CN103558214B

CN103558214B - 缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法

Info

Publication number: CN103558214B
Application number: CN201310538431.9A
Authority: CN
Inventors: 赵莘; 段丽娟; 高健; 李洁; 李俊清
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2013-11-04
Filing date: 2013-11-04
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2033-11-04
Also published as: CN103558214A

Abstract

本发明提供了缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，该方法包括以没食子酸为多酚类物质标准品绘制标准曲线、缺苞箭竹中多酚类物质的样品溶液制备及缺苞箭竹样品中多酚类物质含量的测定三个步骤，本发明提供的方法，检测限低、准确度高、重现性好、精密高。

Description

缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，尤其涉及福林酚法测定缺苞箭竹中多酚类物质含量的方法。

背景技术

大熊猫被誉为“活化石”，为我国国家一级保护动物，是世界野生动物保护的旗舰物种，随着环境的改变和数千年的演化与适应，其逐渐转化为以亚高山竹类为主食的植食性动物，主食竹为缺苞箭竹。

大熊猫的主食竹中含有较高含量的多酚类物质，研究人员认为，植物多酚会对动物产生阻食和降低消化率的作用，因此，竹子中多酚类物质的含量会影响大熊猫的取食利用及采食量，但目前，科研人员对竹子中，尤其缺苞箭竹中多酚类物质含量的检测方法研究很少，尚未建立起对缺苞箭竹中多酚类物质的含量检测方法。

目前仅有对其它植物或药物制剂中多酚类物质含量检测方法的报道，如中国专利CN103076425A和中国专利CN102590435A中公开了一种破布木果的质量检测方法，采用福林酚-酚法测定破布木果中多酚的含量，但是不同的植物品种间细胞结构有所差别，而且多酚含量相差巨大，因此在不同的植物品种间多酚的提取方法、提取和检测条件也无相互借鉴价值。因此，对于大熊猫主食竹缺苞箭竹中多酚类物质的含量检测方法尚待建立。

发明内容

为了解决上述问题，本发明人经锐意研究，结果发现：缺苞箭竹粉末可被60～80%的乙醇溶液在60～80℃回流1～3小时的条件下提取出大量的多酚类物质而不会过量引入杂质；本发明人经探索，确定Na₂CO₃溶液浓度为5～15%，福林酚试剂与Na₂CO₃溶液体积比为1∶0.25～8，样品溶液与福林酚试剂的体积比为1∶0.5～10，1∶0.5～10，显色时间为5～30min，显色温度为10～45℃，检测波长为410～900nm的条件下，可以使溶液的吸光度值在0.1～0.8之间，并且，以没食子酸为标准品所做的标准曲线线性良好，相关系数R²＞0.99，因此，本发明通过上述方法对大熊猫主食竹缺苞箭竹中多酚类物质进行提取并进行含量测定，再通过回归方程和稀释定律计算出缺苞箭竹中多酚类物质的含量，从而完成本发明。

本发明的目的在于提供以下几方面：

第一方面，本发明提供缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，包括：

（1）以没食子酸为多酚类物质标准品绘制标准曲线：

配制浓度为80～120μg/mL的没食子酸标准溶液，以梯度体积量取上述没食子酸标准溶液，分别移至容量瓶内，配制成没食子酸系列标准溶液，按没食子酸系列标准溶液体与福林酚试剂积比1∶0.5～10向没食子酸系列标准溶液中分别加入等量的福林酚试剂，5分钟后向加入福林酚试剂后的没食子酸系列标准溶液中按福林酚试剂与Na₂CO₃溶液体积比1∶0.25～8分别加入等量的Na₂CO₃溶液，静置5～30分钟后用高纯水定容，配制成为标准曲线溶液，在显色温度为10～45℃的条件下，静置显色25～250分钟；用紫外-可见分光光度计在检测波长410～900nm测定标准曲线溶液的吸光度，并将测得的吸光度值绘制成为标准曲线，使其回归方程为一次函数，并且相关系数R²＞0.99；

