CN113684314B - 一种基于CRISPR-Cas系统检测RBSDV病毒的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas系统检测RBSDV病毒的试剂盒及检测方法，属于分子检测技术领域。本发明公开的一种基于CRISPR‑Cas系统检测RBSDV病毒的检测方法，包括带毒样本的快速制备、反转录‑恒温扩增扩增体系的建立、基于4个CRISPR‑Cas系统的核酸检测系统、荧光信号的收集及结果的可视化呈现四个主要步骤。本发明方法不仅可以对RBSDV的单位点进行检测，而且还可以在一个反应内进行双位点的同步检测，检测结果可通过肉眼可视化读取；该检测方法可直接应用于田间灰飞虱群体体内带毒率的实时监测、对于RBSDV病毒的传播预防及防治等具有很高的应用价值。

Description

一种基于CRISPR-Cas系统检测RBSDV病毒的试剂盒及检测 方法

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，更具体的说是涉及一种基于CRISPR-Cas系统检测RBSDV病毒的试剂盒及检测方法。

背景技术

水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarfvirus，RBSDV)，是一种跨多物种传播的病毒性病害，严重威胁水稻、小麦及玉米等重要农作物的产量。该病毒属于植物呼肠孤病毒科(Reoviruses)斐济病毒属(Fijivirus)，由10条双链RNA组成，命名为S1～S10，可引起水稻的矮缩病、玉米的粗缩病及小麦的绿矮病。该病症在田间主要表现为植株的矮缩、叶片颜色浓绿、同时在叶片、叶鞘等位置出现白色蜡状条纹突起，严重影响作物产量。该病毒由白背灰飞虱(small brown planthopper，SBPH)传播，能够在不同的作物中迁飞从而引起持续性病害。白背灰飞虱在春小麦上取食带病毒材料后，感染并扩繁病毒，带病毒的灰飞虱传播侵染夏玉米及早稻，最终南方晚稻过冬，来年再次侵染春小麦，从而产生循环持续性跨物种病害。因此，及时对田间灰飞虱群体及侵染宿主材料的带毒率检测可为预防RBSDV病毒流行传播及病害防治提供重要依据。

目前，对灰飞虱、水稻、小麦及玉米等感染RBSDV病毒的检测手段主要有：接种后表型观察、基于抗体的酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)以及基于核酸扩增的RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)、RT-RPA(reverse transcription-recombinase polymerase amplification)等。通过接种后的表型观察耗费时间较长，一般在接种后至少30天才有肉眼可见的表型；此外，灰飞虱的带毒性检测还需借助扫描电镜等昂贵设备，更不适合大量样本的快速检测。虽然ELISA方法具有检测速度快的特点，但是高特异性抗体的制备不仅花费高而且耗时长，对于保守性高的病毒小种间更是难以制备高特异性的小种特异性抗体。因此，当前应用较多的还是基于扩增检测的PCR或RT-RPA，前者依赖于PCR仪等专用设备，后者通过恒温扩增避免了对PCR扩增仪的要求，然而两种方法不仅需要设计高特异性的扩增引物，而且对扩增底物的质量要求较高，无法排除非特异性扩增带来的假阳性风险。

因此，提供一种基于CRISPR-Cas系统检测RBSDV病毒的试剂盒及检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于CRISPR-Cas系统检测RBSDV病毒的试剂盒及检测方法，是一种具有快速、高灵敏度、高特异性、高准确度、操作简单与肉眼可视化读取等特点的RBSDV检测方法；不仅用于单只灰飞虱的RBSDV带毒情况的检测，而且还适用于传播途径中的各种宿主，如水稻、小麦及玉米等作物的病毒侵染情况检测。本发明将为RBSDV在各种传播介质上提供快速简单高通量的检测方法，为RBSDV在田间实时检测诊断及病毒的传播防治等提供重要依据。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

RBSDV由10条双链RNA组成，命名为S1～S10。S1～S10均可设计CRISPR-Cas系统的靶位点，本发明以S1、S10为例进行说明。CRISPR-AsCas12a、CRISPR-LbCas12a、CRISPR-LwCas13a、CRISPR-RfCas13d这4个系统在检测样品时，择一使用即可，采用一个系统检测一个位点，即可确定样品是否带毒；如果进行双位点检测(提高结果的确定性)，需要采用Cas12与Cas13组合与不同的荧光探针，否则会因为Cas蛋白对探针的非特异性剪切，不能确定是哪个位点起作用。另外，CRISPR-Cas旁切荧光检测与侧向试纸条检测择一使用即可获得肉眼可见的结果。采用本发明的试剂盒时，可以根据实际情况单独或组合使用本发明的技术方案。

本发明主要包括RBSDV病毒粗提取样本的快速制备、RT-RPA扩增、CRISPR-Cas旁切荧光检测或侧向试纸条检测以及检测结果呈现四个步骤。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于CRISPR-Cas系统检测RBSDV病毒的试剂盒及检测方法，具有如下有益效果：

(1)样品制备时间大大缩短，可在5分钟内完成。

(2)检测灵敏度极高，可检测1aM浓度的目标分子。

(3)检测特异性高，能够实现RBSDV的单位点或双位点在同一反应体系内完成检测。

(4)检测结果的肉眼可视化读取，结果既可通过便携式的手持式荧光仪对FAM或HEX进行荧光获取，又可通过侧向流试纸条直接读取。

(5)相对于已有的PCR检测，该检测技术检测迅速，从样品制备到结果呈现可在30min内完成。

本发明方法不仅能对单只灰飞虱、还对带毒的水稻、小麦及玉米叶片等进行RBSDV病毒的快速、特异、高灵敏性检测，从样品的制备到检测结果呈现可在30min内完成，不仅可以对RBSDV的单位点进行检测，而且还可以在一个反应内进行双位点的同步检测，检测结果可通过肉眼可视化读取，相对于传统的RT-PCR、RT-RPA、ELISA等检测方法，大大缩短了检测时间，该检测方法可直接应用于田间灰飞虱群体体内带毒率的实时监测、对于RBSDV病毒的传播预防及防治等具有很高的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明基于AsCas12a、LbCas12a、LwCas13a及RfCas13d系统对灰飞虱携带RBSDV的快速检测；

