CN105018486A - 一种检测水稻细菌性条斑病菌的hda试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

一种检测水稻细菌性条斑病菌的HDA试剂盒及检测方法，本发明所述HDA试剂盒包括：一对特异性检测水稻细菌性条斑病菌的HDA引物对，以及10×缓冲液、ATP、dNTPs、Bst？polymerase、RecA蛋白、UvrD？helicase、阳性对照DNA和ddH₂O；本发明检测方法为：从待测样本中提取DNA作为检测模板：采用细菌DNA提取试剂盒提取待测样本DNA，保存备用；利用上述HDA试剂盒，进行HDA反应，得到扩增产物；检测扩增产物，并作出判断。本发明所的检测法具有极高的特异性，仅能从水稻细菌性条斑病菌DNA中扩增出特异性条带，较生理生化检测法具有更高的灵敏度和准确性；所提供的HDA检测法在恒温下就能进行，较常规PCR检测法速度更快；扩增反应只需要普通水浴锅就可以进行，不需要复杂和昂贵的热循环仪设备。

Description

一种检测水稻细菌性条斑病菌的HDA试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测水稻细菌性条斑病菌的HDA试剂盒及检测方法，属于检验检疫领域。

技术背景

水稻是世界最重要的粮食作物之一，全球约有一半人口以水稻为主食。水稻细菌性条斑病，又称细条病、条斑病，是水稻主要病害之一，对水稻产量造成了严重的影响。该病由细菌引起，病原菌为水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola）。2007年，农业部会同国家质量监督检验检疫总局共同制定了《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，该目录将水稻细菌性条斑病明确列为水稻的检疫性病害。重视并加强水稻细菌性条斑病菌的检验检疫工作，对切实保障水稻的安全生产有着重要意义。

根据《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》中关于水稻细菌性条斑病菌的检测方法规定，对于出入境种子首先需要进行样品的清洗、研磨并获得提取液，然后进行平板培养，或利用ELISA试剂盒对提取液进行快速筛选检测。对于检测结果呈阳性的还需进行进一步的平板分离和生化鉴定。整个过程程序复杂，耗时长，且在操作过程中可能产生假阳性或假阴性结果。随着分子生物学技术的发展，以聚合酶链式反应（PCR）为依托的检验方法已应用于水稻细菌性条斑病菌的检测，该方法虽然灵敏准确，但需要高品质热循环仪，成本较高，难以大范围应用在基层单位的日常检验检疫工作中，而且，PCR反应温度循环的过程导致了反应时间较长，增加了检验的时间成本。因此，有必要开发一种更加准确、快捷、成本低、简单易操作的检测水稻细菌性条斑病菌的方法。

依赖解旋酶DNA等温扩增技术（Helicase-Dependent isothermal DNA Amplification，简称HDA）是由美国NEB公司于2004年开发的一种核酸等温扩增技术。该技术只需在恒定温度下进行，不需要温度变化的过程，因此，在实际操作和仪器要求方面，HDA技术都比PCR技术更为便捷和廉价，真正使样品的检测实现了快速、简便和低成本，从而更容易被开发出检测的应用产品。

HDA技术原理是利用解旋酶在恒温条件下解开DNA双链，同时DNA单链结合蛋白(SSB)稳定解开的单链为引物提供结合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互补链，新合成的双链在解旋酶的作用下又形成单链，并作为下一轮合成的模板进入循环扩增反应，最终实现靶序列的指数增长。该技术的优点在于：等温扩增，HDA技术在一个恒定温度就能完成扩增反应，不需要像普通PCR那样循环的温度变化，可以减少扩增时间；设备简单，HDA反应不需要复杂和昂贵的热循环仪设备，只需要一个简单的恒温器就可进行。因此，HDA技术有望成为一种重要的检验检测工具。

