CN104698130B - 菊花镉耐性的评价鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种菊花镉耐性的评价鉴定方法；选取不同品种菊花的扦插幼苗进行预培养；预培养3～5d后进行镉处理，镉处理液为含Cd2+的Hoagland营养液，所述镉处理液中Cd2+浓度为0.5mg/L；镉耐性评价鉴定：镉处理30d，进行根长、根干重、丙二醛和总叶绿素含量的测定评价，获得综合得分，根据综合分大小对各品种进行综合排序：综合得分越大镉耐性越差，综合得分越小，镉耐性越强。本发明建立了镉耐性菊花品种的有效筛选指标，为菊科植物对重金属镉的抗性和修复研究提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及农业领域的品种筛选技术，具体涉及一种菊花镉耐性的评价鉴定方法。
背景技术
随着工业化、城镇化的推进，由重金属污染导致的环境问题日益严重。镉污染已成为世界范围内影响较广泛、危害较大的环境问题之一，镉污染不仅能直接导致农作物的产量和品质下降，而且还会通过食物链危害人和动物健康。
土壤重金属镉污染的治理应坚持“预防为主，综合防治”原则，并加大治理力度，推行清洁环保生产，严格控制含有重金属镉的工业“三废”的排放，防止其对环境的二次污染，严格控制农业生产中污水灌溉和污泥施用的施用量和镉含量，因此土壤镉污染的治理需要发展高效、可操作性强的修复技术。
化学修复是指向土壤加入改良剂，通过吸附、拮抗作用和氧化还原，来降低重金属的生物有效性。其关键是改良剂的选择，常用改良剂有石灰、硅酸盐、碳酸钙、沸石、磷酸盐和一些促进还原作用的有机物质。施用改良剂的方法在短期内可降低土壤中重金属的毒性和生物有效性，但就修复后土壤的长期有效性和生态系统的长期稳定性而言，还有待于进一步深入细致的研究。此方法为原位修复，重金属仍存在于土壤中，易再度活化并危害植物，因此其潜在威胁并未从根本上消除。
生物修复包括：动物修复、微生物修复和植物修复技术。植物修复技术，是指利用植物吸收、分解、挥发或固定土壤中的重金属，从而降低重金属在土壤中的含量和有效态含量，最终降低对生物的危害。其实质是将某种特定的植物种植在重金属污染的土壤上或水体中，而该种植物对土壤中的重金属具有较强的忍耐或超量积累能力，将植物收获并进行处理后可将重金属移出土体或水体，从而达到治理污染与恢复生态环境的目的。与其它方法相比，生物修复具有原位治理，不破坏土壤生态环境和土壤结构等特点，因此已经成为相对可靠的和安全的修复措施，在重金属污染的治理中起着重要作用。
作为最具发展前景的重金属修复技术，目前植物修复的研究热点和发展趋势主要集中在：寻找和选育对重金属具有超积累能力的植物。用于修复重金属污染土壤的超积累植物通常矮小，生物量低，生长缓慢，修复重金属污染的土壤或水体需要时间太长，因此寻找，筛选和培育出生物量大，生长速度快，并且能同时吸收多种重金属的超积累植物成为未来研究的一个发展趋势。
菊科植物具有分布广、生物量大、根系发达且抗逆性强等特点，用菊科植物修复污染土壤中的重金属，可达到美化环境和修复治理的双重功效，因此菊科植物对镉的耐性和富集作用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的不足，提供一种菊花镉耐性的评价鉴定方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明涉及一种菊花镉耐性的评价鉴定方法，所述方法包括如下步骤：
A、选取不同品种菊花的扦插幼苗在相同的温室条件下分别进行预培养；所述预培养采用Hoagland营养液；所述不同品种菊花，每品种均取若干株，分为测定组和对照组；
B、镉胁迫处理和对照处理：测定组在预培养3～5d后进行镉胁迫处理30d，镉处理液为含Cd2+的Hoagland营养液，所述镉处理液中Cd2+浓度为0.5mg/L；对照组在预培养3～5d后以Hoagland营养液(即Cd2+浓度为0mg/L)进行对照处理30d；
C、耐镉毒评价鉴定：分别进行如下测定评价：
1)植株根长测定评价：测定根长，获得根长下降率；
2)植株根干重测定评价：取植株根系烘干至恒重，冷却后称量根干重，获得植株根干重下降率；
3)总叶绿素含量测定评价：
将叶片浸渍于二甲基亚砜内，吸取萃取液；
在所述萃取液中加入二甲基亚砜，得待测液；
以二甲基亚砜为对照，用分光光度计测定所述待测液在645nm、663nm波长下的吸光度OD645、OD663值，叶绿素计算公式如下：
Chl(mg/g FW)＝0.3×(20.2×OD645+8.02×OD663)
获得总叶绿素含量下降率；
4)丙二醛含量测定评价：
以三氯乙酸为溶剂、加入叶片研磨，离心得样品提取液；
样品提取液中加入硫代巴比妥酸，煮沸，冷却后离心，取上清液；
以蒸馏水加硫代巴比妥酸的混合液作为对照，测定所述上清液在450nm，532nm，600nm波长下的吸光度，计算公式如下：
MDA浓度(umol/L)＝6.45(OD532－OD600)－0.56OD450，
MDA浓度(umol/g)＝MDA浓度(umol/L)×提取液体积(5ml)/植物组织鲜重(g)，
获得丙二醛含量增长率；
(测定组测定值—对照组测定值)/对照组测定值＝变化率；所述变化率为负值时，所述变化率的绝对值即所述下降率，所述变化率为正值时，所述变化率即所述增长率；
各品种的综合得分＝根长下降率+植株根干重下降率+总叶绿素含量下降率+丙二醛含量增长率；
根据综合分大小对各品种进行综合排序：综合得分越大镉耐性越差，综合得分越小镉耐性越强。