其中，

所述Na₂CO₃溶液的重量分数为5～15%；

所述高纯水为去离子水或二次蒸馏水；

（2）缺苞箭竹中多酚类物质的样品溶液制备，包括以下子步骤：

（2-1）将缺苞箭竹粉碎，过60～80目的筛子筛分，得到缺苞箭竹粉末；

（2-2）称取（2-1）中制得的缺苞箭竹粉末，置于提取容器中，按重量比1∶10～30的比例加入重量分数为60～80%乙醇溶液），在回流温度60～80℃下回流1～3小时；

（2-3）将（2-2）中回流后的固液混合物，在转速为3000～5000r/min、温度为10～30℃的条件下，离心5～15分钟；

（2-4）将（2-3）中离心后的固液混合物减压过滤，将滤液转移至容量瓶中，用高纯水定容，制备成为样品溶液，按样品溶液与福林酚试剂体积比1∶0.5～10向样品溶液中加入福林酚试剂，5分钟后向加入福林酚试剂后的样品溶液中按福林酚试剂与Na₂CO₃溶液体积比1∶0.25～8加入Na₂CO₃溶液，静置5～30分钟后用高纯水定容，在显色温度为10～45℃的条件下，静置显色25～250分钟配制缺苞箭竹样品待测溶液，待用；

（3）缺苞箭竹样品中多酚类物质含量的测定：

用绘制标准曲线时使用的紫外-可见分光光度计测定（2-4）中制备的缺苞箭竹样品待测溶液的吸光度值，该吸光度值在标准曲线上所对应的浓度值即为缺苞箭竹样品待测溶液中多酚类物质的浓度，即C_稀释液，再通过下式换算出缺苞箭竹中多酚类物质的含量，即C_原样品，

C_原样品=C_稀释液×V_稀释液/V_原样品

其中，

C_稀释液是指（2-4）中制备的缺苞箭竹样品待测溶液中多酚类物质的浓度；

V_稀释液是指（2-4）中制备的缺苞箭竹样品待测溶液的体积；

C_原样品是指（2-4）中制备的样品溶液中多酚类物质的浓度；

V_原样品是指（2-4）中制备的样品溶液的体积。

第二方面，本发明提供上述缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，步骤（2-2）中，

所述缺苞箭竹粉末与乙醇溶液的重量比为1∶15～25；

所述乙醇溶液的重量分数为65～75%；

所述回流温度为65～75℃；

所述回流时间为1.5～2.5小时。

第三方面，本发明提供上述缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，步骤（2-2）中，

所述缺苞箭竹粉末与乙醇溶液的重量比为1∶20；

所述乙醇溶液的重量分数为70%。

第四方面，本发明提供上述测缺苞箭竹中多酚类物质含量的方法，其特征在于，步骤（2-3）中，

所述的转速为4000r/min；

温度为25℃；

离心时间为8～12分钟。

第五方面，本发明提供上述测缺苞箭竹中多酚类物质含量的方法，其特征在于，所述Na₂CO₃溶液的重量分数为8～12%。

第六方面，本发明提供上述测缺苞箭竹中多酚类物质含量的方法，其特征在于，所述福林酚试剂与Na₂CO₃溶液的体积比为1∶4～6。

第七方面，本发明提供上述缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，所述试样溶液与福林酚试剂的体积比为1∶2～6。

第八方面，本发明提供上述缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，所述多酚类物质含量的检测条件中显色温度为20～40℃。

第九方面，本发明提供上述缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，所述多酚类物质含量的检测条件中显色时间为60～150分钟。

第十方面，本发明提供上述缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，步骤（1）中所述检测波长为650～800nm。

本发明提供的缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，具有如下有益效果：

（1）本发明提供的方法，从缺苞箭竹中提取多酚类物质的步骤中所用的多酚类物质提取溶剂容易获得，提取方法简便，成本低；

（2）本发明提供的缺苞箭竹中多酚类物质的检测方法，均能实现良好的准确度和重现性；

（3）本发明提供的方法中所绘制的多酚类物质的标准曲线，具有稳定性和普适性，可使用该曲线进行多个样本的含量检测，有效的避免了重复性劳动，节约了时间和人工成本；

（4）本发明提供的方法，检测限低，灵敏度高，能有效检测样品中较低浓度的多酚类物质的含量；

（5）本发明提供的方法，精密度高，稳定性好，对缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定准确。

