CN102313713B - 基于中红外光谱的植物15n示踪同位素丰度快速检测方法 - Google Patents
基于中红外光谱的植物15n示踪同位素丰度快速检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于中红外光谱的植物15N示踪同位素丰度快速检测方法。传统的检测方法速度慢且操作复杂。本发明首先把待测植物样本研磨成粉末样本，将粉末样本与溴化钾后压片，完成样本制备。然后将制备好的样本进行的中红外透射光谱扫描，得到样本的中红外透射光谱，再把样本中红外透射光谱转换成吸光度。最后将样本在特征波数处的吸光度，代入公式，即可得到样本的同位素丰度
。本发明使用方便，可以快速、有效的测量植物15N示踪同位素丰度，故具有良好的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于信息检测技术领域，涉及一种基于中红外光谱的植物15N示踪同位素丰度快速检测方法。
背景技术
氮是植物必需的营养元素，是作物施肥三要素之首，氮肥占我国化肥消费比重达60%左右。目前我国占世界7%的耕地上消耗着全球35%的氮肥，氮肥的过量施用给我国的农业生产和生态环境带来了巨大危害。中国每年因不合理施肥造成近1000万吨的氮素流失，直接经济损失约300亿元。而且由于氮肥利用率低下，有60%左右进入环境。因而过量施氮已成为威胁中国长期粮食安全和环境安全的重大问题。减少氮肥施用量的关键是提高氮肥利用率，而15N同位素示踪（标记）法是目前唯一能直接反映作物对氮肥实际利用情况的方法。15N同位素示踪技术的关键是要对15N同位素丰度的动态变化进行跟踪和检测。但是目前15N同位素分析测量仪器昂贵、成本高、操作繁琐、耗时长、需要大量化学试剂，难以满足农业生产经济、高效的要求。
目前，15N同位素丰度测量的方法有质谱法、15N发射光谱法、核磁共振法和中子活化分析等，其中应用较多的是质谱法。
质谱法是通过测量各种物质的原子或原子团的荷质比来确定被测原子或原子团的性质和质量，具有高灵敏度及精确度的特征，广泛用于同位素的实验室测量。但是这种方法所采用的仪器价格昂贵、系统庞大、操作复杂，样品制备繁琐，操作过程引入污染。且最终的结果只能给出元素的量，不能测定元素的化学形态，这限制了质谱法在农业生产中的应用。
15N发射光谱法需要将样品转化成氮气（N2），然后用适当方法来激发氮分子发光，得到氮的光谱。随着组成氮分子的氮原子质量数不同而使氮的光谱波长发生位移，利用这一现象来测定15N同位素丰度。与质谱法相比，15N发射光谱法不需要昂贵的仪器设备，操作相对简便，并能测定含氮量为微克级的样品。但是，有些元素的原子很难激发，而且有机物一般是大分子，组成复杂，激发后谱线杂乱难以分析，限制了15N发射光谱法的应用。
核磁共振法是利用1-102兆赫的电磁波照射置于强磁场中的样品，样品中的某些原子核在特定的磁场强度下，与照射电磁波发生共振现象，产生强弱不同的吸收信号。以此来判明某些核素在分子中所处的位置及某些功能团上核素的相对数目。但是由于其造价非常昂贵，而且测定灵敏度较低，故极少用于15N同位素的肥料利用率研究。
中子活化分析是通过鉴别和测试样本因辐照感生的放射性核素的特征辐射，进行元素和核素分析的放射分析化学方法。该法的优点是灵敏度极高，准确度和精密度也很高，可测定元素范围广；但同样存在仪器价格昂贵，分析周期较长，操作技术复杂的缺陷，在15N同位素丰度的测量上鲜见报道。而且一般情况下，中子活化分析只能给出元素的量，不能测定元素的化学形态。
中红外吸收光谱法就是利用物质对中红外光区电磁辐射的选择性吸收来捕捉分子中有关基团结构定性、定量信息的分析方法。中红外吸收光谱法以其高度的特征性，固、液、气态样品均可用，且用量少、不破坏样品、分析速度快，已成为分析化学中结构定性、定量分析最成熟的手段之一。中红外吸收光谱特别适合于捕捉光谱同位素效应，因为绝大多数的有机化合物和很多无机化合物的化学键转动-振动的基频都出现在中红外区。由于同位素的核质量不同而使分子的转动和振动初始能态发生变化，由之引起分子光谱的谱线位移，所以每一种同位素分子都有其专属的转动-振动光谱。
物质对中红外辐射的吸收强度与物质含量的关系符合朗伯—比尔定律，所以中红外光谱可用于定量分析。但是中红外光子能量较低，传统光谱仪的检测器灵敏度也很低，限制了中红外光谱在定量分析中的广泛应用。随着计算机技术的深入发展，傅里叶变换红外光谱-(FTIR)技术逐渐成为红外光谱分析的重要工具。与传统色散型光谱仪相比，FTIR不需要分光，信号强，灵敏度很高；由于采用干涉仪，与扫描单色仪相比扫描速度提高了数百倍，而且干涉仪中没有狭缝的限制，其辐射通量比色散型仪器大得多。基于此类优点，FTIR特别适用于测量弱信号光谱，而且具有很高的灵敏度。凭借其高灵敏度、高分辨率、高信噪比、扫描迅速、光通量大、联机操作性强及高度计算机化的特点，FTIR推动经典中红外光谱技术的定性、定量分析能力取得了突破性进展。
由于朗伯-比尔定律具有可加性，对于有几个组分的混合物来说，如果每个组分都符合朗伯-比尔定律，那么混合物的中红外光谱是各个纯成分中红外光谱的叠加。由于中红外光谱的谱带较多，选择余地较大，有利于排除干扰找到对应每个组分的且不受其它组分吸收峰干扰的“独立峰”，基于“独立峰”的筛选和指认，定量分析可以通过直接测定混合物的中红外光谱来实现，从而简化了繁琐的制样过程。