作为优选方案，所述植株根长测定具体为：取出植株，用水漂洗干净，将植株根和地上部分开，采用直尺测定根长，获得根长下降率。
作为优选方案，所述植株根干重测定具体为：取出植株，用水漂洗干净，将植株根和地上部分开，取植株根在105℃烘箱中杀青30min，然后在80℃下烘干至恒重，冷却后称量根干重。
作为优选方案，所述叶绿素含量测定中，浸渍时，每0.1g叶片对应10ml二甲基亚砜；所述浸渍是在黑暗中放置3d，每天混匀一次。
作为优选方案，所述叶绿素含量测定中，待测液中萃取液与二甲基亚砜的体积比为1:3。
作为优选方案，所述丙二醛含量测定中，每克叶片对应三氯乙酸20ml；充分研磨后，将匀浆转入离心管中，在2500～3500r/min转速下离心10～15min，得样品提取液。
作为优选方案，所述丙二醛含量测定中，所述样品提取液或蒸馏水与硫代巴比妥酸的体积比为1:1；所述煮沸时间为20～40min；所述冷却后离心是在2500～3500r/min转速下离心20～40min。
作为优选方案，所述丙二醛含量测定中，所述三氯乙酸的质量百分比浓度为5％；所述硫代巴比妥酸的质量百分比浓度为0.67％。
作为优选方案，步骤C中，所述测定评价还可包括对菊花样品根和地上部的镉含量、生物富集系数BCF、转移系数TF的测定，具体为：以浓HNO3为溶剂，加入粉碎后的根或地上部，静置过夜，第二天加热消化至完全溶解，去离子水定容稀释后，采用AA-6800型火焰原子吸收分光光度计测定镉的质量浓度；
镉含量(mg/kg)＝(ρ-ρ0)×V/m，
BCF＝植物地上部或根中Cd浓度/溶液中Cd浓度，
TF＝地上部中Cd浓度/根中Cd浓度，
其中，ρ为样品溶液中镉的质量浓度(mg/L)，ρ0为空白溶液中镉的质量浓度(mg/L)，V为测定液定容体积(ml)，m为样品质量(g)；
所述菊花样品地上部镉含量均超过100mg/kg干重，地上部富集系数均大于1，转运系数均大于1，评定该菊花品种为镉富集植物；所述菊花样品在Cd2+浓度为0.5mg/L时，根部富集系数大于1000，转运系数小于1，评定该菊花品种具有一定的镉富集能力。
作为优选方案，每克粉碎后的根或地上部加入浓HNO320～30ml；所述加热消化的温度为250～350℃。
作为优选方案，步骤C中，所述测定评价还可包括对株高、植株地上部干重的测定评价。
作为优选方案，步骤C中，所述测定评价还可包括类胡萝卜素含量测定评价；具体为：
将叶片浸渍于二甲基亚砜内，吸取萃取液；
在所述萃取液中加入二甲基亚砜，得待测液；
以二甲基亚砜为对照，用分光光度计测定所述待测液在470nm、645nm、663nm波长下的吸光度OD470、OD645、OD663值，计算公式如下：
Chla(mg/g FW)＝10.05OD663-0.766OD645
Chlb(mg/g FW)＝16.37OD645-3.14OD663
Carotenoid content(mg/gFW)＝0.3×[(1000OD470-1.28Chla-56.7Chlb)/230]；
获得叶绿素a含量下降率、叶绿素b含量下降率以及类胡萝卜素含量下降率。
作为优选方案，步骤C中，所述测定评价还可包括叶片光化学效率测定评价；具体为：用叶绿素荧光仪测定叶片中的光化学效率Fv/Fm，获得光化学效率下降率。
作为优选方案，步骤C中，所述测定评价还可包括相对电导率测定评价；具体为：相对电导率EL(％)＝(S1/S2)×100％；其中，S1为叶片在常温下去离子水中离心震 荡24h后测得的电导率值，S2为叶片在去离子水中于100℃煮沸、冷却至室温后测得的电导率值；获得相对电导率增长率。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明以不同菊花品种的扦插苗为材料，采用水培方法，进行不同浓度镉处理，对镉胁迫下菊花扦插苗的生理生长特性以及镉在植物体内的富集情况进行测定，建立了镉耐性菊花品种的有效筛选指标，以期为菊科植物对重金属镉的抗性和修复研究提供依据，也可为进一步研究菊花的镉耐性机理提供一定的参考。
2、本发明的评价鉴定方法简便易行，能够客观的对菊花品种镉耐性进行评价、筛选；筛选到的优良菊花品种，即可作为一种镉污染土地的修复植物加以直接利用，也可与在此基础上进行耐镉诱导培育，产生镉耐性更优异的菊花新品种。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明专利的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为不同浓度镉处理在不同时间对株高的影响示意图，其中，(a)为镉处理第10d株高，(b)为镉处理第20d株高，(c)为镉处理第30d株高；
图2为不同浓度镉处理在不同时间对根长的影响示意图，其中，(a)为镉处理第10d根长，(b)为镉处理第20d根长，(c)为镉处理第30d根长；
图3为不同浓度镉处理对生物量的影响示意图，其中，(a)为镉处理第30d根干重，(b)为镉处理第30d地上部干重，
图4为不同浓度镉处理在不同时间对Fv/Fm的影响示意图，其中，(a)为镉处理第10d的光化学效率，(b)为镉处理第20d的光化学效率，(c)为镉处理第30d的光化学效率；
图5为不同浓度镉处理在不同时间对相对电导率的影响示意图，其中，(a)为镉处理第10d的电导率，(b)为镉处理第20d的电导率，(c)为镉处理第30d的电导率；
图6为不同浓度镉处理在不同时间对丙二醛含量的影响示意图，其中，(a)为镉处理第10d的丙二醛含量，(b)为镉处理第20d的丙二醛含量，(c)为镉处理第30d的丙二醛含量；