目前，国际上对于HDA技术的研究和应用尚处于起步阶段，国内外还没有关于HDA法检测水稻细菌性条斑病菌的研究。我们将首次提供快速检测水稻细菌性条斑病菌的HDA试剂盒，并建立起相应检测方法。该发明是水稻细菌性条斑病菌检测技术体系的进一步完善和发展。该方法的建立，将使得水稻细菌性条斑病菌的检测真正实现准确、快捷、成本低和简单易操作，特别适用于在基层单位的日常检验检疫工作中大范围推广，可为我国的水稻细菌性条斑病的有效防治做出贡献。

发明内容

本发明的目的是针对现有检测技术的不足，提供一种更加准确、快捷、成本低和简单易操作的检测水稻细菌性条斑病菌的HDA试剂盒及检测方法。

本发明所述检测水稻细菌性条斑病菌的HDA试剂盒包括：一对特异性检测水稻细菌性条斑病菌的HDA引物对，以及10×缓冲液、ATP、dNTPs、Bst polymerase、RecA蛋白、UvrD helicase、阳性对照DNA和ddH₂O；

所述HDA引物对序列为：

SEQ ID No：1：5’-GCACACCTGTATTGCATTGG-3’；

SEQ ID No：2：5’-ATCTCATCGGTGCCTTTACG-3’。

本发明所述检测水稻细菌性条斑病菌的HDA试剂盒检测方法为：

1、从待测样本中提取DNA作为检测模板：采用细菌DNA提取试剂盒提取待测样本DNA，保存备用；

2、利用上述HDA试剂盒，进行HDA反应，得到扩增产物；

所述检测水稻细菌性条斑病菌的HDA试剂盒包括：一对特异性检测水稻细菌性条斑病菌的HDA引物对，以及10×缓冲液、ATP、dNTPs、Bst polymerase、RecA蛋白、UvrD helicase、阳性对照DNA和ddH₂O；

所述HDA引物对序列为：

SEQ ID No：1：5’-GCACACCTGTATTGCATTGG-3’；

SEQ ID No：2：5’-ATCTCATCGGTGCCTTTACG-3’；

所述的HDA反应体系为：5μL的10×缓冲液，0.2μmol的ATP，0.1μmol的dNTPs，10U Bst polymerase，2-5μg RecA蛋白，0.2-0.4μg UvrD helicase，2μL的10μmol/L的上游引物，2μL的10μmol/L的下游引物，2μL的样品基因组DNA，用ddH₂O补至50μL；

所述的HDA反应方法为：将反应体系放入60-70^oC恒温水浴锅中恒温扩增90-120min；

3、检测扩增产物，并作出判断；

所述的检测扩增产物并作出判断是采用琼脂糖凝胶电泳的方法进行，出现330bp的特异性扩增条带即判断为检测出水稻细菌性条斑病菌。

作为上述HDA试剂盒的一种优选技术方案，10×缓冲液包括100mM二硫苏糖醇、350mM Tris-HAc、100mM MgSO₄、1mg/mL BSA和25μM海藻糖，因此不必另外设置上述的二硫苏糖醇、Tris-HAc、MgSO4、BSA和海藻糖，不仅大大简化了HDA反应过程，同时也节省了试剂盒空间。

作为上述HDA反应体系的一种优选技术方案，反应体系中RecA蛋白的含量为3μg。

作为上述HDA反应体系的一种优选技术方案，反应体系中UvrD helicase的含量为0.3μg。

作为上述HDA反应方法的一种优选技术方案，将反应体系放入65^oC恒温水浴锅中恒温扩增100min。

本发明的有益效果为：所开发的HDA检测法具有极高的特异性，仅能从水稻细菌性条斑病菌DNA中扩增出特异性条带，较生理生化检测法具有更高的灵敏度和准确性；所提供的HDA检测法在恒温下就能进行，反应温度不需要循环变化，较常规PCR检测法速度更快；扩增反应只需要普通水浴锅就可以进行，不需要复杂和昂贵的热循环仪设备。因此，该发明是水稻细菌性条斑病菌检测技术体系的进一步完善和发展，使得水稻细菌性条斑病菌的检测真正实现准确、快捷、成本低和简单易操作，特别适用于在基层单位的日常检验检疫工作中大范围推广。