具体实施方式

以下通过具体实施方式进一步解释或说明本发明内容，但实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。

多酚类物质为酚类物质的一个重要类群，其特殊的化学结构导致其具有独特的生理活性和生态学意义，尤其在天然植物中，多酚类物质作为自我保护性次生代谢产物，对动物的摄食量具有重要意义。

植物中多酚类物质可与口腔内蛋白质以氢键或疏水键相结合，当口腔中多酚类物质含量较高时，口腔上皮细胞受到刺激而产生收缩、折皱等一系列复杂的变化，使其在被食用时产生不良的味觉，即涩味，降低食物的适口性；同时，多酚类物质能够降低动物的消化速率，并与动物肠道的外层细胞发生结合，降低肠壁的可透性，使动物大脑将其理解为“饱觉”，从而抑制动物对其的摄食量。

此外，多酚类物质能够与食物中的蛋白质相结合，形成不易消化的化合物，使蛋白质不容易被胃酸分解吸收，从而降低动物对蛋白质的利用率；同时，多酚类物质能够与动物消化道内的相应的消化酶，如纤维素酶，相结合，抑制酶活性从而阻碍动物对纤维素、淀粉和脂肪等的消化，进而导致动物的营养不良。

通常，在动物中不会发生多酚类物质中毒的情况，只会因为食物的口感差和厌食效应而减少对多酚类物质含量较高的食物的摄食量，但当动物食性较为单一，而其食物中多酚类物质含量过高时，就有产生中毒的可能，严重时可导致动物死亡。而“活化石”—熊猫，我国国家一级保护动物，其食性就较为单一，其主食竹为缺苞箭竹，因此缺苞箭竹中多酚类物质的含量对熊猫的生存质量显得尤为重要，因此本发明建立了一种采用福林酚法测定缺苞箭竹中多酚类物质含量的方法。

多酚类物质的分子上含有多个极易被氧化的羟基，福林酚试剂中的钨钼酸可以将多酚类物质上的羟基定量氧化，而其自身则被还原，在碱性条件下生成蓝色化合物，而且其颜色的深浅程度与原多酚类物质的含量呈正相关，并在一定条件下遵从Lambert-Beer定律，即，被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比，由此可以通过福林酚法测定缺苞箭竹中多酚类物质的总量。

没食子酸，是典型的多酚类物质，其结构如下所示，具有3个酚羟基，是一种结构简单的多酚类物质，其结构稳定，以没食子酸为标准品所做的标准曲线线性良好，相关系数R²＞0.99，而且其线性范围在适宜缺苞箭竹中多酚类物质的含量检测，同时，没食子酸价廉易得，因此在本发明中选用没食子酸作为检测缺苞箭竹中多酚类物质的标准品。

在本发明中提供了一种缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其中各步骤如下：

（1）以没食子酸为多酚类物质标准品绘制标准曲线：

配制浓度为80～120μg/mL的没食子酸标准溶液，以梯度体积量取上述没食子酸标准溶液，分别移至容量瓶内，配制成没食子酸系列标准溶液，按没食子酸系列标准溶液与福林酚试剂体积比1∶0.5～10，优选1∶2～6向没食子酸系列标准溶液中分别加入等量的福林酚试剂，5分钟后向加入福林酚试剂后的没食子酸系列标准溶液中按福林酚试剂与Na₂CO₃溶液体积比1∶0.25～8，优选1∶4～6，分别加入等量重量分数为5～15%的Na₂CO₃溶液，静置5～30分钟后用高纯水定容，配制成为标准曲线溶液，在显色温度为10～45℃，优选20～40℃的条件下，静置显色25～250分钟，优选60～150分钟；用紫外-可见分光光度计在检测波长410～900nm，优选650～800nm测定标准曲线溶液的吸光度，并将测得的吸光度值绘制成为标准曲线，使其回归方程为一次函数，并且相关系数R²＞0.99；

其中，

所述高纯水为去离子水或二次蒸馏水；

以梯度体积比对试样溶液与福林酚试剂体积比进行选择，选择显色完全且趋于稳定的体积比为最佳试样溶液与福林酚试剂体积比，选择1∶0.5～10，优选1∶2～6；

以梯度体积比对福林酚试剂与Na₂CO₃溶液体积比进行选择，选择显色完全且趋于稳定的体积比为最佳对Na₂CO₃溶液与福林酚试剂体积比，选择1∶0.25～8，优选1∶4～6；