图2附图为本发明利用LbCas12a系统对灰飞虱携带RBSDV进行侧向试纸条检测；

图1-图2中，A、B、C均为带毒灰飞虱样本；D为不带毒灰飞虱样本；

图3附图为本发明基于AsCas12a、LbCas12a、LwCas13a及RfCas13d系统对水稻中RBSDV的快速检测；

图4附图为本发明利用LbCas12a系统对水稻中RBSDV进行侧向试纸条检测；

图3-图4中，A、B、C均为带毒水稻叶片；D为不带毒水稻叶片；

图5附图为本发明基于AsCas12a、LbCas12a、LwCas13a及RfCas13d系统对小麦中RBSDV的快速检测；

图6附图为本发明利用LbCas12a系统对小麦中RBSDV进行侧向试纸条检测；

图5-图6中，A、B、C均为带毒小麦叶片；D为不带毒小麦叶片；

图7附图为本发明基于AsCas12a、LbCas12a、LwCas13a及RfCas13d系统对玉米中RBSDV的快速检测；

图8附图为本发明利用LbCas12a系统对玉米中RBSDV进行侧向试纸条检测；

图7-图8中，A、B、C均为带毒玉米叶片；D为不带毒玉米叶片；

图9附图为本发明基于LbCas12a和LwCas13a系统对玉米中RBSDV的双位点同时检测；

其中，A、B、C均为带毒玉米叶片；D为不带毒玉米叶片；

图1-图9中，“+”代表阳性；“-”代表阴性；

图10附图为本发明基于LbCas12a系统对玉米RBSDV粗提取样本稀释液的检测；

图11附图为本发明基于AsCas12a系统对体外转录的S5部分RNA片段检测灵敏度分析；

图12附图为本发明基于LbCas12a系统对体外转录的S5部分RNA片段检测灵敏度分析；

图13附图为本发明基于LwCas13a系统对体外转录的S5部分RNA片段检测灵敏度分析；

图14附图为本发明基于RfCas13d系统对体外转录的S5部分RNA片段检测灵敏度分析。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1靶位点的选择及crRNA的制备

1)在RBSDV的S5上分别设计了靶向DNA的CRISPR-AsCas12a及CRISPR-LbCas12a系统的靶位点，序列为“GCTTTTTGCCATTTTAGCAA；SEQ ID NO.1”；靶向RNA的CRISPR-LwCas13a及CRISPR-RfCas13d系统的靶位点，序列为“GUUAUCGGCUUGUUCGUGGUUGAGAAUUCU；SEQ IDNO.2”。

对于双位点检测，在S10基因上设计了靶向DNA的CRISPR-AsCas12a及CRISPR-LbCas12a系统的靶位点，序列为“CTACCTCCAAACTTGATGCT；SEQ ID NO.3”；靶向RNA的CRISPR-LwCas13a及CRISPR-RfCas13d系统的靶位点，序列为“CACGUUCUAUUUGUUCAGCAUCAAGUUUGG；SEQ ID NO.4”。

2)分别合成靶向crRNA的相关引物如下所示：

As-S5-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTCTTGTAGAT-3’；SEQ IDNO.5；

As-S5-R：5’-TTGCTAAAATGGCAAAAAGCATCTACAAGAGTAGAAATTA-3’；SEQ ID NO.6；

Lb-S5-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGT-3’；SEQ ID NO.7；

Lb-S5-R：5’-TTGCTAAAATGGCAAAAAGCATCTACACTTAGTAGAAATTA-3’；SEQ ID NO.8；

Lw-S5-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGG-3’；SEQ ID NO.9；

Lw-S5-R：5’-AGAATTCTCAACCACGAACAAGCCGATAACGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAG-3’；SEQ ID NO.10；

Rf-S5-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGTAAACCCCTACCAACTGGTCGGGGTTTG-3’；SEQ ID NO.11；

Rf-S5-R：5’-AGAATTCTCAACCACGAACAAGCCGATAACGTTTCAAACCCCGACCAGTTGGTAGGGG-3’；SEQ ID NO.12；

As-S10-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTCTTGTAGAT-3’；SEQ IDNO.13；

As-S10-R：5’-AGCATCAAGTTTGGAGGTAGATCTACAAGAGTAGAAATTA-3’；SEQ ID NO.14；

Lb-S10-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGT-3’；SEQ IDNO.15；

Lb-S10-R：5’-AGCATCAAGTTTGGAGGTAGATCTACACTTAGTAGAAATTA-3’；SEQ IDNO.16；

Lw-S10-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGG-3’；SEQ ID NO.17；

Lw-S10-R：5’-CCAAACTTGATGCTGAACAAATAGAACGTGGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAG-3’；SEQ ID NO.18；

Rf-S10-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGTAAACCCCTACCAACTGGTCGGGGTTTG-3’；SEQ ID NO.19；

Rf-S10-R：5’-CCAAACTTGATGCTGAACAAATAGAACGTGGTTTCAAACCCCGACCAGTTGGTAGGGG-3’；SEQ ID NO.20。

3)分别将合成的F、R向引物以100nM浓度进行稀释，后建立50μL反应体系，分别加入上下游引物各1.5μl，25μl DNA聚合酶扩增Mix(Kapa，kk2602)，剩余用水补齐，然后置于PCR仪中退火得到双链DNA，将PCR产物进行纯化。