附图说明

图 1 为本发明HDA法检测不同小种的水稻细菌性条斑病原菌试验结果图，其中，M：DNA marker；1-12：Xanthomonas oryzae pv. oryzicola RH3、RS85、RS105、HNB8-47、PXO71、PXO86、PXO99、AHB4-75、JSB2-24、JSB3-22、YNB10-32、SCB4-1；13：阳性对照；14：阴性对照。

图 2 为本发明HDA法检测水稻其他病原菌和其他植物病原菌的试验结果图。其中，M：DNA marker，1-11：Xanthomonas oryzae pv. oryzae YN1、YN11、YN18、YN24、PXO347、PXO349、PXO364、OS86、OS198、OS225、ZHE173；12：Xanthomonas axonopodis pv. citri YC；13：Xanthomonas campestris pv. campestris X8-1；14-15：Ustilaginoidea oryzae LN、SX0201；16：Xanthomonas maltophilia；17：Burkholderia gladioli pv. alliicola；18：Burkholderia cepacia；19：Burkholderia glumae；20：Pellicularia sasakii；21：阳性对照；22：阴性对照。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域内常规方法。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过商业途径获得的常规产品。

1. HDA引物对的设计：

在GenBank数据库中搜索水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas.oryzae pv. oryzicola）基因序列并利用NCBI中的BLAST工具进行nucleotide blast比对，获得水稻细菌性条斑病原菌特异性基因AvrRxo1-ORF1（GenBank号为：AY395713.1）。引物的设计经过同源性对比，选取特异性较高的区域设计扩增引物对，用于增加检测的准确度与特异性。经过对设计引物的筛选，最终确定了一对效果最佳的引物对用于本发明，命名为Xoc-JYF和Xoc-JYR（即SEQ ID No：1和SEQ ID No：2）。

2. 引物对的合成和试剂盒的制备：

根据所设计引物的核苷酸序列信息由上海生工生物工程有限公司合成引物对；

将上述合成好的引物对分别配制成浓度为10μmol/L的溶液作为试剂盒，备用。试剂盒还内含：10×缓冲液，ATP，dNTPs，Bst polymerase，RecA蛋白，UvrD helicase，阳性对照DNA和ddH₂O。

3. 样品基因组DNA的提取：

实施例中所用不同小种的水稻细菌性条斑病原菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola RH3、RS85、RS105、HNB8-47、PXO71、PXO86、PXO99、AHB4-75、JSB2-24、JSB3-22、YNB10-32、SCB4-1）和其他病原菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae YN1、YN11、YN18、YN24、PXO347、PXO349、PXO364、OS86、OS198、OS225、ZHE173；Xanthomonas axonopodis pv. citri YC；Xanthomonas campestris pv. campestris X8-1；Ustilaginoidea oryzae LN、SX0201；Xanthomonas maltophilia；Burkholderia gladioli pv. alliicola；Burkholderia cepacia；Burkholderia glumae；Pellicularia sasakii）均由美国农业部国家水稻研究中心提供。

分别提取细菌基因组DNA，提取方法参见细菌DNA提取试剂盒（上海生工生物工程有限公司）的说明书。提取的样品基因组DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀范围在1.6-2.0内，浓度大于10ng/μL。

4. HDA扩增反应与电泳检测：

1）HDA反应体系和反应方法

以步骤3提取的细菌基因组DNA为模板，利用本发明所提供的HDA反应试剂盒进行反应。

反应体系为50μL，即在0.2mL的PCR反应管中加入5μL的10×缓冲液，0.2μmol的ATP，0.1μmol的dNTPs，10U Bst polymerase，3μg RecA蛋白，0.3μg UvrD helicase，2μL的10μmol/L的上游引物Xoc-JYF，2μL的10μmol/L的下游引物Xoc-JYR，2μL的样品基因组DNA，用ddH₂O补至50μL。

