CN107338313A - 一种利用数字pcr检测水稻细菌性条斑病菌的方法及试剂盒 - Google Patents

一种利用数字pcr检测水稻细菌性条斑病菌的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用数字PCR检测水稻细菌性条斑病菌的方法及试剂盒。本发明所提供的试剂盒含有一个特异性引物对和一条两端带荧光标记的探针，所述引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示，所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明中的检测引物基于水稻细菌性条斑病菌假定的膜蛋白基因设计，实验证明，采用本发明所提供的方法检测水稻细菌性条斑病菌，特异性好且灵敏度高，检测结果准确性高，适用于水稻种子样品中该病菌的检测，具有重要的应用价值。

Description

一种利用数字PCR检测水稻细菌性条斑病菌的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及植物保护和分子生物学检测技术领域，具体地说，涉及水稻细菌性条斑病菌数字PCR检测方法。
背景技术
水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)，是一种黄单胞杆菌科、黄单胞杆菌属的细菌，可侵染稻属(Oryza sp.)的多个种和茭白(Zizania aquatica)。1990年，Swings等命名该种为水稻黄单胞条斑病致病变种X.oryzae pv.oryzicola。该病最早于1918年发生在菲律宾，目前主要分布在热带和亚热带地区，如菲律宾、泰国、印度、巴基斯坦、印度尼西亚、孟加拉、塞内加尔、尼日利亚、柬埔寨、越南、马来西亚、毛利塔尼亚、中国、澳大利亚、尼泊尔、哥伦比亚、马达加斯加、斯里兰卡和喀麦隆；从地区分布来看，主要集中在亚洲和非洲。我国主要分布在南方省区，如广东、广西、海南、贵州、云南、四川、福建、浙江、江西、湖南、湖北、安徽和江苏。该病主要危害植株叶片，对产量影响较大，能够引起减产10％～20％，甚至可达40.16％，给水稻生产造成严重的经济损失。
目前，针对水稻细菌性条斑病菌的检测方法主要有包括育苗生长观察法、直接分离法、致病性测定等的传统检测法、血清检测法和PCR检测法。传统检测法步骤复杂、耗时长，已不能适应快速检测的需要。血清检测法中以ELISA应用最广泛，可以在短时间内检测大量样品，但不同菌株的抗体不容易获得、反应过程中的交叉反应,易引起假阳性或假阴性现象的问题。PCR检测技术能快速、有效的从水稻种子样品上检测出水稻细菌性条斑病菌，无论对国内植物检疫还是对保证我国水稻种子及稻米的出口均有重要意义，目前己有多种不同的PCR检测技术应用于条斑病菌的检测与鉴定，但对部分带菌率不高的样品却不能做出可靠的诊断，引起假阴性结果。
数字PCR(Digital-PCR)是一种新型的PCR检测方法，其工作原理在于将DNA或cDNA样品分割为许多单独、平行的PCR反应，部分这些反应包含了靶标分子(阳性)，而其他不包含(阴性)。单个分子可以被扩增一百万倍或更多，能够提高现有TaqMan测定的性能，从而实现更高的灵敏度、准确度，避免假阴性结果的出现。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用数字PCR检测水稻细菌性条斑病菌的方法及试剂盒。
本发明所提供的检测水稻细菌性条斑病菌的特异性引物对和特异性探针组合，所述引物对由上游引物Xoc163F和下游引物Xoc163R组成。所述上游引物、下游引物和特异性探针序列如下：
上游引物Xoc163F：5′-GTGTTGACCCGCGCCCTGTTCTG-3′(SEQ ID NO.1)
下游引物Xoc163R：5′-CGACGACGACGGCAAGTGAGTGAC-3′(SEQ ID NO.2)
特异性探针Xoc163P：5’-FAM-TTTCAAAGGGCAGGGCTATCTGCT-TAMRA-3’(SEQ IDNO.3)
本发明进一步提供水稻细菌性条斑病菌的数字PCR检测方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)以提取的基因组DNA为模板，利用所述的引物对和特异性探针组合，进行数字PCR扩增反应；
(3)检测PCR扩增产物。
本领域技术人员可以采用本发明的引物对和探针选用适宜的PCR进行检测。优选地，本发明选择数字PCR进行扩增。
上述步骤(2)中，所述“进行数字PCR”的反应体系具体为体系2。
体系1为：10μl 2×SuperMix，1μl上游引物Xoc163F(10uM)，1ul下游引物Xoc163R(10uM)，0.5μl特异性探针Xoc163P(10uM)，2μl基因组DNA，ddH2O补足至20μl。该体系为预混液体系。
