CN102230894B - 15n示踪尿素同位素丰度的红外光谱快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种15N示踪尿素同位素丰度的红外光谱快速检测方法。传统的检测方法速度慢且操作复杂。本发明首先把待测15N示踪尿素研磨成粉末样本，然后将粉末样本与溴化钾后压片，完成样本制备。然后将制备好的样本进行的红外透射光谱扫描，得到样本的透射光谱，再把样本透射光谱换算为吸光度光谱。最后将样本在波数分别为3411cm-1，3175cm-1,1697cm-1,1656cm-1,1628cm-1,1601cm-1,1478cm-1和1442cm-1处的吸光度，代入公式，即可得到样本的同位素丰度
。本发明使用方便，可以快速、有效的测量15N示踪尿素同位素丰度，故具有良好的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于信息检测技术领域，涉及一种15N示踪尿素同位素丰度的红外光谱快速检测方法。
背景技术
氮是植物必需的营养元素，是作物施肥三要素之首，氮肥占我国化肥消费比重达60%左右。目前我国占世界7%的耕地上消耗着全球35%的氮肥，氮肥的过量施用给我国的农业生产和生态环境带来了巨大危害。中国每年因不合理施肥造成近1000万吨的氮素流失，直接经济损失约300亿元。而且由于氮肥利用率低下，有60%左右进入环境。因而过量施氮已成为威胁中国长期粮食安全和环境安全的重大问题。减少氮肥施用量的关键是提高氮肥利用率，而15N同位素示踪（标记）法是目前唯一能直接反映作物对氮肥实际利用情况的方法。15N同位素示踪技术的关键是要对15N同位素丰度的动态变化进行跟踪和检测。但是目前15N同位素分析测量仪器昂贵、成本高、操作繁琐、耗时长、需要大量化学试剂，难以满足农业生产经济、高效的要求。
目前15N同位素丰度测量的方法有质谱法、15N发射光谱法、核磁共振法和中子活化分析等，其中应用较多的是质谱法。
质谱法是通过测量各种物质的原子或原子团的荷质比来确定被测原子或原子团的性质和质量，具有高灵敏度及精确度的特征，广泛用于同位素的实验室测量。但是这种方法所采用的仪器价格昂贵、系统庞大、操作复杂，样品制备繁琐，操作过程引入污染。且最终的结果只能给出元素的量，不能测定元素的化学形态，这限制了质谱法在农业生产中的应用。
15N发射光谱法需要将样品转化成氮气（N2），然后用适当方法来激发氮分子发光，得到氮的光谱。随着组成氮分子的氮原子质量数不同而使氮的光谱波长发生位移，利用这一现象来测定15N同位素丰度。与质谱法相比，15N发射光谱法不需要昂贵的仪器设备，操作相对简便，并能测定含氮量为微克级的样品。但是，有些元素的原子很难激发，而且有机物一般是大分子，组成复杂，激发后谱线杂乱难以分析，限制了15N发射光谱法的应用。
核磁共振法是利用1-102兆赫的电磁波照射置于强磁场中的样品，样品中的某些原子核在特定的磁场强度下，与照射电磁波发生共振现象，产生强弱不同的吸收信号。以此来判明某些核素在分子中所处的位置及某些功能团上核素的相对数目。但是由于其造价非常昂贵，而且测定灵敏度较低，故极少用于15N同位素的肥料利用率研究。
中子活化分析是通过鉴别和测试样本因辐照感生的放射性核素的特征辐射，进行元素和核素分析的放射分析化学方法。该法的优点是灵敏度极高，准确度和精密度也很高，可测定元素范围广；但同样存在仪器价格昂贵，分析周期较长，操作技术复杂的缺陷，在15N同位素丰度的测量上鲜见报道。而且一般情况下，中子活化分析只能给出元素的量，不能测定元素的化学形态。
目前基于红外光谱技术的稳定同位素分析还处于初探阶段，大部分研究局限于光谱同位素效应的定性解析，少量的定量分析研究对象仅以简单气体化合物为主。而对于示踪肥料中15N示踪原子的红外光谱测量国内外还未见报道。然而，快速有效的检测示踪肥料中15N同位素丰度，对于研究肥料的有效性、肥料与作物间的关系、以及评价肥料对农业生态环境的影响有重要的意义。相对传统15N同位素丰度检测法的破坏性实验而言，红外光谱测量具有无损、快速、多组分同时检测的优点，可以准确地对作物整个生长周期的氮吸收、利用的动态情况进行跟踪，并且可以全面反应肥料的吸收、利用、代谢规律，进而准确的评价肥料在作物生长过程中发挥的作用。同时，红外光谱技术能有效克服传统15N同位素分析法测量费用昂贵、分析测试耗时、采样数目偏少和检测周期长等缺陷。