4)体外转录使用T7转录试剂盒(Vazyme，TR102-02)

将纯化后的PCR产物作为转录模板，转录体系包括：rNTP Mix 8μL，10×Buffer 2μL，T7 Enzyme Mix 2μL，模板0.5μg，加水至20μL。37℃恒温反应3h(或者过夜反应)，反应结束后加入1μL DNase I，19μL水混合均匀，37℃反应30min消化DNA。

5)异丙醇沉淀纯化crRNA

将转录产物转移至1.5mL离心管中，加入500μL抽提缓冲液(300mM NaAc pH 5.5，1mM EDTA，0.25％SDS)，再加入500μL冰浴的异丙醇均匀混合，-80℃沉淀30min，20000×g离心(4℃)，30min，去除上清，用冰浴的75％乙醇清洗沉淀，20000×g离心(4℃)，2min，去除上清，将离心管放置在冰上开盖晾干10min，加水溶解并分装保存于-80℃备用。

获得的crRNA序列如下：

As-S5-crRNA：UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGCUUUUUGCCAUUUUAGCAA；SEQ ID NO.21；

Lb-S5-crRNA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCUUUUUGCCAUUUUAGCAA；SEQ ID NO.22；

Lw-S5-crRNA：GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGUUAUCGGCUUGUUCGUGGUUGAGAAUUCU；SEQ ID NO.23；

Rf-S5-crRNA：CAAGUAAACCCCUACCAACUGGUCGGGGUUUGAAACGUUAUCGGCUUGUUCGUGGUUGAGAAUUCU；SEQ ID NO.24；

As-S10-crRNA：UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUCAGACCCUAACGAACAACG；SEQ ID NO.25；

Lb-S10-crRNA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCAGACCCUAACGAACAACG；SEQ ID NO.26；

Lw-S10-crRNA：GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCACGUUCUAUUUGUUCAGCAUCAAGUUUGG；SEQ ID NO.27；

Rf-S10-crRNA：CAAGUAAACCCCUACCAACUGGUCGGGGUUUGAAACCACGUUCUAUUUGUUCAGCAUCAAGUUUGG；SEQ ID NO.28。

实施例2AsCas12a、LbCas12a、LwCas13a和RfCas13d蛋白的制备

结合缓冲液：25mM Tris(pH＝8.0)，1000mM NaCl，10％glycerol，10mM咪唑。使用时加入5mM tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)，0.4mM phenylmethane sulfonylfluoride(PMSF)，1片EDTA-free蛋白酶抑制剂(Roche，04693132001)(50mL溶液)。

清洗缓冲液：25mM Tris(pH＝8.0)，1000mM NaCl，10％glycerol，20mM咪唑。使用时加入5mM TCEP。

洗脱缓冲液：25mM Tris(pH＝8.0)，500mM NaCl，10％glycerol，200mM咪唑。使用时加入5mM TCEP。

分子筛平衡缓冲液：25mM Tris(pH＝8.0)，150mM NaCl，1mM TCEP和5％glycerol。

分子筛洗脱缓冲液：25mM Tris(pH＝8.0)，1000mM NaCl，1mM TCEP和5％glycerol。

S200缓冲液：10mM Hepes(pH 7.0)，1000mMNaCl，5mM MgCl₂，1mM TCEP。

蛋白存储液：50mM Hepes(pH 7.5)，600mM NaCl，1mM TCEP，20％甘油。

AsCas12a、LbCas12a、LwCas13a和RfCas13d蛋白制备方法如下：

1)分别将AsCas12a、LbCas12a、LwCas13a和RfCas13d的CDS序列(分别如SEQ IDNO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32所示)构建到pET-30a(+)蛋白表达载体中，选择BamHI位点酶切，利用重组酶将目标序列构建到载体上，并将构建好的融合His标签的Cas蛋白原核表达载体转化到BL21(DE3)菌株中。

2)挑取单克隆于5mL含50μg/ml卡那抗性的液体LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜。

3)按1：200的比例转接到1L含50μg/mlKana抗性的液体LB培养基中，37℃，200rpm，培养至OD₆₀₀在0.7-0.75。

4)将培养瓶置于冰上放置1h，加入0.5mM isopropyl-b-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)，18℃，140rpm，培养14–16h。

以下步骤均在4℃进行:

5)6,000g离心20min，收集菌体，后加入45mL结合缓冲液重悬菌体。

6)超声波破碎菌体9min(3sec on，3sec off)，后25000g离心20min，同时将Ni-NTA琼脂糖介质依次用5倍柱体积的ddH₂O，5倍柱体积的结合缓冲液进行清洗，后备用。

7)细菌裂解液离心后取上清，加入清洗后的Ni-NTA琼脂糖介质(1L菌体裂解液加入1mLNi-NTA琼脂糖介质)。4℃，旋转孵育60-90min。

8)将样品加入到收集柱中，通过重力自然流出。

9)加入20倍柱体积的清洗缓冲液，直到在流出物中没有物质流出。

10)加入15mL洗脱缓冲液进行洗脱。

11)利用100,000-MWCO蛋白超滤管将样品中的洗脱缓冲液替换为分子筛平衡缓冲液，期间将阳离子交换柱HiTrap SP HP安装到AKTAprime plus蛋白纯化仪上，并依次用5倍柱体积的ddH₂O，5倍柱体积的分子筛平衡缓冲液进行清洗。