以空白为基底，用紫外-可见分光光度计在410～900nm波长范围内对样品溶液和没食子酸标准溶液进行吸光度扫描,确定吸光度最大处对应的波长为检测波长，选择410～900nm，优选650～800nm。

（2-2）称取（2-1）中制得的缺苞箭竹粉末，置于提取容器中，按重量比1∶10～30，优选1∶15～25的比例加入重量分数为60～80%乙醇溶液，优选重量分数为65～75%，进一步优选为70%，在回流温度60～80℃，优选65～75℃下回流1～3小时，优选1.5～2.5小时；

乙醇是实验室常用试剂，无毒、无腐蚀性，与常用无极溶剂水相比，具有较低的沸点、较低的粘度和较低的表面张力，并且离子强度也很低，因此用乙醇可在较低温度下提取多酚类物质，避免了高温对多酚类物质结构上的破坏；而且乙醇分子结构上具有一个醇羟基，具有一定的极性，能够与水以任意比例互溶，；此外，乙醇能够溶解许多无机物和大多数有机物，其对多酚类物质的溶解性良好，因此其对具有多个酚羟基的多酚类物质有良好的溶解性，但是如果乙醇的用量过小，使多酚类物质在乙醇溶液中达到饱和，则会导致多酚类物质提取不完全，从而使检测数量低于真实值；如果乙醇用量过大，则在引起不必要浪费的同时还可能在提取液中引入可能造成干扰的其它成分，因此，选择缺苞箭竹粉末与乙醇溶液的重量比为1∶10～30，优选1∶15～25，更优选为1∶20；此外，如果乙醇浓度过小，其对多酚类物质的溶解度会大大降低从而降低提取效率；如果乙醇浓度过大，则可能导致植物中的蛋白质变性，而影响多酚类物质的提取，因此，选择乙醇溶液的重量分数为60～80%乙醇溶液，优选为65～75%，更为优选为70%。

回流温度过高，会引起乙醇的大量挥发，并可能引起多酚类物质变性；回流温度过低则会增加提取时间，降低提取效率，因此选择回流温度为60～80℃，优选65～75℃；回流时间小于1小时，则提取不完全，而回流时间大于3小时，不仅浪费时间而且还可能提取出其它可能造成干扰的物质，因此选择回流时间为1～3小时，优选1.5～2.5小时。

（2-3）将（2-2）中回流后的固液混合物充分离心，使固液两相分离充分，从而简化后续的减压过滤过程；为使离心充分，并结合离心机的实际，选择转速为3000～5000r/min，优选为4000r/min；温度为10～30℃，优选为25℃的条件下，离心5～15分钟，优选8～12分钟；

（3）缺苞箭竹样品中多酚类物质含量的测定：

C_原样品=C_稀释液×V_稀释液/V_原样品；

其中，

V_原样品是指（2-4）中制备的样品溶液的体积。

本发明提供的缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法具有以下优点：

第一，本发明提供的方法，从缺苞箭竹中提取多酚类物质的步骤中所用的多酚类物质提取溶剂容易获得，提取方法简便，成本低；

第二，本发明提供的缺苞箭竹中多酚类物质的检测方法，均能实现良好的准确度和重现性；

第三，本发明提供的方法中所绘制的多酚类物质的标准曲线，具有稳定性和普适性，可使用该曲线进行多个样本的含量检测，有效的避免了重复性劳动，节约了时间和人工成本；

第四，本发明提供的方法，检测限低，灵敏度高，能有效检测样品中较低浓度的多酚类物质的含量；

第五，本发明提供的方法精密度高，稳定性好，对缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定准确。

附图说明

图1示出试样溶液与福林酚试剂体积比与吸光度的关系图；

图2示出显色温度与吸光度的关系图；

图3示出显色时间与吸光度的关系图；

图4示出没食子酸标准曲线图。

实施例

实验部分：本实施例所用样品及器材如下：

（1）分光光度计U-3900：日本日立公司；

（2）缺苞箭竹于2013年5月采自王朗国家自然保护区；

（3）福林酚试剂：福林酚试剂生化试剂BR，国药集团化学试剂有限公司，批号：20130403。

实施例1

（1）样品溶液的制备

将缺苞箭竹于粉碎机中粉碎，过60～80目的筛子筛分后，称取粗粉1g，放入圆底烧瓶中，按照料液比1∶20分别加入70%乙醇溶液20ml，在70℃温度下冷凝回流2h，将回流后的溶液在转速为4000r/min、温度为25℃的条件下，离心10分钟，将离心后的溶液减压过滤，将滤液转移至25ml容量瓶中，用去离子水定容，制备成为样品溶液，待用；