图7为镉处理下30d时的菊花幼苗形态示意图；其中，A为‘Splash Sweet’，B为‘Rainbow Rosy’，C为‘Breeze Yellow’；且A、B、C中从左至右依次为镉浓度0、 0.5、2.5、5.0和10.0mg/L下的菊花苗形态。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
鉴于不同植物镉耐性不同，本发明首次建立菊花品种镉耐性评价鉴定方法。该方法采用了11个菊花品种，根据镉害症状筛选出耐性强、一般和差3个品种，通过不同镉处理浓度进行株高、根长、植株根和地上部干重、叶绿素和类胡萝卜素含量、叶片光化学效率、相对电导率、丙二醛含量等形态及生理生化指标的测定评价，通过相关性比较分析，筛选出显著相关的有效指标，进行不同菊花品种镉耐性评价。同时，本发明测定材料为菊花扦插幼苗，取材容易，且镉处理浓度低，灵敏度高，测定指标简便实用，相关性显著有效，是可用于实际生产的一种菊花品种镉耐性评价鉴定方法。
本实施例涉及一种菊花镉耐性的评价鉴定方法。该方法具体包括如下步骤：
1.1、选取不同品种菊花的扦插幼苗在温室条件下进行预培养；所述预培养采用Hoagland营养液；
试验材料为菊花品种‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’和‘Breeze Yellow’的扦插苗(扦插时间为60d)，均取自上海交通大学浦江基地，购买自Fides公司。
选择长势良好、大小一致的菊花扦插幼苗置于装有300ml的Hoagland营养液的培养瓶中在温室条件下进行预培养。预培养采用的Hoagland营养液配方如下表1：
表1 Hoagland营养液配方
1.2、镉胁迫处理：用CdCl2·2.5H2O(分析纯)配制溶液，使Hoagland营养液中的Cd2 +浓度分别达到0(CK)、0.5(T1)、2.5(T2)、5.0(T3)、10(T4)mg/L，共5个处理，每处理1株，重复3次，每4d换一次营养液，并使用通气装置进行通气。分别在镉处理第10、20、30d时进行生长指标和生理指标的观察和测定。
1.3、镉耐性评价鉴定：镉处理10d、20d及30d，进行如下测定评价：
1.3.1镉害症状描述
镉处理30d后，取出植株，观察植物生长情况，并拍照。
镉胁迫30d后的镉害症状：不同浓度镉处理对菊花幼苗形态有显著影响。随着镉处理浓度的增加，‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’和‘Breeze Yellow’的菊花苗生长势逐渐减弱，表现为株高逐渐降低，叶片黄化且变小，同时植株根系生长受阻，根变短变小，颜色变褐，新生根数量减少。其中‘Rainbow Rosy’随着镉处理浓度增加，植株黄化程度最严重，并在镉为10.0mg/L时，出现少量枯叶，‘SplashSweet’的植株黄化程度次之。而‘BreezeYellow’随着镉处理浓度增加，黄化程度最轻，在镉为0.5mg/L时，未出现黄化现象。因此不同浓度镉处理下，‘Breeze Yellow’镉害症状最轻，其次为‘Splash Sweet’，最后为‘Rainbow Rosy’。
1.3.2株高、根长测定
采用直尺测量株高及根长，根长以最长根长计。
镉胁迫对株高的影响：由图1可知，在Cd处理第10d时，与对照组相比，‘SplashSweet’的株高均出现显著性降低；‘Rainbow Rosy’在Cd为0.5和10.0mg/L时出现显著性降低(P<0.05)，而在Cd为2.5和5.0mg/L时并未出现显著性降低；而‘BreezeYellow’的株高呈现先增高后降低趋势，仅在Cd为10.0mg/L时出现显著性降低(P<0.05)。
在Cd处理第20d时，与对照组相比，‘Splash Sweet’的株高均出现显著性降低(P<0.05)；‘Rainbow Rosy’在Cd为0.5、5.0、10.0mg/L时出现显著性降低(P<0.05)，而在Cd为2.5mg/L时并未出现显著性降低；而‘Breeze Yellow’的株高在Cd为0.5mg/L时未出现显著性降低(P<0.05)。
在Cd处理第30d时，与对照组相比，‘Splash Sweet’和‘Rainbow Rosy’的株高均出现显著性降低(P<0.05)；而‘Breeze Yellow’的株高在Cd为0.5mg/L时，其株高并未出现显著性降低。
因此，3份菊花品种的株高随着镉处理浓度的增加呈下降趋势，并随时间的延长，趋势逐渐明显，不同浓度镉处理对‘Breeze Yellow’的株高影响最小，其次为‘RainbowRosy’，最后为‘Splash Sweet’。
镉胁迫对根长的影响：由图2可知，Cd处理第10d时，与对照组相比，不同浓度镉处理下的‘SplashSweet’和‘Breeze Yellow’的根长均出现显著性降低(P<0.05)；而‘RainbowRosy’在Cd为2.5mg/L时未出现显著性降低。
Cd处理第20d和30d时，与对照组相比，‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’和‘Breeze Yellow’的根长均出现显著性降低(P<0.05)。
镉处理第20d时，Cd为0.5mg/L时，与对照相比，‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’‘和Breeze Yellow’根长分别降低了23.90％、26.85％和24.08％；Cd为10.0mg/L时，与对照相比，‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’和‘Breeze Yellow’根长分别降低了48.78％、38.26％和53.93％。