所述的HDA反应方法为：将反应体系放入65^oC恒温水浴锅中恒温扩增100min。

2）扩增产物的电泳检测

用1×TAE电泳缓冲液制备1.5%的琼脂糖凝胶。取扩增产物与5μL 10×上样缓冲液混合后，在已制备的琼脂糖凝胶的点样孔中进行点样。设置电压（3V/cm - 5V/cm），电泳时间为50 min - 60 min。用凝胶成像仪拍照记录。

采用上述引物对特异性的扩增片段长度为330bp，根据检测样品是否产生330bp的扩增条带判定样品中是否含有水稻细菌性条斑病原菌成分。

3）检测水稻细菌性条斑病原菌HDA方法的确定

凝胶电泳结果见图 1和图 2。图1显示所有水稻细菌性条斑病原菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola RH3、RS85、RS105、HNB8-47、PXO71、PXO86、PXO99、AHB4-75、JSB2-24、JSB3-22、YNB10-32、SCB4-1）均产生了和阳性对照一致的特异性条带；图2显示除阳性对照产生特异性条带外，其余检测菌株（Xanthomonas oryzae pv. oryzae YN1、YN11、YN18、YN24、PXO347、PXO349、PXO364、OS86、OS198、OS225、ZHE173；Xanthomonas axonopodis pv. citri YC；Xanthomonas campestris pv. campestris X8-1；Ustilaginoidea oryzae LN、SX0201；Xanthomonas maltophilia；Burkholderia gladioli pv. alliicola；Burkholderia cepacia；Burkholderia glumae；Pellicularia sasakii）均未产生特异性条带。

以上结果表明，所提供的试剂盒和检测方法能够完全准确的对水稻细菌性条斑病原菌进行鉴定，同时与已有检测方法相比，该发明具有快捷、成本低和简单易操作的优点，特别适用于在基层单位的日常检验检疫工作中大范围推广。

SEQ ID No：1：5’-GCACACCTGTATTGCATTGG-3’；

SEQ ID No：2：5’-ATCTCATCGGTGCCTTTACG-3’。

SEQ ID No：3：水稻细菌性条斑病原菌特异性基因AvrRxo1-ORF1 序列（GenBank 号为：AY395713.1）：

GATCGCAGCATGCGACGCATTTTTATAGCTTCGTTCGCTGCTCATATAGTTCGTAAGGTGTGCGAGTTGCGATTCGAATCGCTCTTAATGTTTGCAGGGTCAGGCACACCTGTATTGCATTGGACTTTTGACATCTTTTTAACATGAAAAACAAGACAGACATTGCTGGCATAGCCGGACTTTCTACGTCTCATGTTTCCTTTGATGACGCAGAATCCAAAAGCGTCCTAGATGGATCAACACAGTCTACGCCGGAGTACAAATTCCAGACCCCGCTTGATCAGTTGCCGGCTAGGCCCGCTGGTCCGAAGAGCAGTAACACAACTGATGCTTACATTCATGAATCACTGCCGCATTCGGTTCCAATCGCAGGTGCATCGACCTCCGCGGTGACACATCAACAGGCTACTCAGCGTAAAGGCACCGATGAGATCTATGGTTTGGGCAGCCTCCCATCTGCTGGTCCAGGGCGATGGGAGTATCTTGCGAATCCGGGGAACTGGCATCCCGAGCGCCGTAAGTTACACGAAAAGCTATTAGATCAAGCGCGATCTTCTGCCTTGACCCTGGCAGAATCCCTTGAGAGTGATGGCTGCCAACCGACATTGTTTGCGCTGCGCGGAAATACCGCAACGGGTAAAACACGGATTGCGACAAAAAAGATCCCGGTGCTCGCAGCAGCTCTGAAGAAGACAGCTGGGAAAGGTTGCGTGAATCCAGATGTATTCAAGAGTTCGCTTGCGAAATCCGAGACAGGCGCCAAGATATTTAGTTCGGCACAAGTGCATAGCGAGTCATCTTTTCTTGCCGACCGGTTTGAAGGCGGACTTCGCTCTCAAAAGACGGGCAGCGGTGCAATCGCTAGCATTGTTGTCGACAAGCGCTTGTCAAGAGAGTACGAAATTGATAGCTACATACAACTAGCGAAAGAAACCGGTAGAAAAGTGGAATTGTGCGATATCGACGCGCCCCTAGAGAATTCTTTGGTGGGAGTTTTGCAGCGAAAACCGGAAGGTGAAGATCCTAGGCCTCCGTACCCTGTAGTCTCGAGTGGATTTGTAGCCGTACGGAGCAATAGAATGTACGTGATAGACAGGTTCATTGCCGATCCGAGCCTGGGAAACTACCGACTATTCGGAACAGCTGAAGATGGTGAGAAGGTCATGGTTGCTAGCGTGATTGGCGGTGAGTTTAGTGTAGAGAATGCTGAGTTGTATGAAAAAATCACGTCCCCACAGCTCTCGGTTACGGGCGATTTGGCTGATAAGGTAATCGACAAGGAATTGATTGATCGTCTGGAAAATAATATAGCTGACCCCGAGCGGGCGGCCAAGACGCGAGCCGCCCTGGAAAAATACAGCGGTAAGTCATGGTCGGCCGCGCTAGCTGCTCACAGCGAGCTAATTTGA。