体系2为：体系1与70ul数字PCR反应用油在微滴生成器上制备的反应微滴体系。
上文中，所述2×SuperMix和所述数字PCR反应用油均可为美国伯乐BIO-RAD公司的产品。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中数字PCR扩增反应的程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s，67℃退火及延伸60s，共40个循环；98℃固化微滴10min。
上述步骤(3)中检测PCR扩增产物具体如下：
出现明显区别于阴性反应孔(阴性反应孔中基因组DNA为2μl ddH2O代替)的扩增信号，将该反应孔记为阳性扩增孔，表明待测样品基因组中携带水稻细菌性条斑病菌。
针对水稻细菌性条斑病菌设计检测该病菌的特异性引物和探针，并基于该特异性引物和探针建立了利用数字检测水稻细菌性条斑病菌的方法。实验证明,采用本发明所提供的方法数字检测水稻细菌性条斑病菌，特异性好(可从水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)、柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)、辣椒细菌性斑点病菌(Xanthomonas axonopodis pv.vesicatoria)、水稻细菌性谷枯病菌(Burkholderiaglumae)、燕麦噬酸菌燕麦致病变种(Acidovorax avenae subsp.avenae)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)中准确鉴定出X.oryzae pv.oryzicola)，且灵敏度高(在20ul反应体系中，灵敏度可达10拷贝)，适用于水稻细菌性条斑病菌含量低的水稻种子样品的检测，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例3的特异性实验结果。A04通道X.oryzae pv.oryzicola产生阳性微滴，其它菌株和空白对照均不产生阳性微滴，即仅X.oryzae pv.oryzicola菌株的检测结果为阳性。
图2为实施例4的灵敏度实验结果。A11、B11、C11、D11、E11和F11中均产生阳性微滴，且阳性微滴数按梯度逐渐递减，根据数值分析F11的20ul体系中的反应数10拷贝，G11和H11均不产生阳性微滴。
图3为实施例5中检测水稻种子实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用菌株X.oryzae pv.oryzicola(NCPPB1151)、X.oryzaepv.oryzae(NCPPB1153)、X.axonopodis pv.citri(NCPPB3607)、X.axonopodispv.vesicatoria(NCPPB2594)、B.glumae(NCPPB2391)、A.avenae subsp.avenae(NCPPB522)、P.agglomerans(NCPPB179)保藏于National Collection of PlantPathogenic Bacteria(简称NCPPB，网址为：http://ncppb.fera.defra.gov.uk/)，公众可以从该集存库获得。健康水稻种子购自安徽华韵生物科技有限公司，带菌水稻种子由安徽出入境检验检疫局提供。数字PCR相关反应试剂耗材和Bio-Rad数字反应系统(Bio-RadQX200)均为美国Bio-Rad公司的产品，数字PCR相关反应试剂耗材包括2×SuperMix、数字PCR微滴生成卡和数字PCR反应用油；Bio-Rad数字PCR反应系统(Bio-Rad QX200)包括Droplet Generator微滴生成器和Droplet Reader微滴读取仪。PCR仪购自美国ABI公司(型号：96-Well Thermal Cycler 9902)。植物基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP305-02)，购自天根生化科技(北京)有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302-02)，购自天根生化科技(北京)有限公司。
实施例1 用于水稻细菌性条斑病菌数字PCR检测的引物对和特异性探针组合的设计
根据水稻细菌性条斑病菌假定的膜蛋白基因设计了如下用于水稻细菌性条斑病菌数字PCR检测的3个引物对和特异性探针组合：
上游引物Xoc163F：5′-GTGTTGACCCGCGCCCTGTTCTG-3′