目前基于中红外光谱技术的稳定同位素分析还处于初探阶段，大部分研究局限于光谱同位素效应的定性解析，少量的定量分析研究对象仅以简单气体化合物为主。而对于15N示踪植物体内15N同位素丰度的中红外光谱测量国内外还未见报道。然而，植物体内15N同位素丰度快速检测方法的研究，对于研究植物的营养、植物的生长生理、以及植物与环境的关系都具有极其重要的推动作用。尤其对于研究植物对氮素的吸收、运转、同化和代谢等过程以及与生态环境相互作用机理上将起到巨大的作用。相对传统15N同位素丰度检测法的破坏性实验而言，中红外光谱测量具有无损、快速、多组分同时检测的优点，可以准确而全面地对作物整个生长周期的氮吸收、利用的动态情况进行跟踪，并且可以减少因植物体间个体差异明显，采样点、采样频率和采样时机等随机性和偶然性因素所带来的影响。同时，中红外光谱技术能有效克服传统15N同位素分析法测量费用昂贵、分析测试耗时、采样数目偏少和检测周期长等缺陷。
发明内容
本发明提出了植物15N示踪同位素丰度的中红外光谱快速检测方法，为快速有效地监测植物体内15N同位素丰度的动态变化规律提供理论依据，有望实现植物15N示踪同位素丰度的快速、低成本测量。
发明提供一种快速测量植物15N示踪同位素丰度的方法，它包括：
①首先把待测植物样本烘干，然后在红外灯照射下把样本放入玛瑙研钵研磨成粒径小于20μm的粉末，按照1:20～49（质量比）的比例与干燥的溴化钾粉末混匀，使用压片机把混匀后的粉末制成约2mm的薄片，完成样本制备。
②把制备好的样本固定在支架上，放入中红外光谱仪的样品室，进行波数4000cm-1～400cm-1范围，分辨率为1cm-1的中红外透射光谱扫描，获取样本的中红外透射光谱。
③把样本的中红外透射光谱转换成吸光度，基于特征波数1235cm-1～1071cm-1和3475cm-1～3465cm-1处的吸光度，采用11点平均法提取得到16个特征变量，把这16个特征变量代入下式，即可计算得到植物样本的15N示踪同位素丰度。
Y=3.676e-03+3.543e-08x1+1.080e-07x2-4.259e-08x3-1.643e-07x4-2.913e-08x5
+3.106e-07x6-5.966e-08x7-3.084e-08x8-3.130e-07x9+3.647e-07x10-3.066e-07x11
+2.091e-08x12+9.052e-08x13+5.094e-08x14-9.086e-08x15+5.143e-08x16
其中：Y代表模型对样本的15N示踪同位素丰度的预测值；
x1代表样本在1235cm-1～1225cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x2代表样本在1224cm-1～1214cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x3代表样本在1213cm-1～1203cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x4代表样本在1202cm-1～1192cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x5代表样本在1191cm-1～1181cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x6代表样本在1180cm-1～1170cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x7代表样本在1169cm-1～1159cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x8代表样本在1158cm-1～1148cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x9代表样本在1147cm-1～1137cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x10代表样本在1136cm-1～1126cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x11代表样本在1125cm-1～1115cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x12代表样本在1114cm-1～1104cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x13代表样本在1103cm-1～1093cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x14代表样本在1092cm-1～1082cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x15代表样本在1081cm-1～1071cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x16代表样本在3475cm-1～3465cm-1的11个波数处吸光度的平均值。
本发明所测量的同位素丰度是相对丰度，即N15原子数目占所有氮原子（包括N15原子和N14原子）数目的百分含量。
本发明可测定植物包括水稻、油菜、番茄、小麦，茶叶、粗叶木、山矾、光叶山矾、华南省藤、山月桂、高山蒲葵、裂叶棕梅、锈毛新木姜子、九节、海南罗伞、平滑琼楠、中华厚壳桂、柏拉木、露兜草、蜜花山矾、斜茎盘算子、海南木莲、雄鸡树、海南杨桐、披针山矾、降真香、鸡毛松、残枝蒲桃、毛宁、白肉榕、大萼木姜子、燕尾葵、毛荔枝、油丹、桃榄中的15N示踪同位素丰度。
本发明与背景技术相比，具有以下特点：
（1）快速，中红外光谱技术具有特征性强、灵敏度高的优点，避免了传统15N同位素丰度测量的分离、提取等繁琐、耗时的样品制备过程。而其多通道优点，扫描速度快，可在1s内完成整个中红外波段范围（4000cm-1～400cm-1）的扫描，更大大加快了测量时间。