12)在平衡后的柱子上加入处理后的样品，上样速度为1mL/min。

13)用平衡缓冲液洗涤至少5到10个柱体积，直到吸收达到平稳的基线。

14)用0.15-1M分子筛洗脱缓冲液进行线性梯度洗脱，并收集各组分。

15)取各组分跑7.5％的SDS-PAGE胶，收集含有洗脱蛋白的各组分。

16)利用100,000-MWCO蛋白超滤管将样品中的分子筛洗脱缓冲液替换为S200缓冲液。

17)将分子筛S20010/300GL安装到AKTAprime plus蛋白纯化仪上，平衡缓冲过夜。

18)在平衡后的柱子上加入处理后的样品，上样速度为1mL/min。

19)取目标分子量附近蛋白组分跑7.5％的SDS-PAGE胶，收集含有洗脱蛋白的各组分。

20)利用100,000-MWCO蛋白超滤管将含有洗脱蛋白组分的S200缓冲液替换为蛋白存储液。

分别将AsCas12a、LbCas12a、LwCas13a和RfCas13d蛋白浓度调为2mg/mL，分装后于-80℃保存备用。

实施例3RT-RPA恒温扩增反应

1)RT-RPA恒温扩增反应引物的设计

采用网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/进行RPA引物设计，扩增产物长度为200-400bp，其中对于靶向RNA的CRISPR-Cas系统(即CRISPR-LwCas13a和CRISPR-RfCas13d系统)，一条引物的一端需要引入T7序列，具体扩增引物序列如下所示：

S5-F：5’-CGAAAGTGAAGATGACCACAGATCCTTCCG-3’；SEQ ID NO.33；

S5-R：5’-ACTGAATCAACAATCGAGTCAATTGTTTGG-3’；SEQ ID NO.34；

(T7)S5-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGAAAGTGAAGATGACCACAGATCCTTCCG-3’；SEQ ID NO.35；

S10-F：5’-CATGATAGACTACAAACCGTAGAAACTAGC-3’；SEQ ID NO.36；

S10-R：5’-GAGCAGGAACTTCACGACAACATTTATCTA-3’；SEQ ID NO.37；

(T7)S10-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCATGATAGACTACAAACCGTAGAAACTAGC-3’；SEQ ID NO.38。

2)单头灰飞虱或侵染水稻、小麦及玉米RBSDV样本的粗制备方法

(1)取单头灰飞虱或50mg接种侵染14天后的水稻、小麦及玉米叶片，置于1.5ml离心管中。

(2)单头灰飞虱加入20μl裂解液(BIO-RAD，170-8898)，其他样品加入100μl裂解液，插入研磨棒触壁室温研磨1min，温育4min(80℃裂解效果更好)。

(3)裂解液直接加入到RT-RPA反应体系中进行扩增反应。

3)RT-RPA恒温扩增反应

(1)反应体系：RPA-F引物(10μM)2.4μL，RPA-R引物(10μM)2.4μL，buffer 29.5μL，模板2μL，0.5μl反转录酶(NEB，M0368L)，加水补齐到47.5μL，混合均匀后加入2.5μLMgOAc立即反应。

针对S5，CRISPR-AsCas12a、CRISPR-LbCas12a系统所用引物为S5-F/S5-R；CRISPR-LwCas13a、CRISPR-RfCas13d系统所用引物为为(T7)S5-F/S5-R。

针对S10，CRISPR-AsCas12a、CRISPR-LbCas12a系统所用引物为S10-F/S10-R；CRISPR-LwCas13a、CRISPR-RfCas13d系统所用引物为(T7)S10-F/S10-R。

(2)将RT-RPA反应体系置于42℃恒温金属浴中反应20-30min。

(3)结束后扩增产物直接用作CRISPR-Cas检测反应检测底物。

实施例4CRISPR-Cas侧切活性检测靶标分子

1)建立CRISPR-Cas检测体系如下：

(1)AsCas12a检测体系：2μL NEB CutSmart Buffer(10×)，100nM AsCas12a蛋白，1μL ssDNA探针(40μM)，1μL As-crRNA(20ng/μL)，1μL检测底物，用Nuclease-free水补充至20μL。

(2)LbCas12a检测体系：2μL NEB CutSmart Buffer(10×)，100nM LbCas12a蛋白，1μL ssDNA探针(40μM)，1μL Lb-crRNA(20ng/μL)，1μL检测底物，用Nuclease-free水补充至20μL。

(1)和(2)中，ssDNA探针的序列如下：

Poly C：5’-CCCCCCCC-3’；SEQ ID NO.39；

探针5’端标记荧光报告基团，优选为FAM；3’端标记荧光淬灭基团，优选为BHQ1。

(3)LwCas13a检测体系：2μL NEB CutSmart Buffer(10×)，100nM LwCas13a蛋白，1μL ssRNA探针(40μM)，0.05μL T7聚合酶(M0251L)，0.8μL rNTP Mix(NEB，N0466L)，0.5μLRNA酶抑制剂(NEB，M0314L)，1μL Lw-crRNA(20ng/μL)，1μL检测底物，用Nuclease-free水补充至20μL。

(4)RfCas13d检测体系：2μL NEB CutSmart Buffer(10×)，100nM RfCas13d蛋白，1μL ssRNA探针(40μM)，0.05μL T7聚合酶(M0251L)，0.8μL rNTP Mix(NEB，N0466L)，0.5μLRNA酶抑制剂(NEB，M0314L)，1μL Rf-crRNA(20ng/μL)，1μL检测底物，用Nuclease-free水补充至20μL。

