复3-5次，以回收制备出的绿色荧光PS微球。
在步骤(2)中，模式哺乳动物为大鼠或小鼠，染毒实验的染毒周期为一周。
另外，在步骤(3)中，所采集的组织样品为肝脏、肾脏、小肠或其组合。
进一步，在步骤（4）中，冻干条件为在-10大气压和-50℃条件下冷冻干燥组织样品至恒重。
其中，在步骤(5)中，称取一定量的冻干组织样品，采用湿法消解组织样品，具体消解条件为每0.1克组织样品中加入1毫升的65%V/V硝酸，70℃水浴2小时，然后加入与硝酸等体积的30%V/V双氧水，85℃水浴2小时，消解结束后，消解液呈现淡黄透明，定容到10毫升。
在步骤(6)中，设定的最大激发波长为445nm，最大发射波长为550nm。
有益效果
本发明基于荧光微塑料合成技术和荧光微塑料检测技术，提供一种基于荧光标记技术定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布规律的方法，填补了当今尚无便捷、准确定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布检测方法的空缺，为后续微塑料的环境健康风险甚至是人体健康风险评价提供准确的基础数据。
附图说明
图1为本发明方法的流程图；
图2为本发明的荧光微塑料在荧光显微镜以及扫描电镜下的照片；
图3至图8为本发明的荧光定量检测的标准曲线；
图9为本发明的暴露组哺乳动物各组织器官中微塑料的含量。
具体实施方式
本发明是一种基于荧光标记技术定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布规律的方法，其具体步骤如下：
(1)荧光微塑料制备：首先，配置三氯甲烷和异丙醇的混合溶剂10-20mL（1:1），然后称取0.1-0.2g的交联聚苯乙烯（PS）微球和5-10mg的荧光染料4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑（NBD-CL）加入上述混合溶剂中，并在超声（15-20min,100W）和氮气保护条件下分散溶解。充分溶解后的混合液体置于真空干燥箱中(32oC-35oC,0.15Mpa)干燥12-16h，待溶液干燥后，用50%-70%乙醇洗涤聚苯乙烯微球去除多余荧光染料，接着使用离心机（10-20min,6000rpm/min）离心出荧光微塑料（洗涤和离心过程重复3-5次）。此方法可以制备出带绿色荧光PS微球。
(2)哺乳动物暴露实验：以制备的已知粒径的荧光微塑料为受试样品，选取模式动物（如小鼠、大鼠等模式哺乳动物）进行灌胃暴露实验（空白组模式动物不进行暴露实验），每个实验组10只模式动物，染毒时间一周，以健康哺乳动物作为空白对照组；
(3)样品采集：暴露周期结束后，解剖模式动物，采集肝脏、肾脏和小肠等组织器官，并记录相应的质量，然后转移到超低温冰箱；
(4)冷冻干燥组织样品：从超低温冰箱中转移出组织至冷冻干燥仪(LABCONCO，USA)，在-10大气压和-50℃条件下冷冻干燥组织样品至恒重；
(5)湿法消解组织样品：分别称取经冷冻干燥的动物组织样品0.1克，加入1毫升硝酸（65%，V/V），70℃水浴2小时，加入1毫升的双氧水（30%，V/V），85℃水浴2小时，消解结束后消解液呈现淡黄透明状态，定容到10毫升。
(6)荧光定量检测微塑料含量：采用空白组的组织消解液，加入已知含量的荧光微塑料（0，0.001，0.01，0.1，0.55，1毫克），制备不同浓度梯度的悬浊液，用荧光光谱仪检测其荧光值（设定最大激发波长和最大发射波长），以荧光强度和对应的微塑料浓度绘制出标准曲线。然后检测暴露组组织消解液的荧光值，根据标准曲线确定组织液微塑料浓度，并换算出各组织中微塑料含量。
以下通过具体实例进一步说明本发明：
实例1:
基于荧光标记技术定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布规律的方法，定量分析粒径为5微米和20微米的荧光微塑料在小鼠体内的富集和分布规律，分析流程如图1所示，具体步骤如下：
(1)荧光微塑料制备实验：首先，配置三氯甲烷和异丙醇的混合溶剂20mL（1:1），然后称取0.2g的交联聚苯乙烯（PS）微球和10mg的荧光染料4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑（NBD-CL）加入上述混合溶剂中，并在超声（20min,100W）和氮气保护条件下分散溶解。充分溶解后的混合液体置于真空干燥箱中(35oC,0.15Mpa)干燥12h，待溶液干燥后，用70%乙醇洗涤聚苯乙烯微球去除多余荧光染料，接着使用离心机（15min,6000rpm/min）离心出荧光微塑料制备出带绿色荧光的PS微球，粒径分别为5微米和20微米。
(2)荧光微塑料暴露实验：以制备的5微米和20微米粒径的荧光微塑料为受试样品，选取雄性昆明种小鼠(Musmusculus)，7周龄，体重16-32g，随机分为暴露组和空白组，每组10只，采取灌胃的暴露方式（空白组不灌胃），暴露剂量为0.1mg微塑料/天，暴露周期为30天。