（2）低成本，中红外光谱仪与传统分析法所用的质谱仪、核磁共振仪等仪器设备相比，成本大大降低。
（3）具有良好的经济效益，传统的测量手段在取样、制样、测定等方面需要耗费大量的人力、财力、物力，本测量方法简单、使用方便，可以快速、准确的测量植物15N示踪同位素丰度，故具有良好的经济效益。
附图说明
图1是本发明方法流程图；
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步说明。
如图1所示，本发明方法具体包括以下步骤：
一、建立中红外光谱与植物15N示踪同位素丰度间的定量关系模型
①.15N同位素示踪下茶树的栽培。以茶树品种龙井43为研究对象，采用盆栽法，每盆栽4株1年生无性系茶苗，栽后修剪，进行正常的水分管理和病虫防治及防冻措施。用15N标记尿素为氮源，采用丰度分别为8%，5%，4%和2%尿素形成4个水平的氮示踪梯度和一个空白试验对照（即施用非15N标记的普通尿素），每个梯度设计处理4盆样品，每盆搭配施入0.6g磷和0.6g钾，肥料于春季分两次施下，间隔1月。
②.收集15N示踪茶树样本。施肥后30天、60天、90天、120天分别取样，每次取各盆中一株，4次重复。取样时，按盆连同根系取出整株植株，并拣净落在土壤中的根系，然后分株按根、茎、叶等器官取样，共得到67个样本。于80℃烘箱内烘至恒重，在红外灯照射下用玛瑙研钵研磨成粒径小于20μm的粉末，然后按1:49的比例把粉末与溴化钾磨细混匀，用钢铲把磨细混匀的粉末约0.05g移入压片模具，把压片模具水平放置在压片机座上，施加20t/cm2的压力，得到厚度约2mm的样本薄片。
③.获取样本的中红外吸收光谱。把制备好的样本薄片固定在支架上，放入中红外光谱仪的样本室，中红外光谱仪的光谱采集范围是4000cm-1～400cm-1,光谱分辨率为1cm-1，光谱采集时室温为25℃左右，湿度小于65%，每个样本的光谱是64次扫描的平均值，采集样本的透射光谱。把样本的透射光谱，按照公式“吸光度=2-log(透过率%)”的数学变换得到样本的中红外吸收光谱如图2所示。随后用质谱法测量样本的15N同位素丰度。
④.基于粒子群优化法捕捉植物N15同位素丰度的中红外光谱特征波数。基于粒子群优化法对示踪植物的N15同位素丰度的特征波数进行优化和筛选，由于4000cm-1～400cm-1范围共3601个波数变量，故设定对应的优化矩阵为1行3601列的二进制代码矩阵，优化矩阵中向量取值为0或1,0代表所对应的波数为非特征波数，1代表所对应的波数为特征波数。优化矩阵中所有为1的向量对应的波数成为特征波数组合，以这些特征波数的吸光度作为自变量，N15同位素丰度作为因变量，建立多元线性回归模型。粒子群优化的目标函数是多元线性回归模型的均方根误差最小。当均方根误差最小时对应粒子群优化法寻找得到的最优特征波数。研究发现，对于植物N15同位素丰度测量的特征波数为1235cm-1～1071cm-1和3475cm-1～3465cm-1。
⑤.建立样本中红外光谱与15N同位素丰度之间的定量关系模型。基于样本的中红外吸收光谱，获得样本在特征波数处（1235cm-1～1071cm-1和3475cm-1～3465cm-1）的吸光度，采用11点平均法提取得到16个特征变量，依据朗伯-比尔定律，应用多元线性回归算法建立这16个特征变量与15N同位素丰度的定量关系模型。模型的数学表达式如下所示：
Y=3.676e-03+3.543e-08x1+1.080e-07x2-4.259e-08x3-1.643e-07x4-2.913e-08x5
+3.106e-07x6-5.966e-08x7-3.084e-08x8-3.130e-07x9+3.647e-07x10-3.066e-07x11
+2.091e-08x12+9.052e-08x13+5.094e-08x14-9.086e-08x15+5.143e-08x16
其中：Y代表模型对样本的15N同位素丰度的预测值；
x1代表样本在1235cm-1～1225cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x2代表样本在1224cm-1～1214cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x3代表样本在1213cm-1～1203cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x4代表样本在1202cm-1～1192cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x5代表样本在1191cm-1～1181cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x6代表样本在1180cm-1～1170cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x7代表样本在1169cm-1～1159cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x8代表样本在1158cm-1～1148cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x9代表样本在1147cm-1～1137cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x10代表样本在1136cm-1～1126cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x11代表样本在