第30d时，Cd为0.5mg/L时，与对照相比，‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’‘和Breeze Yellow’根长分别降低了11.06％、37.94％和15.38％；Cd为10.0mg/L时，与对照相比，‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’和‘BreezeYellow’根长分别降低了46.54％、56.52％和58.30％。
因此，3份菊花品种的根长随着镉处理浓度的增加呈下降趋势，并随时间的延长，趋势逐渐明显。不同浓度镉处理对‘Splash Sweet’的根长影响最小，其次为‘RainbowRosy’，最后为‘Breeze Yellow’。
1.3.3植株根和地上部干重
镉处理30d后，取出植株，用水漂洗干净，将植株根和地上部分开，在105℃烘箱中杀青30min，然后在80℃下烘干至恒重，冷却后分别称量根和地上部干重。
镉胁迫对生物量的影响：
由图3可知，三种供试材料的根和地上部的生物量都随土壤中镉浓度的变化而变化，但是受镉处理影响的程度不同。镉处理第30d时，不同浓度镉处理下的‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’和‘Breeze Yellow’根干重均低于对照，并随着镉处理浓度的增加呈下降趋势。与对照相比，在Cd为0.5mg/L时，‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’和‘BreezeYellow’的根干重分别下降了24.84％、35.02和27.30％。
镉处理第30d，不同浓度镉处理下的3个菊花品种的地上部干重均显著低于对照，与对照相比，在0.5mg/L Cd处理下，‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’和‘Breeze Yellow’的地上部干重分别下降了35.79％、41.07％和29.24％，与Cd对株高的影响不同，‘BreezeYellow’的株高在Cd为0.5mg/L时，与对照相比，未出现显著性差异；在10mg/L Cd处理下，‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’和‘Breeze Yellow’的地上部干重分别下降了60.34％、52.07％和51.97％；因此，不同浓度Cd处理对‘Breeze Yellow’的地上部干重影响最小，其次为‘RainbowRosy’、最后为‘Splash Sweet’。
1.3.4叶绿素含量和类胡萝卜素
采用二甲基亚砜(DMSO)法测定，准确称取0.1g叶片置于含10ml二甲基亚砜(分析纯)的离心管中，在黑暗中放置3d，每天混匀一次；吸取1ml萃取液于10ml离心管中，加入2mlDMSO混匀；以DMSO为对照，用分光光度计测定OD663、OD645值(OD：optical delnsity光密度值)。叶绿素和类胡萝卜素含量计算公式如下：
Chla(mg/gFW)＝0.3×(12.7OD663-2.69OD645)；
Chlb(mg/gFW)＝0.3×(22.9OD645-4.68OD663)；
Chlt(mg/g FW)＝0.3×(20.2OD645+8.02OD663)；
Chla＝10.05OD663-0.766OD645
Chlb＝16.37OD645-3.14OD663
Carotenoid content(mg/gFW)＝0.3×[(1000OD470-1.28Chla-56.7Chlb)/230]
镉胁迫对叶绿素和类胡萝卜素(Carotenoid content)的影响：
由表2可看出，镉处理第10d时，与对照相比，镉处理下的‘Splash Sweet’的叶片中的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量均低于对照，与对照相比，‘Rainbow Rosy’的叶片叶绿素a和总叶绿素含量仅在Cd浓度为10.0mg/L时出现显著性下降，叶绿素b含量除Cd为5.0mg/L外均显著低于对照，类胡萝卜素未出现显著降低；与对照相比，‘BreezeYellow’叶绿素b含量在Cd浓度10.0mg/L时显著降低，叶绿素a、总叶绿素和类胡萝卜素未出现显著性降低(P<0.05)；
由表3可看出，镉处理第20d时，与对照相比，镉处理下的‘Splash Sweet’的叶片中的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均呈显著性下降(P<0.05)；‘Rainbow Rosy’的叶片叶绿素b和类胡萝卜素仅在镉浓度为10.0mg/L时出现显著性下降，而叶绿素a在和总叶绿素在2.5和10.0mg/L镉浓度处理下出现显著性下降(P<0.05)‘Breeze Yellow’的叶绿素a、总叶绿素和类胡萝卜素含量均未出现显著性下降(P<0.05)，而叶绿素b含量仅在镉浓度为10.0mg/L时出现显著性下降(P<0.05)；
