CN109239032A - 应用叶绿素荧光参数鉴定植物锶富集能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种应用叶绿素荧光参数鉴定植物锶富集能力的方法，该方法包括1)植株培育：将待测定植株用不同浓度的含锶营养液处理；2)叶绿素荧光动力学参数测定：用叶绿素荧光仪测定植株叶片在不同培育时期的叶绿素荧光参数；3)获取各植株在同一浓度下不同时期的最小荧光Fo的变化值；4)根据步骤3)的植物Fo变化值鉴定植株的锶富集能力。本发明方法克服了现有方法处理繁琐、周期长、效率低等缺点，具有无损检测、灵敏、快速等优势，可以对新鲜的植物样品进行即时原位测定，测定一个样品仅需要几分钟到半个小时左右，具有及时、灵敏、快速、高效等特点。

Description

应用叶绿素荧光参数鉴定植物锶富集能力的方法

技术领域

本发明属于土壤污染治理领域，具体涉及一种应用叶绿素荧光参数鉴定植物锶富集能力的方法。

背景技术

核技术的开发利用在给人类带来巨大经济效益和社会效益的同时，也产生了大量的放射性污染物。放射性污染物会对生态环境，特别是对土壤和水体造成放射性污染，这就是核污染。放射性核素进入土壤和环境后，清除起来非常困难。常规的物理和化学方法虽然可以用来处理土-水系统中的低放核素，但成本高，易造成二次污染。植物修复技术是以植物忍耐和超量积累某种或某些化学元素的理论为基础，利用植物及其共存的微生物体系，清除环境中污染物的一门环境污染治理技术。具有投资和维护成本低、操作简便、环境友好和洁净等优点，且有可能通过资源化利用而取得一定经济效益，具有广阔的应用前景，被国内外学者认为是治理大面积土壤和水体中低放、低放和极低放核素污染环境的最有效手段之一。但目前国内外关于锶、铯、铀等核素污染土壤植物修复的研究还处于初级阶段，主要是超富集植物的筛选。目前的研究表明不同种科、属的植物对锶、铯、铀等核素的吸收与积累不同，而同种植物的不同器官对锶、铯、铀的积累也不相同。对于核素污染环境的植物修复技术研究，寻找和筛选更多的核素超富集植物将是提高植物修复技术效率的最重要物质基础和必要前提。

目前国内外核素超富集植物的筛选鉴定主要遵循以下程序进行：样品采集--样品干燥--样品消解，再将消解处理好的样品液通过原子吸收光谱仪或电感耦合等离子体发射光谱仪进行元素含量分析，最后根据植物对某个核素或重金属的富集系数和转运系数来判断和鉴定植物对核素和重金属的富集能力大小。整个流程差不多需要一周左右时间，而且样品处理过程十分繁琐，效率非常低。因此，寻找一个快速、易于测定、能在短时间内检测大量样品的判断植物核素或重金属富集能力相对大小的方法对于筛选核素和重金属超富集植物具有重要的应用价值和前景。

植物的光合作用是一个吸收二氧化碳和水将光能转化为化学能并释放氧气的过程。叶绿体中含有光系统Ⅰ(PhotosystemⅠ,PSⅠ)和光系统Ⅱ(PhotosystemⅡ,PSⅡ)两个光合作用反应中心，叶绿体中用于吸收、传递光能的叶绿素是一种荧光物质，当绿色植物进行光合作用时常常会伴随着荧光现象的发生。如图1所示，天线色素分子将所吸收的光能主要被用于反应中心的光化学反应，过量的激发能则以热能的形式被耗散掉，而少量的激发能就以荧光的形式进行发射。由于植物吸收的光能仅有一小部分以荧光的形式被耗散掉(一般不超过入射光能的5％)且叶绿素的荧光信号较微弱，因此荧光的波长比吸收的波长更长，Kautsky和Hirsh最早在1931年时就已经认识到光合作用的原初反应与叶绿素荧光之间的密切关系，他们在报告中指出经过充分暗适应后的植物，在光照条件下它的叶绿素荧光会先迅速上升到一个最大值，然后逐渐下降，最后会稳定在某个固定值。随着对叶绿素荧光研究的不断深入，荧光诱导动力学曲线及其快速诱导动力学所蕴藏的丰富信息被充分认识，使得对PSⅡ供体侧和受体侧电子传递的研究更加深入。典型的叶绿素荧光诱导动力学曲线如图2所示，植物发出的荧光强度随时间而变化，在从暗适应到暴露在光下时，荧光强度先上升，然后下降。一般情况下，刚暴露在光下时的最低荧光定义为O点，荧光的最高峰定义为P点，从O点到P点的荧光变化过程也称为快速荧光诱导动力学曲线，主要反映PSⅡ的原初光化学反应及光合机构的结构和状态等的变化，而下降的阶段主要反映了光合碳代谢的变化，随着光合碳代谢速率的上升，荧光强度逐渐下降。