1125cm-1～1115cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x12代表样本在1114cm-1～1104cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x13代表样本在1103cm-1～1093cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x14代表样本在1092cm-1～1082cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x15代表样本在1081cm-1～1071cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x16代表样本在3475cm-1～3465cm-1的11个波数处吸光度的平均值。二、基于植物15N示踪同位素丰度的中红外光谱测量模型对未知样本的15N示踪同位素丰度进行测定
基于所建立的植物15N示踪同位素丰度的中红外光谱测量模型对67个样本的预测相关系数为0.719，均方根误差为2.752e-09,标准均方根误差为7.488e-05%。具体预测结果如表1所示。说明该测量模型能够实现植物15N示踪同位素丰度的快速检测。
表1、模型对于67个样本的预测结果
| 样本号 | 真实值 | 预测值 |
| （1） | 0.003675989106297490 | 0.003675988578237590 |
| （2） | 0.003675990036688740 | 0.003675994336605070 |
| （3） | 0.003675984906964000 | 0.003675988879986110 |
| （4） | 0.003675997027195990 | 0.003675994713790710 |
| （5） | 0.003675994940102100 | 0.003675992827862500 |
| （6） | 0.003675987949594850 | 0.003675990740768610 |
| （7） | 0.003675984906964000 | 0.003675986465997990 |
| （8） | 0.003675987019203600 | 0.003675986818037930 |
| （9） | 0.003675990967079990 | 0.003675993833690880 |
| （10） | 0.003675994940102100 | 0.003675990539602930 |
| （11） | 0.003675986088812350 | 0.003675990112125870 |
| （12） | 0.003675993054173880 | 0.003675993355922400 |
| （13） | 0.003675994940102100 | 0.003675986893475050 |
| （14） | 0.003675989106297490 | 0.003675989408046010 |
| （15） | 0.003675994940102100 | 0.003675994437187910 |
| （16） | 0.003675993054173880 | 0.003675996071659030 |
| （17） | 0.003675994940102100 | 0.003675995241850610 |
| （18） | 0.003675994009710850 | 0.003675993984565140 |
| （19） | 0.003675996096804740 | 0.003675994261167940 |
| （20） | 0.003675994009710850 | 0.003675992098636920 |
| （21） | 0.003675996096804740 | 0.003675995795056220 |
| （22） | 0.003675997957587240 | 0.003675993909128010 |
| （23） | 0.003676000044681130 | 0.003675995744764800 |
| （24） | 0.003675993054173880 | 0.003675989282317460 |
| （25） | 0.003675994940102100 | 0.003675992098636920 |
| （26） | 0.003675996096804740 | 0.003675992450676860 |
| （27） | 0.003675994940102100 | 0.003675994562916450 |
| （28） | 0.003675991897471250 | 0.003675993531942360 |
| （29） | 0.003675994009710850 | 0.003675994889810680 |
| （30） | 0.003675997027195990 | 0.003675998284481460 |
| （31） | 0.003675997027195990 | 0.003675997932441530 |
| （32） | 0.003675997027195990 | 0.003675998359918590 |
| （33） | 0.003675998887978490 | 0.003675995116122060 |
| （34） | 0.003675993054173880 | 0.003675991847179830 |