由表4可看出，镉处理第30d时，不同浓度镉处理下3份菊花品种的叶片中的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素含量均低于对照，并随着镉处理浓度的增加而降低；与对照相比，Cd浓度为0.5mg/L时，‘Breeze Yellow’的叶绿素a和总叶绿素均未出现显著性降低(P<0.05)，‘Rainbow Rosy’的总叶绿素、叶绿素b和类胡萝卜素均未出现显著性降低(P<0.05)，‘Splash Sweet’的叶绿素b未出现显著性降低(P<0.05)。与对照相比，Cd浓度为0.5mg/L时，‘SplashSweet’、‘Rainbow Rosy’和‘Breeze Yellow’的叶绿素a含量分别下降了44.22％、29.41％和20.60％；叶绿素b含量分别下降了24.31％、21.20％和25.32％、总叶绿素含量分别下降了38.13％、26.51％和13.87％；类胡萝卜素含量分别下降了39.04％、29.12％和33.41％。
随着镉处理浓度的增加，叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量整体呈下降趋势，并随镉处理时间的延长和浓度的升高，镉对细胞色素的合成抑制程度越高，同时对类胡萝卜素含量的抑制程度最小，不同浓度镉处理对‘BreezeYellow’的叶片色素含量影响最小，其次为‘Splash Sweet’、最后为‘RainbowRosy’。
表2镉处理第10d时叶片色素含量变化
表3镉处理第20d时叶片色素含量变化
表4镉处理第30d时叶片色素含量变化
1.3.5叶片光化学效率
用Fv/Fm值表示叶片光化学效率。Fv/Fm用OS1-FL型叶绿素荧光仪测定，用暗适应叶夹夹菊花叶片15-20min后进行读数测定。
镉胁迫对光化学效率的影响：
由图4知，镉处理第10d时，与对照相比，不同浓度镉处理下的‘SplashSweet’、‘Rainbow Rosy’和‘Breeze Yellow’叶片光化学效率均未出现显著性变化((P<0.05)。
镉处理第20d时，与对照相比，‘Splash Sweet’的叶片光化学效率均呈现显著性降低(P<0.05)；‘Rainbow Rosy’在Cd浓度≤2.5mg/L时未出现差异显著性降低；而‘BreezeYellow’的叶片光化学效率仅在Cd为0.5mg/L时出现显著性降低(P<0.05)。
镉处理第30d时，与对照相比，‘Splash Sweet’的叶片光化学效率均呈显著性降低((P<0.05)；‘Rainbow Rosy’除Cd浓度为0.5mg/L外均呈差异显著降低((P<0.05)；而‘Breeze Yellow’的叶片光化学效率仅在Cd浓度为10mg/L时出现显著性增加(P<0.05)。
随着镉处理浓度的增加，叶片光化学效率在短时间未出现降低，随着时间的延长，在第20d、30d时，随镉处理浓度的增加呈下降趋势，说明此时光化学系统可能已受到 伤害。不同浓度镉处理对‘Breeze Yellow’的叶片光化学效率影响最小，其次为‘Splash Sweet’，最后为‘Rainbow Rosy’。
1.3.6相对电导率的测定
将叶片剪成0.5cm的小段，用去离子水洗净，吸干叶片上的水分，称0.2g，置于含20ml去离子水的离心管中，振荡24h后测其电导率值S1；然后将离心管置于沸水浴中20min，取出冷却至室温，测其电导率值S2。计算公式如下：
EL(％)＝(S1/S2)×100％
镉胁迫对叶片电导率的影响：
由图5可知，镉处理第10d时，与对照相比，不同浓度镉处理下‘SplashSweet’的叶片电导率均呈显著性增加(P<0.05)；‘Rainbow Rosy’呈先增加后降低的趋势；而‘BreezeYellow’与对照相比并未出现差异显著性变化((P<0.05)。
镉处理第20d时，与对照相比，‘Splash Sweet’的电导率在Cd浓度为0.5、5.0、10.0mg/L时呈显著性增加；而不同浓度镉处理下的‘Rainbow Rosy’和‘BreezeYellow’的电导率与对照组相比并未出现显著性增加。
镉处理第30d时，随着镉处理浓度的增加，‘Splash Sweet’的电导率呈显著性增加(P<0.05)；当Cd浓度>0.5mg/L时，‘Rainbow Rosy’的电导率出现显著性增加(P<0.05)；而‘Breeze Yellow’的电导率随着镉浓度的增加呈先降低升高趋势，Cd为2.5mg/L时，电导率最低，与对照相比，降低了22.30％。
镉处理第10d和20d时，电导率随镉浓度的增加未出现明显趋势，第30d时表现出升高趋势，说明此时植物细胞质膜透性会增大，为细胞内溶物质外渗，抗性降低。不同浓度镉处理对‘Breeze Yellow’的电导率含量影响最小，说明其膜系统受伤害程度最小，其次为‘Rainbow Rosy’，最后为‘Splash Sweet’。
1.3.7丙二醛含量的测定
称取叶片0.25g，加入5ml 5％的三氯乙酸(TCA)，充分研磨，将匀浆转入10ml的离心管中，在3000r/min转速下离心10min，取上清液2ml(上清液为样品提取液)，加2ml0.67％硫代巴比妥酸(TBA)，在100℃沸水浴中煮沸30min，冷却(冰浴)后再离心一次，取上清液测定其在450nm，532nm，600nm波长下的吸光度，(以2ml蒸馏水加2ml 0.67％TBA的混合液作为对照)。计算公式如下：
MDA浓度(μmol/L)＝6.45(OD532－OD600)－0.56OD450
MDA浓度(μmol/g)＝MDA浓度(μmol/L)×提取液体积(5ml)/植物组织鲜重(g)
镉胁迫对丙二醛含量的影响：
由图6可知，镉处理第10d时，与对照相比，‘Splash Sweet’和‘RainbowRosy’的叶片丙二醛含量仅在Cd为10.0mg/L时出现显著性增加(P<0.05)；而‘Breeze Yellow’仅在镉浓度为5.0mg/L时出现差异显著性增加(P<0.05)；