下游引物Xoc163R：5′-CGACGACGACGGCAAGTGAGTGAC-3′
特异性探针Xoc163P：5’-FAM-TTTCAAAGGGCAGGGCTATCTGCT-TAMRA-3’
探针Xoc163P的5’末端具有FAM荧光标记，3’末端具有TAMRA荧光标记。
上游引物Xoc163F：5′-GTGTTGACCCGCGCCCTGTTCTG-3′
下游引物Xoc163R：5′-CGACGACGACGGCAAGTGAGTGAC-3′
特异性探针Xoc163P2：5’-FAM-CTATCTGCTGATTCCGGCAAATGT-TAMRA-3’
探针Xoc163P2的5’末端具有FAM荧光标记，3’末端具有TAMRA荧光标记。
上游引物XoclF：5′-GGCGTGGCCAAGGCC-3′
下游引物XoclR：5′-GACGGCCACGACCTTGAC-3′
特异性探针XoclP：5’-FAM-CGCCGAAGAAGTCGAAGGCGAGGCGC-TAMRA-3’
探针XoclP的5’末端具有FAM荧光标记，3’末端具有TAMRA荧光标记。
经实验筛选，仅引物对Xoc163F/Xoc163R及探针Xoc163P组合具有较好的特异性。
实施例2 水稻细菌性条斑病菌数字PCR检测方法的建立
1、配制反应体系反应体系20ul，由2×SuperMix 10ul、引物Xoc163F 1ul、引物Xoc163R 1ul、探针Xoc163P 0.5ul、待测样品的基因组DNA 2ul和ddH2O 5.5ul，空白对照中的基因组DNA用ddH2O代替。
2、完成步骤1后，将反应体系转移至数字PCR微滴生成卡的体系加样孔中，并在反应用油加样孔中加入70ul的数字PCR反应用油，将数字PCR微滴生成卡转移至DropletGenerator微滴生成器中，启动仪器，得到微滴体系。
3、完成步骤2后，将所述微滴体系转移至96孔板中，封膜；
4、完成步骤3后，将所述96孔板置于PCR仪中，进行PCR扩增反应，反应程序：95℃预变性10min；95℃变性10s，67℃退火及延伸60s，共40个循环；98℃固化微滴10min。
5、完成步骤4后，将所述96孔板取出,置于Droplet Reader微滴读取仪中进行微滴荧光读取，然后通过FAM单通道荧光收集单个微滴荧光信号。
6、完成步骤5后，仪器通过分析散点图确定荧光阈值限并自动确定阴性微滴和阳性微滴。然后进行如下判断：如果待测样品产生阳性微滴信号，则待测样品含有水稻细菌性条斑病菌；如果待测样品不产生阳性微滴信号，则待测样品不含有水稻细菌性条斑病菌。
实施例3 按照实施例2建立的方法进行特异性检测
用细菌基因组DNA提取试剂盒提取从NCPPB集存库获得的7种菌株的基因组DNA。
按照实施例2方法，进行特异性检测。实验结果见图1(A04为X.oryzaepv.oryzicola，B04为X.oryzae pv.oryzae，C04为X.axonopodis pv.citri，D04为X.axonopodis pv.vesicatoria，E04为B.glumae，F04为A.avenae subsp.avenae，G04为P.agglomerans，H04为空白对照)。结果表明，仅X.oryzae pv.oryzicola产生阳性微滴，其它菌株和空白对照均不产生阳性微滴(此时作为判定的阈值为5928，低于阈值的微滴仪器判断为阴性，高于阈值的微滴仪器判断为阳性)。因此，仅X.oryzae pv.oryzicola菌株的检测结果为阳性，与预期结果完全一致。
上述结果表明，实施例1所提供的检测水稻细菌性条斑病菌的成套试剂的特异性高。
实施例4 按照实施例2建立的方法进行灵敏度检测
1、用细菌基因组DNA提取试剂盒提取X.oryzae pv.oryzicola菌株的基因组DNA，初始基因组DNA命名为稀释液I(稀释度记为10°)。
2、完成步骤1后，取1体积份稀释液I，加入9体积份的ddH2O，混合均匀，得到稀释液II(稀释度记10-1)，以此类推制成稀释液III(稀释度记10-2)、稀释液IV(稀释度记10-3)、稀释液V(稀释度记10-4)、稀释液VI(稀释度记10-5)、稀释液VII(稀释度记10-6)、稀释液VIII(稀释度记10-7)。
3、完成步骤2后，按照实施例2步骤2的方法，进行灵敏度检测。待测样品的DNA模板为步骤2制备的稀释液II、稀释液III、稀释液IV、稀释液V、稀释液VI、稀释液VII、稀释液VIII。
4、实验结果见图2(A11为稀释液II、B11为稀释液III、C11为稀释液IV、D11为稀释液V、E11为稀释液VI、F11为稀释液VII、G11为稀释液VIII、H11为空白对照)。结果表明，稀释液II、稀释液III、稀释液IV、稀释液V、稀释液VI和稀释液VII中均产生阳性微滴，稀释液VIII和空白对照均不产生阳性微滴(此时作为判定的阈值为965，低于阈值的微滴仪器判断为阴性，高于阈值的微滴仪器判断为阳性)。根据数值分析，实施例1所提供的检测水稻细菌性条斑病菌的试剂在上述20ul反应体系中的灵敏度10拷贝。