(3)组织样品采集：暴露周期结束后，解剖小鼠，并采集肝脏、肾脏和小肠组织器官，并记录相应的质量，然后转移到超低温冰箱；
(4)冷冻干燥组织样品：从超低温冰箱中转移出组织至冷冻干燥仪(LABCONCO，USA)，在-10大气压和-50℃条件下冷冻干燥小鼠肝脏、肾脏、小肠样品至恒重；
(5)湿法消解组织样品：分别称取经冷冻干燥的动物组织样品0.1克，加入1毫升硝酸（65%，V/V），70℃水浴2小时，加入1毫升的双氧水（30%，V/V），85℃水浴2小时，消解结束后消解液呈现淡黄透明状态，定容到10毫升。
荧光定量检测微塑料含量：采用空白组的组织消解液，加入已知含量的荧光微塑料（0，0.001，0.01，0.1，0.55，1毫克），制备不同浓度梯度的悬浊液，用荧光光谱仪检测其荧光值（设定最大激发波长445nm和最大发射波长550nm），以荧光强度和对应的微塑料浓度绘制出标准曲线。然后检测暴露组组织消解液的荧光值，根据标准曲线确定组织液微塑料浓度，并换算出各组织中微塑料含量。
综上所述，本发明能够准确定量微塑料在哺乳动物体内的富集和分布，解决当前相关检测方法的不足，填补了技术空缺，为准确评价微塑料的健康风险提供技术支撑。
上面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (7)
1.一种定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)荧光微塑料颗粒的制备：首先配制10-20mL的三氯甲烷与异丙醇1：1体积比的混合溶剂，然后称取0.1-0.2g交联聚苯乙烯微球和5-10mg的4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑加入上述混合溶剂中，并在超声和氮气保护条件下分散溶解，充分溶解后的混合液体进行干燥，然后用于50-70%乙醇洗涤以去除多余荧光染料，接着离心回收荧光微塑料，制备出带绿色荧光的PS微球；
(2)哺乳动物暴露实验：选择上述合成的荧光标记微塑料作为受试样品，选取模式哺乳动物进行灌胃染毒实验，以健康哺乳动物作为空白对照组；
(3)样品采集：荧光微塑料染毒周期结束以后，受试动物解剖，采集组织样品；
(4)冷冻干燥组织样品：使用冷冻干燥仪，分别冷冻干燥空白组和染毒组的组织样品至恒重；
(5)湿法消解样品：称取一定量的冻干组织样品，采用湿法消解组织样品；
(6)荧光定量检测微塑料含量：采用空白组动物的组织消解液，加入已知含量的荧光微塑料，制备不同浓度梯度的悬浊液，在设定的最大激发波长和最大发射波长下，用荧光光谱仪检测其荧光值，以荧光强度和对应的微塑料浓度绘制出标准曲线，然后检测暴露组组织消解液的荧光值，根据标准曲线确定组织液微塑料浓度，并换算出各组织中微塑料含量。
2.如权利要求1所述的定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布的方法，其特征在于，在步骤（1）中，超声分散条件为在100W超声下处理15-20分钟，干燥条件为真空干燥箱中在0.15Mpa、32℃-35℃下干燥12-16小时，以50-70%乙醇洗涤并随后在6000rpm/min下离心10-20分钟，洗涤和离心重复3-5次，以回收制备出的绿色荧光PS微球。
3.如权利要求1所述的定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布的方法，其特征在于，在步骤(2)中，模式哺乳动物为大鼠或小鼠，染毒实验的染毒周期为一周。
4.如权利要求1所述的定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所采集的组织样品为肝脏、肾脏、小肠或其组合。
5.如权利要求1所述的定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布的方法，其特征在于，在步骤（4）中，冻干条件为在-10大气压和-50℃条件下冷冻干燥组织样品至恒重。
6.如权利要求1所述的定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布的方法，其特征在于，在步骤(5)中，称取一定量的冻干组织样品，采用湿法消解组织样品，具体消解条件为每0.1克组织样品中加入1毫升的65%V/V硝酸，70℃水浴2小时，然后加入与硝酸等体积的30%V/V双氧水，85℃水浴2小时，消解结束后，消解液呈现淡黄透明，定容到10毫升。
7.如权利要求1所述的定量分析微塑料在哺乳动物体内富集和分布的方法，其特征在于，在步骤(6)中，设定的最大激发波长为445nm，最大发射波长为550nm。
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