镉处理第20d时，与对照相比，不同浓度镉处理下的‘Splash Sweet’和‘RainbowRosy’的叶片丙二醛含量均呈现显著性增加(P<0.05)；而Breeze Yellow在Cd为0.5mg/L时，未出现差异显著性增加。
镉处理第30d时，与对照相比，在Cd浓度≤2.5mg/L时，‘Splash Sweet’和‘BreezeYellow’的叶片丙二醛含量未出现显著性增加(P<0.05)；而‘RainbowRosy’在镉处理下的叶片丙二醛含量均呈显著性增加(P<0.05)。
随着镉处理浓度的增加，丙二醛含量呈升高趋势，并随处理时间的延长，升高趋势逐渐明显，说明植物受到的伤害逐渐加重。不同浓度镉处理对‘BreezeYellow’的叶片丙二醛含量影响最小，说明其抗氧化能力较强，植株受到的伤害较小，其次为‘Splash Sweet’，最后为‘Rainbow Rosy’。
进一步对其进行镉含量、生物富集系数和转移系数的测定，判断是否其镉富集能力的大小，以及是否为镉富集植物。
1.3.8镉含量的测定
将根和地上部干样粉碎后，称取样品0.1g于干燥的100ml烧杯中，每个烧杯加入20～30ml浓HNO3(优级纯)，盖上表面皿静置过夜，次日于加热板上加热消化(T＝300℃)，直至样品完全溶解变澄清透明，然后用去离子水定容至25ml容量瓶中备用，浓度较高的样品作适当稀释。采用AA-6800型火焰原子吸收分光光度计(日本岛津公司)测定。镉含量、生物富集系数(Bioconcentration Factor,BCF)和转移系数(Translacation Factor,TF)按以下公式计算：
镉含量(mg/kg)＝(ρ-ρ0)×V/m(3-10)
式中ρ—为样品溶液中镉的质量浓度(mg/L)；
ρ0—空白溶液中镉的质量浓度(mg/L)；
V—测定液定容体积(ml)
m—样品质量(g)；
BCF＝植物地上部或根中Cd浓度/溶液中Cd浓度
TF＝地上部中Cd浓度/根中Cd浓度
镉在菊花体内的富集情况：
由表5可看出，‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’和‘Breeze Yellow’的根和地上部的镉含量均随着镉处理浓度的升高而升高，并且根中镉含量均高于地上部。相同浓度镉处理下，‘Breeze Yellow’的地上部镉含量最高，其次为‘SplashSweet’，最后为‘RainbowRosy’。除Cd为0.5mg/L外，‘Breeze Yellow’根部的镉浓度也均高于‘Rainbow Rosy’，最后为‘Splash Sweet’；3个菊花品种根部和地上部的的富集系数均随着Cd浓度的升高而下降，并且根部的富集系数均大于地上部；同时，随着镉处理浓度的增加，三个菊花品种转运系数均有先增大后减小的趋势，地上部富集系数由大到小依次为‘Breeze Yellow’、‘SplashSweet’、‘Rainbow Rosy‘(Cd为0.5mg/L除外)；根部富集系数由大到小依次为‘BreezeYellow’、‘Rainbow Rosy’、‘Splash Sweet’；当Cd浓度为5.0mg/L时，‘SplashSweet’和‘Breeze Yellow’的转运系数达到最大，分别为0.527和0.542；当Cd浓度为2.5mg/L时，‘Rainbow Rosy’的转运系数达到最大，为0.383。
表5不同浓度镉处理下镉在菊花品种根和地上部的富集量
以上数据分析采用Excel进行数据的整理及绘图，采用SAS 9.3软件进行最小显著差异性检验(P<0.05)。
处理30d时，采用SPSS软件对植物镉含量与形态生理指标的相关性进行分析，结果见表6：
表6植物镉含量与形态和生理指标的相关性分析
由表6的相关性分析表明，植株的镉含量变化与根长、根干重、丙二醛和总叶绿素含量的变化值紧密相关，故选择这4个指标作为衡量的依据。
将3个品种在不同镉浓度处理下4个指标变化率的绝对值相加，见下表7。结合镉受害的菊花幼苗形态(如图7所示)，表明在镉浓度为0.5mg/L或5mg/L，综合变化值和植株的镉耐受性最适合。考虑到检测灵敏性，选择0.5mg/L镉处理30d，通过根长、根干重、丙二醛和总叶绿素指标判断其镉耐受性。
表7不同品种镉处理下根长、根干重、丙二醛和总叶绿素含量变化绝对值
各品种的综合得分＝根长下降率+植株根干重下降率+总叶绿素含量下降率+丙二醛含量增长率；
‘SplashSweet’、‘Breeze Yellow’、‘BreezeYellow’的综合得分分别为：0.86、1.18和0.63；综合得分越小，镉耐性越强，可见菊花品种‘Breeze Yellow’镉耐性最强，可以作为重金属镉修复的备选植物。
对本发明的同浓度镉处理下‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’和‘BreezeYellow’的生长生理反应，以及镉在3个菊花品种扦插苗体内的富集情况进行定性分析，用以验证上述综合得分的结果，定性分析如下：
(1)不同浓度镉处理对菊花品种‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’和‘BreezeYellow’生长指标的影响。
重金属镉对植物的生长发育有显著的抑制作用，主要表现在生长受到抑制，发育受到影响，生物量下降等方面，并且随着镉处理浓度的增加和处理时间的延长，植物生长受到的抑制程度越大。