(3)和(4)中，ssRNA探针的序列如下：

Poly rU：5’-rUrUrUrUrU-3’；

探针5’端标记荧光报告基团，优选为FAM；3’端标记荧光淬灭基团，优选为BHQ1。

2)将反应置于37℃荧光仪中，每5min采集一次荧光信号，检测时间通常是10-60min，并可取出置于手持式荧光灯下进行拍照。

实施例5侧向试纸条检测体系

1)建立CRISPR-LbCas12a适用于试纸条的检测反应体系如下：

2μL NEB CutSmart Buffer(10×)，100nM LbCas12a，1μL探针(20μM)，1μL Lb-crRNA(20ng/μL)，1μL检测底物，用Nuclease-free水补充至20μL。

侧向流试纸条探针的序列如下：

5’-CCCCCCCC-3’；SEQ ID NO.40；

探针5’端标记荧光报告基团，优选为FAM；3’端标记Biotin。

2)试纸条试剂盒(Milenia，MGHD1)，反应结束后将20μL检测液加入到80μL试纸条反应buffer中，混合均匀，插入试纸条，观察显色条带。

实施例6单只灰飞虱带毒样本的快速检测

分别取带毒和不带毒的灰飞虱，按照实施例3样品快速制备方式进行样本的制备，检测位点为RBSDV S5基因上选择的靶位点，报告分子荧光标记为FAM基团，分别经过RT-RPA扩增，AsCas12a、LbCas12a、LwCas13及RfCas13d进行CRISPR-Cas旁切剪切，最后进行结果的读取。

检测结果：AsCas12a、LbCas12a、LwCas13及RfCas13d系统均可对带RBSDV病毒和不带RBSDV病毒的单头灰飞虱进行有效检测，表现为：不带毒灰飞虱样本荧光值信号极低，读取与水对照相同，3头带毒灰飞虱样本在四个系统中均获得较高的荧光值。反应20min后，通过手持式荧光仪对反应进行照射后，带毒灰飞虱样品有肉眼可见绿色荧光，不带毒灰飞虱样本无荧光信号，见图1。此外，利用LbCas12a系统进行侧向试纸条检测发现，不带毒的灰飞虱样本只有质控带一条条带，而带RBSDV病毒的灰飞虱样本除质控带外，还有一条检测带，见图2。

实施例7带毒与不带毒灰飞虱侵染的水稻幼苗快速检测

分别选取带毒与不带毒灰飞虱侵染后14天的水稻幼苗，按照实施例3样品快速制备方式进行样本的制备，RBSDV S5基因上选择的靶位点，报告分子荧光标记为FAM基团，分别经过RT-RPA扩增，AsCas12a、LbCas12a、LwCas13及RfCas13d进行CRISPR-Cas旁切剪切，最后进行结果的读取。

检测结果：AsCas12a、LbCas12a、LwCas13及RfCas13d系统均可对带毒与不带毒水稻叶片进行有效快速检测，不带毒水稻叶片荧光值信号极低，读取与水对照相同，3份水稻带毒叶片在四个系统中均获得较高的荧光值。反应20min后，通过手持式荧光仪对反应进行照射后，RBSDV侵染的阳性样品有肉眼可见绿色荧光，阴性样品样本无荧光信号，见图3。此外，利用LbCas12a系统进行侧向试纸条检测发现，不带毒的水稻叶片只有质控带一条条带，而带RBSDV病毒的水稻叶片除质控带外，还有一条检测带，见图4。

实施例8带毒与不带毒灰飞虱侵染的小麦幼苗快速检测

分别选取带毒与不带毒灰飞虱侵染后14天的小麦幼苗，按照实施例3样品快速制备方式进行样本的制备，RBSDV S5基因上选择的靶位点，报告分子荧光标记为FAM基团，分别经过RT-RPA扩增，AsCas12a、LbCas12a、LwCas13及RfCas13d进行CRISPR-Cas旁切剪切，最后进行结果的读取。

检测结果：AsCas12a、LbCas12a、LwCas13及RfCas13d系统均可对带毒与不带毒小麦叶片进行有效快速检测，不带毒小麦叶片荧光值信号极低，读取与水对照相同，3份水稻带毒叶片荧光值在四个系统中均获得较高的荧光值。反应20min后，通过手持式荧光仪对反应进行照射后，RBSDV侵染的阳性样品有肉眼可见绿色荧光，阴性样品样本无荧光信号，见图5。此外，利用LbCas12a系统进行侧向试纸条检测发现，不带毒的小麦叶片只有质控带一条条带，而带RBSDV病毒的水稻叶片除质控带外，还有一条检测带，见图6。

实施例9带毒与不带毒灰飞虱侵染的玉米幼苗快速检测

分别选取带毒与不带毒灰飞虱侵染后14天的玉米幼苗，按照实施例3样品快速制备方式进行样本的制备，RBSDV S5基因上选择的靶位点，报告分子荧光标记为FAM基团，分别经过RT-RPA扩增，AsCas12a、LbCas12a、LwCas13及RfCas13d进行CRISPR-Cas旁切剪切，最后进行结果的读取。

检测结果：AsCas12a、LbCas12a、LwCas13及RfCas13d系统均可对带毒与不带毒玉米叶片进行有效快速检测，不带毒玉米叶片荧光值信号极低，读取与水对照相同，3份玉米带毒叶片荧光值在四个系统中均获得较高的荧光值。反应20min后，通过手持式荧光仪对反应进行照射后，RBSDV侵染的阳性样品有肉眼可见绿色荧光，阴性样品样本无荧光信号，见图7。此外，利用LbCas12a系统进行侧向试纸条检测发现，不带毒的玉米叶片只有质控带一条条带，而带RBSDV病毒的玉米叶片除质控带外，还有一条检测带，见图8。

实施例10带毒与不带毒灰飞虱侵染的玉米幼苗双位点复合检测

为实现RBSDV的双位点复合检测，选择靶向S10序列上的LwCas13a系统，报告分子为FAM标记的ssRNA探针；同时选择靶向S5序列上的LbCas12a系统，报告分子为HEX标记的ssDNA探针。