Claims (7)

1.一种检测水稻细菌性条斑病菌的HDA试剂盒，其特征在于：所述HDA试剂盒包括：一对特异性检测水稻细菌性条斑病菌的HDA引物对，以及10×缓冲液、ATP、dNTPs、Bst polymerase、RecA蛋白、UvrD helicase、阳性对照DNA和ddH2O；

所述HDA引物对序列为：

SEQ ID No：1：5’-GCACACCTGTATTGCATTGG-3’；

SEQ ID No：2：5’-ATCTCATCGGTGCCTTTACG-3’。

2.一种检测水稻细菌性条斑病菌的HDA试剂盒检测方法，其特征是：

（1）从待测样本中提取DNA作为检测模板：采用细菌DNA提取试剂盒提取待测样本DNA，保存备用；

（2）利用权利要求1所述的HDA试剂盒，进行HDA反应，得到扩增产物；

所述的HDA反应方法为：将反应体系放入60-70^oC恒温水浴锅中恒温扩增90-120min；

（3）检测扩增产物，并作出判断；

所述的检测扩增产物并作出判断是采用琼脂糖凝胶电泳的方法进行，出现330bp的特异性扩增条带即判断为检测出水稻细菌性条斑病菌。

3.根据权利要求1所述的一种检测水稻细菌性条斑病菌的HDA试剂盒：其特征是：所述HDA试剂盒包括：10×缓冲液包括100mM二硫苏糖醇、350mM Tris-HAc、100mM MgSO₄、1mg/mL BSA和25μM海藻糖，因此不必另外设置上述的二硫苏糖醇、Tris-HAc、MgSO4、BSA和海藻糖。

4.根据权利要求2所述的一种检测水稻细菌性条斑病菌的HDA试剂盒检测方法，其特征是：所述HDA反应体系为：5μL的10×缓冲液，0.2μmol的ATP，0.1μmol的dNTPs，10U Bst polymerase，2-5μg RecA蛋白，0.2-0.4μg UvrD helicase，2μL的10μmol/L的上游引物，2μL的10μmol/L的下游引物，2μL的样品基因组DNA，用ddH₂O补至50μL。

5.根据权利要求2所述的一种检测水稻细菌性条斑病菌的HDA试剂盒检测方法：其特征是：所述反应体系中RecA蛋白的含量为3μg。

6.根据权利要求2所述的一种检测水稻细菌性条斑病菌的HDA试剂盒检测方法：其特征是：所述反应体系中UvrD helicase的含量为0.3μg。

7.根据权利要求2所述的一种检测水稻细菌性条斑病菌的HDA试剂盒检测方法：其特征是：将反应体系放入65^oC恒温水浴锅中恒温扩增100min。