随着镉处理浓度的增加，与对照相比，菊花‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’和‘Breeze Yellow’的幼苗黄化逐渐加重，同时株高和根长呈下降趋势，而‘Breeze Yellow’在镉浓度较低时(Cd为0.5mg/L)并未出现黄化，株高也没有表现出显著性降低，一定程度上说明‘Breeze Yellow’对镉的耐性相对较强。’Splash Sweet‘、’Rainbow Rosy‘和BreezeYellow’根长随着镉处理浓度的增加均呈下降趋势，根系长势变弱，新根减少，因此可看出镉胁迫对根系生长抑制程度更高。‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’和‘Breeze Yellow’的地上部干重均随着镉处理浓度的升高呈逐渐下降趋势。不同浓度镉处理下的‘SplashSweet’、‘Rainbow Rosy’和‘Breeze Yellow’的根干重均低于对照。
(2)不同浓度镉处理对3个菊花品种生理指标的影响。
①叶绿素是评价光合作用的重要指标。类胡萝卜素可吸收剩余光能、淬灭单线态氧，因此具有防止膜脂过氧化，保护叶绿素和光合机能的作用。研究认为，进入叶绿体的Cd2+能够与蛋白质的-SH基和其他侧链结合，或取代其中的Fe2+、Zn2+等，并破坏叶绿体的结构，同时Cd2+能置换叶绿素分子中的Mg2+离子进而抑制光合色素的合成。叶绿素含量高低不但是衡量叶片衰老与否的重要指标，也是反映环境胁迫对植物伤害程度的主要指标。
叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素含量与对照相比，镉处理第10d时出现下降趋势，且随浓度增加及处理时间延长出现显著下降，下降程度由低到高为‘BreezeYellow’、‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’。以上结果表明，随着镉处理浓度的增加，三种试验材料的叶绿素含量呈下降趋势。同时，不同菊花品种的叶片色素含量受镉处理的影响不同，以‘Breeze Yellow’的叶片色素含量受到的影响最小。
②光系统Ⅱ(PSⅡ)的光化学效率是指可变荧光和最大荧光之比(Fv/Fm)，在正常生长条件下，植物的Fv/Fm值一般在0.85左右，当植物处在逆境条件下，Fv/Fm显著降低，因此Fv/Fm常作为光抑制和PSⅡ复合体受伤害的指标。
本发明中，在镉处理第10d时，不同浓度镉处理下的三个菊花品种的光化学效率与对照相比未出现显著性变化，Fv/Fm值保持在0.85-0.90之间。但是随着镉处理时间和处理浓度的增加，菊花的光化学效率表现出差异显著性降低(P<0.05)，其中‘Splash Sweet’在镉浓度在5.0mg/L时，30d时Fv/Fm值降低到0.70以下，说明此时菊花植株受到一定程度的镉毒害，PSⅡ复合体可能已经受到损伤。随着镉处理时间延长，三个菊花品种的Fv/Fm值呈先降低后升高趋势。叶片光化学效率在镉处理第20d时开始出现显著下降，下降程度由低到高为‘Breeze Yellow’、‘Splash Sweet’和‘RainbowRosy’。
③当植物受到镉胁迫时，膜系统的结构和功能受到损坏，透性增大，破坏了细胞内酶及代谢作用原有的区域性，从而抑制细胞和整个植株的生长，造成植株矮化，生长迟缓。
本发明中，镉处理第10d和20d时，与对照相比，不同浓度镉处理下的叶片电导率并没有表现出明显的趋势，但是镉处理第30d时，随着镉处理浓度的增加，3个菊花品种的电导率与对照相比开始出现明显升高趋势，而电导率的增加表明植物的膜系统已 经受到一定的损伤。‘Rainbow Rosy’和‘Splash Sweet’随浓度增加电导率增加，‘Breeze Yellow’在镉浓度为0.5mg/L、2.5mg/L和5.0mg/L处理时与对照相比呈降低趋势，当镉浓度达10.0mg/L出现增加趋势，即：‘Breeze Yellow’的叶片电导率呈先降低后升高，表明‘BreezeYellow’对低浓度Cd处理有一定的耐性，但是随着处理时间的增加，高浓度Cd胁迫下，细胞膜透性显著增加，细胞膜结构破坏严重。本发明中，叶片电导率增加程度由低到高为‘Breeze Yellow’、‘RainbowRosy’和‘Splash Sweet’。
④丙二醛(MDA)是膜质过氧化的产物，其含量高低可反应膜质过氧化的程度，此外，丙二醛可以与蛋白质、氨基酸、核酸等活性物质反应，形成不溶性化合物，进而干扰细胞的正常生命活动。
本发明中，在处理第10d时，与对照相比，‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’和‘Breeze Yellow’的MDA含量在镉浓度不超过2.5mg/L时，未出现显著性增加，但随着处理时间延长，镉处理第30d时，MDA含量随镉处理浓度的增加而增加。在菊花在镉处理第10d时，并未表现明显升高趋势，这可能是由于植物种类、胁迫程度和胁迫时间的不同而导致试验结果的差异性。同时‘Breeze Yellow’在镉处理第10d，20d，30d时，镉浓度不超过2.5mg/L时，MDA的含量与对照相比未出现显著性增加(P<0.05)，一定程度上说明‘Breeze Yellow’能够忍耐低浓度镉胁迫。丙二醛含量增加程度由低到高为：‘Breeze Yellow’、‘Splash Sweet’和‘Rainbow Rosy’。综合比较镉处理下的生长和生理指标，‘Breeze Yellow’对镉的耐性高于‘Splash Sweet’、和‘Rainbow Rosy’。
(3)菊花‘Breeze Yellow’、‘Splash Sweet’和‘Rainbow Rosy’品种镉的富集情况。