发明内容
本发明提出了15N示踪尿素同位素丰度的红外光谱快速、无损检测方法，为快速有效地监测农业生产中尿素的吸收、利用情况以及动态变化规律提供理论依据，有望实现15N示踪尿素同位素丰度的快速、低成本测量。
本发明方法包括以下步骤：
首先把待测15N示踪尿素在红外灯照射下用玛瑙研钵研磨成粒径小于20μm的粉末样本，然后将粉末样本与溴化钾按照质量比1:10～49充分研磨混匀，把混匀后的粉末放入压片磨具里，把压片磨具水平放置于压片机座上，加压，得到样本薄片，完成样本制备。
然后将制备好的样本固定在支架上放入样品室，进行4000 cm-1～400 cm-1范围的红外透射光谱扫描，得到样本的透射光谱，再把样本透射光谱换算为吸光度光谱。
最后基于样本的吸光度光谱得到样本在波数分别为3411cm-1， 3175cm-1,1697cm-1,1656cm-1,1628cm-1,1601cm-1,1478cm-1和1442cm-1处的吸光度，代入公式 
，即可得到样本的同位素丰度
。
本发明与背景技术相比，具有以下特点：
1.快速，红外光谱扫描速度快，可在1s内完成整个红外波段范围（4000cm-1～400cm-1）的扫描。
2．简单，本发明方法步骤少、操作简单，避免了传统15N同位素丰度测量的气化、分离等繁琐、耗时的样品制备过程。
3.低成本，红外光谱仪与传统分析法所用的质谱仪、核磁共振仪等仪器设备相比，测量成本大大降低。
4.具有良好的经济效益，传统的测量手段在取样、制样、测定等方面需要耗费大量的人力、财力、物力，本测量方法使用方便，可以快速、有效的测量15N示踪尿素同位素丰度，故具有良好的经济效益。
附图说明
图1是本发明方法流程图；
图2 是15N示踪尿素的红外吸收光谱图；
图3是模型1的回归曲线图；
图4是模型3对于99个建模样本的测量结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步说明。
如图1所示，本发明方法具体包括以下步骤：
①15N示踪尿素的样本制备。把15N示踪尿素放入玛瑙研钵，在红外灯照射下充分研磨成粒径小于20μm的粉末，称取粉末样本0.01克与0.1～0.049克干燥溴化钾粉末研磨混匀，用钢铲把磨细混匀的粉末移入压片模具，把压片模具水平放置在压片机座上，施加10t/cm2力压模具，得到样本薄片。
②样本的光谱获取。把制备好的样本薄片固定在支架上，放入红外光谱仪的样本室，红外光谱仪的光谱采集范围是4000 cm-1～400 cm-1,光谱分辨率为1cm-1，光谱采集室温在25℃左右，湿度小于65%，每个样本的光谱是64次扫描的平均值，采集样本的透射光谱。
③样本同位素丰度的测量。把样本的透射光谱，按照公式“吸光度=2-log(透过率%)”的数学变换得到样本的吸收光谱，如图2所示。基于99个已知15N同位素丰度的标准尿素样本（购于上海化工研究院）的红外吸收光谱，运用偏最小二乘回归算法建立红外吸收光谱与15N同位素丰度之间的定量关系模型。运用全波段4000 cm-1～400 cm-1范围的红外吸收光谱建立测量模型1，模型1的决定系数为0.981，误差均方根为3.92,标准均方根误差为3.3%。进一步分析模型1的回归曲线，如图所示3，图3显示回归曲线在波数3493，3411，3307，3175，1697，1656，1628，1601，1478和1442cm-1处有较大的回归系数绝对值，表明这十个波数是15N同位素丰度的特征吸收峰，基于这十个波数处的吸光度建立多元线性回归模型2，并对模型2进行方差分析，方差分析结果如表1所示，表1显示波数变量
（样本在波数3493cm-1处的光谱吸光度）和（样本在波数3307cm-1处的光谱吸光度）的显著性水平P>0.05,表明波数变量
和
与因变量
(15N同位素丰度)无显著相关性，故波数3493和3307 cm-1不适用于建立15N同位素丰度的测量模型。于是剔除波数3493和3307 cm-1，基于余下的八个波数3411, 3175, 1697, 1656, 1628,1601,1478和1442cm-1建立测量模型3，模型3的线性计算公式为：