分别选取带毒与不带毒灰飞虱侵染后14天的玉米幼苗，按照实施例3样品快速制备方式进行样本的制备，对以上双位点在同一反应内进行复合RT-RPA扩增反应，后取复合RT-RPA扩增反应产物加入LbCas12a蛋白、LwCas13a蛋白、Lw-S10-crRNA分子、Lb-S5-crRNA分子、ssDNA探针和ssRNA探针等进行旁切检测反应，荧光信号同时收集FAM通道及HEX通道，反应30min后样品经过手持式荧光显微镜对两种荧光进行成像。

结果：检测发现，带RBSDV病毒的样品可在一个反应内同时检测出S5和S10两个位点，而阴性样品和水对照均无信号检出，见图9。

实施例11利用LbCas12a系统进行玉米RBSDV病毒侵染样品粗提取液的稀释检测

按照实施例3样品快速制备方式进行玉米RBSDV病毒侵染样品粗提取液的制备，对RBSDV侵染的玉米叶片的粗提取制备液分别进行不同倍数的稀释，稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4及10^-5共5个稀释倍数，后进行RT-RPA扩增及LbCas12a检测，确定利用粗提取进行病原菌检测的灵敏性。

结果：LbCas12a系统可对10^-3稀释梯度进行检测，肉眼也可观察到明显荧光，见图10。

实施例12利用CRISPR-Cas系统进行RBSDV病毒检测的灵敏性检测

利用常规trizol法提取侵染BRSDV病毒玉米材料的总RNA，通过反转录试剂盒反转录成cDNA(SuperScript^TM III First-Strand Synthesis System，18080051)，使用(T7)S5-F和S5-R对cDNA扩增目标片段并回收纯化。后使用T7转录试剂盒将回收片段转录成RNA并回收纯化，分光光度计测定RNA浓度并换算成摩尔浓度，将RNA按照10倍梯度稀释制备不同摩尔浓度的底物模板(10nM-1aM)，直接利用CRISPR-Cas13系统进行检测灵敏度测试；同时将梯度模板进行RT-RPA，产物利用CRISPR-Cas系统进行检测灵敏度测试。

S5-F：5’-CGAAAGTGAAGATGACCACAGATCCTTCCG-3’；SEQ ID NO.33；

S5-R：5’-ACTGAATCAACAATCGAGTCAATTGTTTGG-3’；SEQ ID NO.34；

(T7)S5-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGAAAGTGAAGATGACCACAGATCCTTCCG-3’；SEQ ID NO.35；

检测结果：LwCas13a及RfCas13d可以不经过RT-RPA扩增对目标RNA分子直接进行检测，检测灵敏度为1nM；而经过RT-RPA扩增后，AsCas12a、LbCas12a及LwCas13a30min可对1aM浓度的RNA分子进行检测，RfCas13d需要60min实现对1aM浓度的RNA分子进行检测，见图11-图14。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种基于CRISPR-Cas系统检测RBSDV病毒的试剂盒及检测方法

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gctttttgcc attttagcaa 20

<210> 2

<211> 30

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

guuaucggcu uguucguggu ugagaauucu 30

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ctacctccaa acttgatgct 20

<210> 4

<211> 30

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cacguucuau uuguucagca ucaaguuugg 30

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aattctaata cgactcacta tagggtaatt tctactcttg tagat 45

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ttgctaaaat ggcaaaaagc atctacaaga gtagaaatta 40

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

aattctaata cgactcacta tagggtaatt tctactaagt gt 42

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ttgctaaaat ggcaaaaagc atctacactt agtagaaatt a 41

<210> 9

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

aattctaata cgactcacta taggggattt agactacccc aaaaacgaag ggg 53

<210> 10

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

agaattctca accacgaaca agccgataac gttttagtcc ccttcgtttt tggggtag 58

<210> 11

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

aattctaata cgactcacta tagggcaagt aaacccctac caactggtcg gggtttg 57

<210> 12

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

agaattctca accacgaaca agccgataac gtttcaaacc ccgaccagtt ggtagggg 58

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

aattctaata cgactcacta tagggtaatt tctactcttg tagat 45

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

agcatcaagt ttggaggtag atctacaaga gtagaaatta 40

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

aattctaata cgactcacta tagggtaatt tctactaagt gt 42

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

agcatcaagt ttggaggtag atctacactt agtagaaatt a 41

<210> 17

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

aattctaata cgactcacta taggggattt agactacccc aaaaacgaag ggg 53

<210> 18

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

ccaaacttga tgctgaacaa atagaacgtg gttttagtcc ccttcgtttt tggggtag 58

<210> 19

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

aattctaata cgactcacta tagggcaagt aaacccctac caactggtcg gggtttg 57

<210> 20

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

ccaaacttga tgctgaacaa atagaacgtg gtttcaaacc ccgaccagtt ggtagggg 58

<210> 21

<211> 40

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

uaauuucuac ucuuguagau gcuuuuugcc auuuuagcaa 40

<210> 22

<211> 41

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

uaauuucuac uaaguguaga ugcuuuuugc cauuuuagca a 41

<210> 23

<211> 66

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacguua ucggcuuguu cgugguugag 60

aauucu 66

<210> 24

<211> 66

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

caaguaaacc ccuaccaacu ggucgggguu ugaaacguua ucggcuuguu cgugguugag 60

aauucu 66

<210> 25

<211> 40

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

uaauuucuac ucuuguagau ucagacccua acgaacaacg 40

<210> 26

<211> 41

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

uaauuucuac uaaguguaga uucagacccu aacgaacaac g 41

<210> 27

<211> 66

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacgucu cugggguaca ccauuaugga 60