镉超富集植物必须满足地上部镉含量超过100mg/kg干重，地上部富集系数大于1，转运系数大于1，且在镉污染的土壤中生长良好，不会发生毒害现象。
本发明中，随镉处理浓度的增加，3个菊花品种根和地上部的镉含量均增加，且根富集的镉含量高于地上部。根富集系数由大到小依次为‘Breeze Yellow’、‘Rainbow Rosy’和‘Splash Sweet’；地上部富集系数则依次为‘Breeze Yellow’、‘Splash Sweet’、‘Rainbow Rosy’；3个菊花品种的转运系数均出现先增大后减小的趋势，转运系数由高到低为‘Breeze Yellow’、‘Rainbow Rosy’和‘SplashSweet’。‘Breeze Yellow’的镉富集和转移能力最强，其次为‘Rainbow Rosy’，最后为‘Splash Sweet’。本发明中的三个菊花品种的地上部镉含量均超过了100mg/L，并且其富集系数均大于1，但是转运系数均小于1,不完全符合超富集植物特征。然而，三个菊花品种均有较高的地上部和根部富集系数，当镉浓度为0.5mg/L时，其根部富集系数均大于1000。因此说明三个菊花品种均具有一定的镉富 集能力。
综上所述，较理想的重金属提取植物应该能够有较强的重金属耐性，同时可收获的部分应具有较高的重金属富集能力。本发明中，与菊花品种‘SplashSweet’、‘RainbowRosy’相比，‘Breeze Yellow’在不同浓度镉胁迫下，其生理生长受抑制程度最低，表现出较强的镉耐性，同时又具有较高的镉富集能力，因此菊花品种‘Breeze Yellow’可以作为重金属镉修复的备选植物。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (8)
1.一种菊花镉耐性的评价鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A、选取不同品种菊花的扦插幼苗在相同的温室条件下分别进行预培养；所述预培养采用Hoagland营养液；所述不同品种菊花，每品种均取若干株，分为测定组和对照组；
B、镉胁迫处理和对照处理：测定组在预培养3～5d后进行镉胁迫处理30d，镉处理液为含Cd2+的Hoagland营养液，所述镉处理液中Cd2+浓度为0.5mg/L；对照组在预培养3～5d后以Hoagland营养液进行对照处理30d；
C、镉耐性评价鉴定：镉处理30d，分别进行如下测定评价：
1)植株根长测定评价：测定根长，获得根长下降率；
2)植株根干重测定评价：取植株根系烘干至恒重，冷却后称量根干重，获得植株根干重下降率；
3)总叶绿素含量测定评价：
将叶片浸渍于二甲基亚砜内，吸取萃取液；
在所述萃取液中加入二甲基亚砜，得待测液；
以二甲基亚砜为对照，用分光光度计测定所述待测液在645nm、663nm波长下的吸光度OD645、OD663值，叶绿素计算公式如下：
Chl/mg/g FW＝0.3×(20.2×OD645+8.02×OD663)，
获得总叶绿素含量下降率；
4)丙二醛含量测定评价：
以三氯乙酸为溶剂、加入叶片研磨，离心得样品提取液；
样品提取液中加入硫代巴比妥酸，煮沸，冷却后离心，取上清液；
以蒸馏水加硫代巴比妥酸的混合液作为对照，测定所述上清液在450nm，532nm，600nm波长下的吸光度，计算公式如下：
MDA浓度/μmol/L＝6.45(OD532－OD600)－0.56OD450，
MDA浓度/μmol/g＝MDA浓度/μmol/L×提取液体积/植物组织鲜重/g，提取液体积为5ml；
获得丙二醛含量增长率；
(测定组测定值—对照组测定值)/对照组测定值＝变化率；所述变化率为负值时，所述变化率的绝对值即所述下降率，所述变化率为正值时，所述变化率即所述增长率；
综合得分＝根长下降率+植株根干重下降率+总叶绿素含量下降率+丙二醛含量增长率；
根据综合分大小对各品种进行综合排序：综合得分越大镉耐性越差，综合得分越小，镉耐性越强。
2.根据权利要求1所述的菊花镉耐性的评价鉴定方法，其特征在于，所述植株根长测定具体为：取出植株，用水漂洗干净，将植株根和地上部分开，采用直尺测定根长，获得根长下降率。
3.根据权利要求1所述的菊花镉耐性的评价鉴定方法，其特征在于，所述植株根干重测定具体为：取出植株，用水漂洗干净，将植株根和地上部分开，取植株根在105℃烘箱中杀青30min，然后在80℃下烘干至恒重，冷却后称量根干重。
4.根据权利要求1所述的菊花镉耐性的评价鉴定方法，其特征在于，所述叶绿素含量测定中，浸渍时，每0.1g叶片对应10ml二甲基亚砜；所述浸渍是在黑暗中放置3d，每天混匀一次。
5.根据权利要求1所述的菊花镉耐性的评价鉴定方法，其特征在于，所述叶绿素含量测定中，待测液中萃取液与二甲基亚砜的体积比为1:3。
6.根据权利要求1所述的菊花镉耐性的评价鉴定方法，其特征在于，所述丙二醛含量测定中，每克叶片对应三氯乙酸20ml；充分研磨后，将匀浆转入离心管中，在2500～3500r/min转速下离心10～15min，得样品提取液。
7.根据权利要求1所述的菊花镉耐性的评价鉴定方法，其特征在于，所述丙二醛含量测定中，所述样品提取液或蒸馏水与硫代巴比妥酸的体积比为1:1；所述煮沸时间为20～40min；所述冷却后离心是在2500～3500r/min转速下离心20～40min。
8.根据权利要求1所述的菊花镉耐性的评价鉴定方法，其特征在于，所述丙二醛含量测定中，所述三氯乙酸的质量百分比浓度为5％；所述硫代巴比妥酸的质量百分比浓度为0.67％。
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