实施例5 按照实施例2建立的方法进行水稻种子检测
采用实施例2建立的方法分别检测带菌水稻种子样品及健康水稻种子样品。
1、水稻种子样品DNA的提取：称取20g待测样品，置于灭菌的50ml离心管中，加无菌水至淹没待测样品，4℃过夜，取浸泡液12000rpm离心5min，收集沉淀利用植物基因组DNA提取试剂盒按照操作说明进行样品DNA提取。
2、按照实施例2方法，进行水稻种子检测。实验结果见图3(A10为带菌水稻种子样品，B10为健康水稻种子样品，C10为空白对照)。结果表明，仅A10带菌水稻种子样品产生阳性微滴，健康水稻种子样品和空白对照均不产生阳性微滴(此时作为判定的阈值为914，低于阈值的微滴仪器判断为阴性，高于阈值的微滴仪器判断为阳性)。因此，带菌水稻种子检测结果为阳性，健康水稻种子样品检测结果为阴性，与预期结果完全一致，见图3。
上述结果表明，实施例1所提供的检测水稻细菌性条斑病菌的特异性引物和探针的特异性高，适用于水稻种子样品的检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽出入境检验检疫局检验检疫技术中心 中国检验检疫科学研究院 中华人民共和国张家港出入境检验检疫局
<120> 一种利用数字PCR检测水稻细菌性条斑病菌的方法及试剂盒
<130> KHP171114221.0
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgttgaccc gcgccctgtt ctg 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgacgacgac ggcaagtgag tgac 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tttcaaaggg cagggctatc tgct 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctatctgctg attccggcaa atgt 24
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggcgtggcca aggcc 15
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gacggccacg accttgac 18
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgccgaagaa gtcgaaggcg aggcgc 26

Claims (8)

1.检测水稻细菌性条斑病菌的特异性引物对和探针组合，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的特异性引物对和探针组合，其特征在于，所述探针的5’标记FAM，3’标记TAMRA。
3.含有权利要求1所述特异性引物对和探针组合的试剂盒。
4.权利要求1-2任一所述特异性引物对和探针组合或权利要求3所述的试剂盒在检测水稻细菌性条斑病菌中的应用。
5.一种利用数字PCR检测水稻细菌性条斑病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)以提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物对和探针组合，进行数字PCR扩增反应；
(3)检测PCR扩增产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中数字PCR扩增其20μl的反应体系为：10μl 2×SuperMix，10μM的上、下游引物各1μl，10μM特异性探针0.5μl，2μl基因组DNA，ddH2O补足至20μl。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中进行数字PCR扩增反应的程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s，67℃退火及延伸60s，共40个循环；98℃固化微滴10min。
8.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，根据检测得到的扩增信号判定待测样品是否携带水稻细菌性条斑病菌，出现明显区别于阴性反应孔的扩增信号，表明待测样品基因组中携带水稻细菌性条斑病菌。
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