uaagau 66

<210> 28

<211> 66

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

caaguaaacc ccuaccaacu ggucgggguu ugaaacgucu cugggguaca ccauuaugga 60

uaagau 66

<210> 29

<211> 3918

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

acacagttcg agggctttac caacctgtat caggtgagca agacactgcg gtttgagctg 60

atcccacagg gcaagaccct gaagcacatc caggagcagg gcttcatcga ggaggacaag 120

gcccgcaatg atcactacaa ggagctgaag cccatcatcg atcggatcta caagacctat 180

gccgaccagt gcctgcagct ggtgcagctg gattgggaga acctgagcgc cgccatcgac 240

tcctatagaa aggagaaaac cgaggagaca aggaacgccc tgatcgagga gcaggccaca 300

tatcgcaatg ccatccacga ctacttcatc ggccggacag acaacctgac cgatgccatc 360

aataagagac acgccgagat ctacaagggc ctgttcaagg ccgagctgtt taatggcaag 420

gtgctgaagc agctgggcac cgtgaccaca accgagcacg agaacgccct gctgcggagc 480

ttcgacaagt ttacaaccta cttctccggc ttttatgaga acaggaagaa cgtgttcagc 540

gccgaggata tcagcacagc catcccacac cgcatcgtgc aggacaactt ccccaagttt 600

aaggagaatt gtcacatctt cacacgcctg atcaccgccg tgcccagcct gcgggagcac 660

tttgagaacg tgaagaaggc catcggcatc ttcgtgagca cctccatcga ggaggtgttt 720

tccttccctt tttataacca gctgctgaca cagacccaga tcgacctgta taaccagctg 780

ctgggaggaa tctctcggga ggcaggcacc gagaagatca agggcctgaa cgaggtgctg 840

aatctggcca tccagaagaa tgatgagaca gcccacatca tcgcctccct gccacacaga 900

ttcatccccc tgtttaagca gatcctgtcc gataggaaca ccctgtcttt catcctggag 960

gagtttaaga gcgacgagga agtgatccag tccttctgca agtacaagac actgctgaga 1020

aacgagaacg tgctggagac agccgaggcc ctgtttaacg agctgaacag catcgacctg 1080

acacacatct tcatcagcca caagaagctg gagacaatca gcagcgccct gtgcgaccac 1140

tgggatacac tgaggaatgc cctgtatgag cggagaatct ccgagctgac aggcaagatc 1200

accaagtctg ccaaggagaa ggtgcagcgc agcctgaagc acgaggatat caacctgcag 1260

gagatcatct ctgccgcagg caaggagctg agcgaggcct tcaagcagaa aaccagcgag 1320

atcctgtccc acgcacacgc cgccctggat cagccactgc ctacaaccct gaagaagcag 1380

gaggagaagg agatcctgaa gtctcagctg gacagcctgc tgggcctgta ccacctgctg 1440

gactggtttg ccgtggatga gtccaacgag gtggaccccg agttctctgc ccggctgacc 1500

ggcatcaagc tggagatgga gccttctctg agcttctaca acaaggccag aaattatgcc 1560

accaagaagc cctactccgt ggagaagttc aagctgaact ttcagatgcc tacactggcc 1620

tctggctggg acgtgaataa ggagaagaac aatggcgcca tcctgtttgt gaagaacggc 1680

ctgtactatc tgggcatcat gccaaagcag aagggcaggt ataaggccct gagcttcgag 1740

cccacagaga aaaccagcga gggctttgat aagatgtact atgactactt ccctgatgcc 1800

gccaagatga tcccaaagtg cagcacccag ctgaaggccg tgacagccca ctttcagacc 1860

cacacaaccc ccatcctgct gtccaacaat ttcatcgagc ctctggagat cacaaaggag 1920

atctacgacc tgaacaatcc tgagaaggag ccaaagaagt ttcagacagc ctacgccaag 1980

aaaaccggcg accagaaggg ctacagagag gccctgtgca agtggatcga cttcacaagg 2040

gattttctgt ccaagtatac caagacaacc tctatcgatc tgtctagcct gcggccatcc 2100

tctcagtata aggacctggg cgagtactat gccgagctga atcccctgct gtaccacatc 2160

agcttccaga gaatcgccga gaaggagatc atggatgccg tggagacagg caagctgtac 2220

ctgttccaga tctataacaa ggactttgcc aagggccacc acggcaagcc taatctgcac 2280

acactgtatt ggaccggcct gttttctcca gagaacctgg ccaagacaag catcaagctg 2340

aatggccagg ccgagctgtt ctaccgccct aagtccagga tgaagaggat ggcacaccgg 2400

ctgggagaga agatgctgaa caagaagctg aaggatcaga aaaccccaat ccccgacacc 2460

ctgtaccagg agctgtacga ctatgtgaat cacagactgt cccacgacct gtctgatgag 2520

gccagggccc tgctgcccaa cgtgatcacc aaggaggtgt ctcacgagat catcaaggat 2580

aggcgcttta ccagcgacaa gttctttttc cacgtgccta tcacactgaa ctatcaggcc 2640

gccaattccc catctaagtt caaccagagg gtgaatgcct acctgaagga gcaccccgag 2700

acacctatca tcggcatcga tcggggcgag agaaacctga tctatatcac agtgatcgac 2760

tccaccggca agatcctgga gcagcggagc ctgaacacca tccagcagtt tgattaccag 2820

aagaagctgg acaacaggga gaaggagagg gtggcagcaa ggcaggcctg gtctgtggtg 2880

ggcacaatca aggatctgaa gcagggctat ctgagccagg tcatccacga gatcgtggac 2940