，
式中：
代表模型对样本的15N同位素丰度的预测值；
代表样本在波数3411cm-1处光谱的吸光度；
代表样本在波数3175cm-1处光谱的吸光度；
代表样本在波数1697cm-1处光谱的吸光度；
代表样本在波数1656cm-1处光谱的吸光度；
代表样本在波数1628cm-1处光谱的吸光度；
代表样本在波数1601cm-1处光谱的吸光度；
代表样本在波数1478cm-1处光谱的吸光度；
代表样本在波数1442cm-1处光谱的吸光度。
模型3的方差分析如表2所示，模型3的显著性水平P=0，表明模型3与因变量
(15N同位素丰度)显著相关；而且波数变量
，
，
，
，
，，
和
的显著性水平P值都小于0.05，表明这八个变量与因变量
(15N同位素丰度)显著相关，表明这八个波数适用于建立15N同位素丰度的测量模型。模型3对于99个建模样本的测量效果如图4所示，建模决定系数为0.985，均方根误差为3.02，标准均方根误差2.8%。表明模型3可用于15N同位素丰度的测量。
收集15N同位素丰度分别为0%（普通尿素），1%，2%，4%，5%，10%，20%，30%，40%，50%，99%的68个样本，进行光谱扫描，获取样本在波数3411，3175,1697,1656,1628,1601,1478和1442cm-1处的吸光度，代入测量公式：
得到样本的15N同位素丰度，该模型对这68个样本的预测结果如表3所示，模型的预测决定系数为0.986，均方根误差为3.23，标准均方根误差为3%。说明该模型能够实现15N示踪尿素的同位素丰度快速检测。
表1. 模型2的方差分析
| 离均差平方和 | 自由度 | 方差 | F值 | P值 | 回归系数 | |
| 模型 | 6.157e+04 | 10 | 6.157e+03 | 624.109 | 0.0000 | |
| 误差 | 838.555 | 85 | 9.865 | |||
| 总和 | 6.241e+04 | 95 | 656.938 | |||
| 截距 | 383.840 | 1 | 383.840 | 38.908 | 0.0000 | -204.102 |
 |
15.994 | 1 | 15.994 | 1.621 | 0.2064 | -17.001 |
 |
122.089 | 1 | 122.089 | 12.376 | 0.0007 | 43.497 |
 |
29.858 | 1 | 29.858 | 3.027 | 0.0855 | 26.145 |
 |
130.642 | 1 | 130.642 | 13.243 | 0.0005 | 26.020 |
 |
58.502 | 1 | 58.502 | 5.930 | 0.0170 | 24.830 |
 |
75.487 | 1 | 75.487 | 7.652 | 0.0070 | -31.065 |
 |
153.664 | 1 | 153.664 | 15.576 | 0.0002 | -39.093 |
 |
451.120 | 1 | 451.120 | 45.728 | 0.0000 | 59.474 |
 |
206.370 | 1 | 206.370 | 20.919 | 0.0000 | -76.377 |
 |
288.383 | 1 | 288.383 | 29.232 | 0.0000 | 97.550 |
表2. 模型3的方差分析
| 离均差平方和 | 自由度 | 方差 | F值 | P值 | 回归系数 | |
| 模型 | 6.153e+04 | 8 | 7.692e+03 | 763.557 | 0.0000 | |
| 误差 | 876.383 | 87 | 10.073 | |||
| 总和 | 6.241e+04 | 95 | 656.938 | |||
| 截距 | 455.129 | 1 | 455.129 | 45.181 | 0.0000 | -205.687 |
 |
266.425 | 1 | 266.425 | 26.448 | 0.0000 | 45.998 |
 |