（2）多酚类物质含量的检测条件为：

（2-1）测定波长的选择：

取稀释5倍后的缺苞箭竹样品溶液和100μg/mL没食子酸标准溶液各1.00mL，分别加入福林酚试剂1.00mL及10%Na₂CO₃溶液3.00mL，静置10分钟，再用二次蒸馏水定容至25.00mL，放置30分钟后，以空白为基底，用紫外-可见分光光度计在410～900nm波长范围内对样品溶液和没食子酸标准溶液进行吸光度扫描,确定吸光度最大处对应的波长为检测波长，确定的检测波长为780nm。

（2-2）福林酚试剂与Na₂CO₃溶液体积比的确定：

取10份1.00mL缺苞箭竹样品溶液加入25mL容量瓶中，分别加入1.00mL福林酚试剂，5min后分别加入0.25mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL10%Na₂CO₃溶液，静置5分钟后加二次蒸馏水定容至25.00mL，放置30分钟后，于780nm下分别测定溶液吸光值，Na₂CO₃是反应体系中显色的介质，且控制着反应体系的酸碱环境，不同的Na₂CO₃加入量会有不同的颜色效，由表1可知，当Na₂CO₃的加入量大于6mL，即福林酚试剂与Na₂CO₃溶液体积比为1∶6时，显色完全且趋于稳定，因此确定福林酚试剂与10%Na₂CO₃的体积比为1∶6。

表1福林酚试剂与10%Na₂CO₃的比例

（2-3）样品溶液与福林酚试剂体积比的确定：

取6份1.00mL（1）中制备的缺苞箭竹样品溶液加入25mL容量瓶中，分别加入0.50mL、1.00mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL福林酚试剂，加入6倍于福林酚试剂体积的10%Na₂CO₃溶液，静置5分钟后加二次蒸馏水定容至25.00mL，放置30分钟后，于780nm下分别测定溶液吸光值，从图1可知,当福林酚试剂的加入量大于3mL，即样品溶液与福林酚试剂体积比为1∶3时，体系的显色反应较充分且趋于稳定，由此确定样品溶液与福林酚试剂体积比1∶3，绘制标准曲线时没食子酸标准品溶液与福林酚试剂的体积比也采用1∶3。

（2-4）显色温度的确定

取10份1.00mL缺苞箭竹样品溶液加入25mL容量瓶中，分别加入3.00mL福林酚试剂，加入18.00mL10%Na₂CO₃溶液，静置5分钟后用二次蒸馏水定容至25.00mL，在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃下放置30分钟，于780nm下分别测定溶液吸光值，

从图2可知，反应温度在25～30℃之间时，显色反应较为完全，吸光度出现最大值，所以本实验确定显色反应温度为25℃。

（2-5）显色时间的确定：

取1份1.00mL缺苞箭竹样品溶液加入25mL容量瓶中，分别加入3.00mL福林酚试剂，加入18.00mL10%Na₂CO₃溶液，静置5分钟后用二次蒸馏水定容至25.00mL，在25℃下从25分钟起，每隔10分钟进行一次取样，于780nm下测定溶液吸光值，

从图3可知，120分钟后显色反应较为完全且趋于稳定，所以本实验确定120分钟为显色反应时间。

（3）样品中多酚类物质含量的测定

（3-1）以没食子酸为多酚类物质标准品绘制标准曲线

准确吸取0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL没食子酸标准溶液，分别定容于25mL量瓶内，用二次蒸馏水定容，配成不同浓度的标准溶液，然后从各溶液中分别量取1.00mL加入25mL容量瓶中，分别加入3.00mL福林酚试剂，加入18.00mL10%Na₂CO₃溶液，静置5分钟后用二次蒸馏水定容至25.00mL，配制没食子酸标准曲线溶液，在25℃水浴中振荡反应2h，随行空白，在780nm处测定吸光值，以吸光值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线如图4所示；