植物的光合作用是对环境变化非常敏感的一个生理过程，光合作用对核素胁迫非常敏感，核素胁迫显著抑制植物的生长发育，同时伴随光合作用效率的下降。经本发明的发明人研究发现，在同样处理浓度和同样处理时间的核素胁迫下，核素富集能力较强的植物如油菜、苋菜吸收富集的核素越多，其从地下部分往地上部分转移的核素就越多，叶片中积累的核素就越多，其光合作用效率受到抑制的程度就越大；而核素富集能力较弱的植如小麦、水稻和玉米等，吸收富集核素少，地下部分往地上部分转移的核素就少，叶片中累积的核素少，光合作用效率受到抑制的程度小。基于该发现，本申请的发明人试图寻找一种利用植物的光合作用参数来筛选核素富集能力强的植物的方法。

发明内容

本发明的发明人分析了元素锶对不同种植物叶绿素荧光动力学参数的影响，并建立了相应的数据库，结果表明植物叶片的叶绿素荧光参数即O相荧光(最小荧光，Fo)的变化趋势可以和植物对锶的富集能力建立对应关系，因此可以用叶绿素荧光参数的变化来鉴定植物对锶的富集能力。

基于此，本发明提供了一种应用叶绿素荧光参数鉴定植物锶富集能力的方法，该方法包括以下步骤：

1)植株培育：将待测定植株用不同浓度的含锶营养液处理；

2)叶绿素荧光动力学参数测定：用叶绿素荧光仪测定植株在不同培育时期的叶绿素荧光动力学参数；

3)获取各植株在同一浓度下不同时期的Fo变化值；

4)根据步骤3)的植物Fo变化值鉴定植株的锶富集能力。

进一步地，上述应用叶绿素荧光参数鉴定植物锶富集能力的方法，步骤4)的鉴定方法是，将Fo的上升幅度大于等于5％的植物筛选为锶富集能力强的植物；将Fo的上升幅度小于5％的植物筛选为锶富集能力弱的植物。

进一步地，上述应用叶绿素荧光参数鉴定植物锶富集能力的方法，步骤1)是待植物长至6叶期再用不同浓度的含锶营养液处理。如果过早用含锶营养液处理植株，植物耐受能力弱，将很难筛选出符合要求的植物，如果过晚用含锶营养液处理植株，又错过植株生长和吸附核素的最佳时期，因此，本发明选用6叶期植株进行处理。

进一步地，上述应用叶绿素荧光参数鉴定植物锶富集能力的方法，步骤2)在测定前先将植株暗适应20～25min。

根据本发明的一些具体实施例，上述应用叶绿素荧光参数鉴定植物锶富集能力的方法，包括以下步骤：

1)植株培育：选取待测定植物在土壤中育苗至4叶期，选取长势一致的健康植株移栽至含有10公斤/盆石英砂的塑料盆中，每盆移栽6株，待长至6叶期用不同浓度锶(SrCl2)的Hoagland营养液进行处理，锶浓度分别为0、1、5、10、20mol·L-1，5个重复；

2)叶绿素荧光动力学参数测定：植株从上往下，在刚刚完全展开的成熟叶片的中部，对同一个叶片分别在第7d、14d、21d进行测定(测定仪器可以使用德国Walz公司的PAM2500，Dual-PAM-100等叶绿素荧光仪，也可以使用英国汉莎公司的·Handy PEA、FMS-2等叶绿素荧光仪)；测定前暗适应20min，测定叶片的最小荧光参数Fo，测量光强为120μmol·m-2·s-1，饱和脉冲的光强为10000μmol·m^-2·s^-1，饱和脉冲的持续时间为600ms，每个处理测定5个重复；

3)根据步骤2)的测定结果获取各植株在同一浓度下不同时期的Fo变化值；

4)鉴定植株的锶富集能力：计算Fo的上升幅度即上升的相对百分数，将Fo的上升幅度大于等于5％的植物筛选为锶富集能力强的植物；将Fo的上升幅度小于5％的植物筛选为锶富集能力弱的植物。