213.315 | 1 | 213.315 | 21.176 | 0.0000 | 30.962 |
| 43.777 | 1 | 43.777 | 4.346 | 0.0400 | 19.130 | |
 |
114.519 | 1 | 114.519 | 11.369 | 0.0011 | -34.657 |
 |
160.254 | 1 | 160.254 | 15.909 | 0.0001 | -39.889 |
| 1.404e+03 | 1 | 1.404e+03 | 139.387 | 0.0000 | 69.470 | |
 |
279.192 | 1 | 279.192 | 27.716 | 0.0000 | -85.387 |
 |
402.839 | 1 | 402.839 | 39.991 | 0.0000 | 107.046 |
表3. 模型3对于68个未知样本的15N同位素丰度预测结果
| 实际值 | 预测值 | 实际值 | 预测值 | 实际值 | 预测值 | 实际值 | 预测值 |
| 0 | -0.519 | 5 | 5.156 | 20 | 17.796 | 40 | 42.853 |
| 0 | -1.665 | 5 | 6.731 | 20 | 17.612 | 40 | 39.838 |
| 0 | -2.823 | 5 | 4.778 | 20 | 17.067 | 40 | 45.083 |
| 1 | 0.562 | 10 | 10.51 | 20 | 18.871 | 50 | 45.268 |
| 1 | 1.263 | 10 | 11.15 | 30 | 23.697 | 50 | 47.963 |
| 1 | 1.263 | 10 | 12.585 | 30 | 26.07 | 50 | 53.094 |
| 2 | 2.563 | 10 | 13.585 | 30 | 29.998 | 50 | 47.472 |
| 2 | 2.969 | 10 | 13.131 | 30 | 33.53 | 50 | 45.308 |
| 2 | 2.592 | 10 | 14.351 | 30 | 34.404 | 50 | 53.572 |
| 2 | 2.826 | 10 | 13.247 | 30 | 37.237 | 50 | 51.2 |
| 4 | 3.376 | 10 | 12.389 | 30 | 30.461 | 50 | 49.821 |
| 4 | 3.659 | 10 | 14.526 | 30 | 34.249 | 98 | 87.275 |
| 4 | 4.352 | 20 | 18.57 | 30 | 35.107 | 98 | 93.987 |
| 5 | 4.376 | 20 | 17.393 | 40 | 35.477 | 98 | 104.838 |
| 5 | 6.279 | 20 | 17.699 | 40 | 37.362 | 98 | 97.159 |
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Claims (1)
1.15N示踪尿素同位素丰度的红外光谱快速检测方法，适用于15N双标记尿素，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤1.把待测15N示踪尿素在红外灯照射下用玛瑙研钵研磨成粒径小于20μm的粉末样本，然后将粉末样本与溴化钾按照质量比1:10～49充分研磨混匀，把混匀后的粉末放入压片磨具里，把压片磨具水平放置于压片机座上，加压，得到样本薄片，完成样本制备；
步骤2.将制备好的样本固定在支架上放入样品室，进行4000 cm-1～400 cm-1范围的红外透射光谱扫描，得到样本的透射光谱，再把样本透射光谱换算为吸光度光谱；
步骤3.基于样本的吸光度光谱得到样本在波数分别为3411cm-1,3175cm-1,1697cm-1,1656cm-1,1628cm-1,1601cm-1,1478cm-1和1442cm-1处的吸光度，代入公式 
，即可得到样本的同位素丰度
。
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