其回归方程为：y=0.006x+0.0057；

其相关系数R²=0.9994。

（3-2）样品中多酚类物质含量的测定：

取步骤（1）中的制备的样品溶液1.00mL加入25mL容量瓶中，加入3.00mL福林酚试剂，18.00mL10%Na₂CO₃溶液，静置5分钟后用二次蒸馏水定容至25.00mL，在25℃水浴中振荡反应2h，在780nm处测定吸光值，吸光度的值为0.404，根据下式：

C_原样品=C_稀释液×V_稀释液/V_原样品

C_稀释液——（1）中制备的缺苞箭竹样品待测溶液中多酚类物质的浓度；

V_稀释液——（1）中制备的缺苞箭竹样品待测溶液的体积；

C_原样品——（3-2）中制备的样品溶液中多酚类物质的浓度；

V_原样品——（3-2）中制备的样品溶液的体积

计算出原样品中多酚类物质的含量为：2.865μg/mL

对比例

缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法与实施例1中相同，区别仅在于步骤（1）中所用提取溶剂为水，以此计算出原样品中多酚类物质的含量为：1.536μg/mL。

由于乙醇具有醇羟基，因此其能与酚羟基通过氢键而结合，同时，乙醇可以与多酚类物质的碳链部分相互作用而使多酚类物质在乙醇中有更大的溶解度，因此，用乙醇作为提取缺苞箭竹中多酚类物质的溶剂可提高提取效率，使实验数值更为准确。

实验例

实验例1福林酚法稳定性试验

取实施例1中步骤（1）制备的缺苞箭竹样品溶液1.00mL加入25mL容量瓶中，加入3.00mL福林酚试剂，18.00mL10%Na₂CO₃溶液，静置5分钟后用二次蒸馏水定容至25.00mL，制备试样1，放置一定时间后测定其吸光度值，实验结果如表所示，

表2福林酚法稳定性试验结果

放置时间（h）	吸光度
		2.0	0.312
2.5	0.312
		3.0	0.313
3.5	0.312

4.0	0.312
		4.5	0.312
5.0	0.313
		5.5	0.312
6.0	0.312

由表2数据，计算得到相对标准偏差RSD=0.14%；

以上数据表明本发明提供的方法在显色反应完全后2h～6h内吸光值仍比较稳定。

实验例2福林酚法重复性试验

取5份实施例1中步骤（1）制备的缺苞箭竹样品溶液1.00mL分别加入25mL容量瓶中，加入3.00mL福林酚试剂，18.00mL10%Na₂CO₃溶液，静置5分钟后用二次蒸馏水定容至25.00mL，制备试样2～6，分别测定其多酚类物质的含量，实验结果列于表3，

表3福林酚法重复性试验结果

试样	多酚类物质含量（μg/mL）
		试样2	2.057
试样3	2.080
		试样4	2.067
试样5	2.092
		试样6	2.053

由表3数据计算可得相对标准偏差RSD=0.78%；

以上数据表明本发明提供的方法重现性较好。

实验例3福林酚法精密度试验

采用本发明提供的方法对实验例1中制备的试样1的吸光度重复测定6次，实验结果列于表4

表4福林酚法精密度试验

吸光度	多酚类物质含量（μg/mL）
		0.377	2.664
0.377	2.664
		0.377	2.664
0.377	2.664
		0.377	2.664
0.377	2.664

以上数据表明本发明提供的方法具有很高的精密度，能够达到样品分析要求。

实验例4福林酚法加样回收试验

取体积不同的5组实施例1中步骤（1）制备的缺苞箭竹样品溶液，每组两份，向每组其中一份缺苞箭竹样品溶液中加入相当于1μg没食子酸的没食子酸标准溶液，加入25mL容量瓶中，加入3.00mL福林酚试剂，18.00mL10%Na₂CO₃溶液，静置5分钟后用二次蒸馏水定容至25.00mL，在25℃水浴中振荡反应2h，在780nm处测定吸光度值，其中，加入的没食子酸质量1μg即为加标量，计算样品溶液中含有的多酚类物质与加入的没食子酸标准品的总质量，记为总检出量；同时，每组中另一份样品溶液不加入没食子酸标准溶液，采用相同的方法和测定条件测定样品溶液的吸光度，计算样品中多酚类物质的含量，记为本底量，通过下式计算所加入的没食子酸标准品的加标回收率，实验数据列于表5，