本发明的有益效果在于：克服了现有方法筛选核富集植物存在的样品处理繁琐，周期长，效率低等缺点，本发明所采用的叶绿素荧光动力学技术具有无损检测、灵敏、快速等优势，可以对新鲜的植物样品进行即时原位测定，无需采样、干燥、消解后再进行仪器分析测试。本方法测定一个样品仅需要几分钟到半个小时左右，具有及时、灵敏、快速、高效等特点。

附图说明

图1是叶绿素荧光产生的示意图；

图2是典型的叶绿素荧光诱导动力学曲线；

图3为处理7d三种植物锶富集含量的比较图；

图4为处理14d三种植物锶富集含量的比较图；

图5为处理21d三种植物锶富集含量的比较图；

图6为处理7d三种植物叶绿素荧光参数Fo的比较图；

图7为处理14d三种植物叶绿素荧光参数Fo的比较图；

图8为处理21d三种植物叶绿素荧光参数Fo的比较图。

具体实施方式

以下通过具体试验例对本发明的发明内容做进一步的阐释，但不应理解为本发明的范围仅限于以下的实例，根据本发明的发明思路和全文内容，可以将以下实例中的各个技术特征做适当的组合/替换/调整/修改等，这对于本领域技术人员而言是显而易见的，仍属于本发明保护的范畴。

材料与方法

本实施例选用生长速度快，生物量大，根系较发达，对病虫害抗性好的几种植物。参与试验植物包括3科3属的3种植物，分别为禾本科的小麦、十字花科的油菜、苋科的红苋菜。参试植物具体科属详见表1。

表1试验选用植物学名及科属

试验设计与植株培育

试验以小麦、油菜、和苋菜为供试材料，在土壤中育苗至4叶期，选取长势一致的健康植株移栽至含10kg/盆石英砂的塑料盆中，每盆移栽6株。待长至6叶期用不同浓度锶(SrCl₂)的Hoagland营养液进行处理，钴浓度分别为0、1、5、10、20mol·L^-1，5个重复。

数据采集

分别在处理的第7d、14d和21d进行锶含量测定和叶绿素荧光动力学分析。

锶含量测定：不同钴浓度(0,1,5,10,20mol·L^-1)处理的5种植物样品，分别在处理的不同阶段(7d,14d,21d)收获植物，于105℃条件下杀青30min，75℃下烘干至恒重。分别取根、茎、叶研细，取植物三个器官干粉0.3g于10mL硝酸中，采用微波消解仪(Mars，美国CEM公司)进行微波消解，用原子吸收光谱(AA700，美国PE公司)于240.7nm波长测定钴元素的含量，每个部分重复测量3次。

叶片叶绿素荧光参数测定：从上往下，刚刚完全展开的成熟叶片的中部，对同一个叶片分别在第7d、14d、21d进行测定。测定前暗适应20min，采用调制式叶绿素荧光仪(Dual-PAM-1000，德国Walz公司)，测定Fo、Fm、Fv/Fm等荧光参数，测量光强为12μmol·m-2·s-1，饱和脉冲的光强为10000μmol·m-2·s-1，饱和脉冲的持续时间为600ms，每个处理测定5个重复。

数据处理与结果分析

用统计分析软件SPSS PASW Statistics 18.0作相关试验数据的方差分析(ANOVA)，比较处理间的差异，所有数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示，并用Sigmaplot12.0作图。

7d锶含量测定数据如表2所示，三种植物锶富集含量比较结果如图3；

14d锶含量测定数据如表3所示，三种植物锶富集含量比较结果如图4；

21d锶含量测定数据如表4所示，三种植物锶富集含量比较结果如图5；

7d叶片叶绿素荧光参数如表5所示，三种植物叶绿素荧光参数Fo比较结果如图6；

14d钴含量测定数据如表6所示，三种植物叶绿素荧光参数Fo比较结果如图7；

21d钴含量测定数据如表7所示，三种植物叶绿素荧光参数Fo比较结果如图8。

图3～8中，从左至右每三个柱形图为相同处理浓度的一组，依次分别代表小麦、油菜和苋菜三种植物，重复的五组柱形图代表5个处理浓度。Fo增值在一些情况下出现负值，是因为在低浓度下，少量的核素对植株的光合作用具有一定的促进作用。