| （35） | 0.003675993054173880 | 0.003675993582233780 |
| （36） | 0.003675991897471250 | 0.003675993481650950 |
| （37） | 0.003675994940102100 | 0.003675993909128010 |
| （38） | 0.003675990036688740 | 0.003675994814373550 |
| （39） | 0.003676000975072380 | 0.003676001754589370 |
| （40） | 0.003675997027195990 | 0.003675993682816620 |
| （41） | 0.003676000044681130 | 0.003675999089144170 |
| （42） | 0.003675996096804740 | 0.003675996247678990 |
| （43） | 0.003675991897471250 | 0.003675992199219760 |
| （44） | 0.003675998887978490 | 0.003675996297970410 |
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Claims (1)
1.基于中红外光谱的植物15N示踪同位素丰度快速检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤1.把待测植物样本烘干，然后在红外灯照射下把样本放入玛瑙研钵研磨成粒径小于20μm的粉末，按照质量比1:20～49的比例与干燥的溴化钾粉末混匀，使用压片机把混匀后的粉末制成约2mm的薄片，完成样本制备；
步骤2.把制备好的样本固定在支架上，放入中红外光谱仪的样品室，进行波数4000cm-1～400cm-1范围，分辨率为1cm-1的中红外透射光谱扫描，获取样本的中红外透射光谱；
步骤3.把样本的中红外透射光谱转换成吸光度，基于特征波数1235cm-1～1071cm-1和3475cm-1～3465cm-1处的吸光度，采用11点平均法提取得到16个特征变量，把这16个特征变量代入下式，即可计算得到植物样本的15N示踪同位素丰度Y，
Y=3.676e-03+3.543e-08x1+1.080e-07x2-4.259e-08x3-1.643e-07x4-2.913e-08x5
+3.106e-07x6-5.966e-08x7-3.084e-08x8-3.130e-07x9+3.647e-07x10-3.066e-07x11
+2.091e-08x12+9.052e-08x13+5.094e-08x14-9.086e-08x15+5.143e-08x16
其中：Y代表模型对样本的15N示踪同位素丰度的预测值；
x1代表样本在1235cm-1～1225cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x2代表样本在1224cm-1～1214cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x3代表样本在1213cm-1～1203cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x4代表样本在1202cm-1～1192cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x5代表样本在1191cm-1～1181cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x6代表样本在1180cm-1～1170cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x7代表样本在1169cm-1～1159cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x8代表样本在1158cm-1～1148cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x9代表样本在1147cm-1～1137cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x10代表样本在1136cm-1～1126cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x11代表样本在1125cm-1～1115cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x12代表样本在1114cm-1～1104cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x13代表样本在1103cm-1～1093cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x14代表样本在1092cm-1～1082cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x15代表样本在1081cm-1～1071cm-1的11个波数处吸光度的平均值；
x16代表样本在3475cm-1～3465cm-1的11个波数处吸光度的平均值。
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