P=（m₂-m₁）/m×100%

其中，

P——加标回收率

m₂——总检出量

m₁——本底量

m——加标量

表5加标回收率试验结果

由表5可知，5次加标回收试验中没食子酸加标回收率最低为98.0%，最高为102.6%，加标平均回收率为99.4%，其相对标准偏差RSD=1.52%；

以上数据表明本发明提供的方法准确可靠，由方法本身引起的系统偏差小，可用于缺苞箭竹总酚含量的检测。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

Claims

1.缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，包括：

(1)以没食子酸为多酚类物质标准品绘制标准曲线：

配制浓度为80～120μg/mL的没食子酸标准溶液，以梯度体积量取上述没食子酸标准溶液，分别移至容量瓶内，配制成没食子酸系列标准溶液，按没食子酸系列标准溶液与福林酚试剂体积比1:2～6向没食子酸系列标准溶液中分别加入等量的福林酚试剂，5分钟后向加入福林酚试剂后的没食子酸系列标准溶液中按福林酚试剂与Na₂CO₃溶液体积比1:4～6分别加入等量的Na₂CO₃溶液，静置5～30分钟后用高纯水定容，配制成为标准曲线溶液，在显色温度为20～40℃的条件下，静置显色25～250分钟；用紫外-可见分光光度计在检测波长410～900nm测定标准曲线溶液的吸光度，并将测得的吸光度值绘制成为标准曲线，使其回归方程为一次函数，并且相关系数R²>0.99；

其中，

所述Na₂CO₃溶液的重量分数为5～15％；

所述高纯水为去离子水或二次蒸馏水；

(2)缺苞箭竹中多酚类物质的样品溶液制备，包括以下子步骤：

(2-1)将缺苞箭竹粉碎，过60～80目的筛子筛分，得到缺苞箭竹粉末；

(2-2)称取(2-1)中制得的缺苞箭竹粉末，置于提取容器中，按重量比1:20的比例加入重量分数为70％乙醇溶液，在回流温度65～75℃下回流1.5～2.5小时；

(2-3)将(2-2)中回流后的固液混合物，在转速为4000r/min、温度为25℃的条件下，离心8～12分钟；

(2-4)将(2-3)中离心后的固液混合物减压过滤，将滤液转移至容量瓶中，用高纯水定容，制备成为样品溶液，按样品溶液与福林酚试剂体积比1:0.5～10向样品溶液中加入福林酚试剂，5分钟后向加入福林酚试剂后的样品溶液中按福林酚试剂与Na₂CO₃溶液体积比1:4～6加入Na₂CO₃溶液，静置5～30分钟后用高纯水定容，在显色温度为10～45℃的条件下，静置显色25～250分钟配制缺苞箭竹样品待测溶液，待用；

(3)缺苞箭竹样品中多酚类物质含量的测定：

用绘制标准曲线时使用的紫外-可见分光光度计测定(2-4)中制备的缺苞箭竹样品待测溶液的吸光度值，该吸光度值在标准曲线上所对应的浓度值即为缺苞箭竹样品待测溶液中多酚类物质的浓度，即C_稀释液，再通过下式换算出缺苞箭竹中多酚类物质的含量，即C_原样品，

C_原样品＝C_稀释液×V_稀释液/V_原样品；

其中，

C_稀释液是指(2-4)中制备的缺苞箭竹样品待测溶液中多酚类物质的浓度；

V_稀释液是指(2-4)中制备的缺苞箭竹样品待测溶液的体积；

C_原样品是指(2-4)中制备的样品溶液中多酚类物质的浓度；

V_原样品是指(2-4)中制备的样品溶液的体积。

2.根据权利要求1所述的缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，所述Na₂CO₃溶液的重量分数为8～12％。

3.根据权利要求1所述的缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，所述显色时间为60～150分钟。

4.根据权利要求1所述的缺苞箭竹中多酚类物质含量的测定方法，其特征在于，步骤(1)中所述检测波长为650～800nm。