表2处理7d三种植物锶富集含量

表3处理14d三种植物锶富集含量

表4处理21d三种植物锶富集含量

表5处理7d三种植物叶片叶绿素荧光参数变化

表6处理14d三种植物叶片叶绿素荧光参数变化

表7处理21d三种植物叶片叶绿素荧光参数变化

传统方法鉴定三种植物的锶富集能力

传统的方法通常用富集系数(富集系数＝植株地上部分或地下部分Sr²⁺含量/施入Sr²⁺的量)和转运系数(转移系数＝植株地上部分Sr²⁺含量/植株地下部分Sr²⁺含量)的大小来判断植物对核素和重金属富集能力的强弱，富集系数和转运系数越大表明植物对核素和重金属的富集和转运能力越强，富集系数和转运系数越小，表明植物对核素和重金属的富集和转运能力越弱。根据图3～5和表2～4的数据显示，在受测试的三种植物中，苋菜植株体内累积的锶最多，在不同处理浓度和不同处理时间下富集系数和转运系数最大，具有最强的富集能力，油菜植株对锶的累积量和富集能力居于中间，而小麦植株地下和地上部分的锶的含量最小，在不同处理浓度和不同处理时间下富集系数和转运系数最小，对锶的富集能力最弱。

本发明方法鉴定三种植物的锶富集能力

根据图6～8和表5～7，在同一处理时间，随着处理浓度的增加Fo显著上升，富集能力最强的苋菜的Fo上升幅度最大，尤其在10,20mol·L^-1高浓度处理下，Fo的上升幅度显著大于5％，油菜的富集能力居于苋菜和小麦之间，其Fo变化幅度也处于苋菜和小麦中间，小麦的富集能力最弱，其Fo的上升幅度最小，在所有处理浓度下，Fo的上升幅度均小于5％。在不同处理时间，富集能力不同植物的Fo上升趋势一致。

因此，本发明方法与传统方法结论一致，且具有快速、高效、无损的优点。

Claims (5)

1.一种应用叶绿素荧光参数鉴定植物锶富集能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)植株培育：将待测定植株用不同浓度的含锶营养液处理；

2)叶绿素荧光参数的测定：用叶绿素荧光仪测定植株在不同培育时期的叶绿素荧光参数；

3)获取各植株叶片在同一浓度下不同时期的最小荧光Fo的变化值；

4)根据步骤3)的植物叶片Fo变化值鉴定植株的锶富集能力。

2.根据权利要求1所述的应用叶绿素荧光参数鉴定植物锶富集能力的方法，其特征在于，步骤4)的鉴定方法是，将最小荧光Fo的上升幅度大于等于5％的植物筛选为锶富集能力强的植物；将Fo的上升幅度小于5％的植物筛选为锶富集能力弱的植物。

3.根据权利要求1所述的应用叶绿素荧光参数鉴定植物锶富集能力的方法，其特征在于，步骤1)待植物长至6叶期再用不同浓度的含锶营养液处理。

4.根据权利要求1所述的应用叶绿素荧光参数鉴定植物锶富集能力的方法，其特征在于，步骤2)在测定前先将植株暗适应20～25min。

5.根据权利要求1所述的应用叶绿素荧光参数鉴定植物锶富集能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)植株培育：选取待测定植物在土壤中育苗至4叶期，选取长势一致的健康植株移栽至含有10公斤/盆石英砂的塑料盆中，每盆移栽6株，待长至6叶期用不同浓度锶的营养液进行处理，锶浓度分别为0、1、5、10、20mol·L^-1，5个重复；

2)叶绿素荧光动力学参数测定：植株从上往下，在刚刚完全展开的成熟叶片的中部，对同一个叶片分别在第7d、14d、21d进行测定，测定前暗适应20～25min，测定叶片的最小荧光参数Fo，测量光强为12μmol·m^-2·s^-1，饱和脉冲的光强为10000μmol·m^-2·s^-1，饱和脉冲的持续时间为600ms，每个处理测定5个重复；

3)根据步骤2)的测定结果获取各植株在同一浓度下不同时期的Fo变化值；

4)鉴定植株的锶富集能力：计算Fo的上升幅度即上升的相对百分数，将Fo的上升幅度大于等于5％的植物筛选为锶富集能力强的植物；将Fo的上升幅度小于5％的植物筛选为锶富集能力弱的植物。