ctgatgatcc actaccaggc cgtggtggtg ctggagaacc tgaatttcgg ctttaagagc 3000

aagaggaccg gcatcgccga gaaggccgtg taccagcagt tcgagaagat gctgatcgat 3060

aagctgaatt gcctggtgct gaaggactat ccagcagaga aagtgggagg cgtgctgaac 3120

ccataccagc tgacagacca gttcacctcc tttgccaaga tgggcaccca gtctggcttc 3180

ctgttttacg tgcctgcccc atatacatct aagatcgatc ccctgaccgg cttcgtggac 3240

cccttcgtgt ggaaaaccat caagaatcac gagagccgca agcacttcct ggagggcttc 3300

gactttctgc actacgacgt gaaaaccggc gacttcatcc tgcactttaa gatgaacaga 3360

aatctgtcct tccagagggg cctgcccggc tttatgcctg catgggatat cgtgttcgag 3420

aagaacgaga cacagtttga cgccaagggc acccctttca tcgccggcaa gagaatcgtg 3480

ccagtgatcg agaatcacag attcaccggc agataccggg acctgtatcc tgccaacgag 3540

ctgatcgccc tgctggagga gaagggcatc gtgttcaggg atggctccaa catcctgcca 3600

aagctgctgg agaatgacga ttctcacgcc atcgacacca tggtggccct gatccgcagc 3660

gtgctgcaga tgcggaactc caatgccgcc acaggcgagg actatatcaa cagccccgtg 3720

cgcgatctga atggcgtgtg cttcgactcc cggtttcaga acccagagtg gcccatggac 3780

gccgatgcca atggcgccta ccacatcgcc ctgaagggcc agctgctgct gaatcacctg 3840

aaggagagca aggatctgaa gctgcagaac ggcatctcca atcaggactg gctggcctac 3900

atccaggagc tgcgcaac 3918

<210> 30

<211> 3681

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

tcaaagctcg agaaattcac caactgttat tcgttgagca aaacactgcg gtttaaagcg 60

attccagtcg gcaagactca agagaatata gacaataagc ggctgttggt ggaagatgaa 120

aagcgcgcgg aagactacaa aggggtgaag aagttgttgg acagatacta cctctctttt 180

atcaatgatg tcttgcactc aatcaaattg aagaatctga acaactacat ctccctcttc 240

agaaagaaaa caaggacaga aaaggagaat aaggaacttg aaaatttgga gatcaatctg 300

aggaaagaga tcgcgaaagc ctttaaaggc aacgaaggat acaaaagtct gttcaagaag 360

gatataattg agacaatttt gccagagttc ctcgatgaca aggacgagat tgcgctggtc 420

aattcgttca acggattcac aacagcattc acaggcttct ttgataatcg ggaaaatatg 480

ttctctgagg aggcaaagtc cacttctatt gcgttcaggt gtatcaatga gaatctcact 540

aggtacattt ccaacatgga tatctttgag aaggttgacg caatttttga caagcacgaa 600

gttcaggaga ttaaggagaa gatcctcaat tccgattatg acgttgagga cttcttcgaa 660

ggtgagtttt ttaatttcgt gctcactcaa gagggtatcg acgtgtataa tgcgatcatc 720

ggtgggttcg tgactgagtc cggtgaaaag attaagggat tgaacgagta tatcaacctt 780

tacaaccaaa agacgaaaca gaagctgcca aagttcaagc ctctttacaa acaggttctt 840

tcagaccgcg agtcactctc gttctatggg gagggctaca cttcggatga ggaagtcctg 900

gaggtgttca ggaatactct caataagaat tcggagattt tctcttctat aaaaaaactg 960

gaaaagttgt ttaagaattt tgacgaatac tctagcgccg gcatatttgt gaaaaacggc 1020

ccggccatat caacgataag taaagatatc ttcggcgaat ggaacgtgat cagagacaaa 1080

tggaacgcgg agtatgacga tattcacctg aagaagaagg ctgtcgtaac ggagaagtac 1140

gaggatgatc gcaggaaaag cttcaaaaag atcggaagtt tcagcctgga acagttgcag 1200

gagtatgctg acgccgatct tagcgtcgtc gagaagttga aggagataat catccaaaag 1260

gtcgacgaga tatataaagt ctatggatca agtgaaaaac tgttcgacgc cgacttcgtt 1320

ttggagaagt ccctgaagaa gaacgacgct gttgttgcca ttatgaagga tctgctcgac 1380

agcgtgaaga gtttcgagaa ctatattaag gcttttttcg gggaggggaa ggagactaac 1440

agagatgagt ccttctacgg agacttcgtc ctcgcgtacg atatactcct taaggtagac 1500

cacatctacg acgcaatcag aaattacgtg acacaaaagc cgtacagcaa ggacaagttc 1560

aaactctact tccagaaccc ccagttcatg ggcggctggg acaaggacaa ggaaacggat 1620

tacagggcta cgatcctgag gtatggttca aaatactact tggcgattat ggacaagaag 1680

tacgccaagt gtctccagaa gattgacaaa gacgatgtca atggcaatta tgagaagatc 1740

aactacaagc tgcttccggg tccgaacaag atgctcccaa aggttttctt cagcaagaaa 1800

tggatggcct actataaccc aagcgaggac atccagaaga tttataagaa cggtacgttc 1860

aagaagggcg acatgttcaa tcttaacgac tgtcacaagc tgatcgactt cttcaaagac 1920

tcaattagcc ggtacccaaa gtggtctaac gcctatgact tcaacttttc ggaaaccgag 1980

aagtacaagg atatagccgg attttataga gaggtggaag agcagggcta caaggtgtca 2040

ttcgagtccg ccagcaagaa ggaagtggac aagctcgtgg aagagggtaa gctctacatg 2100

ttccagattt ataataaaga ctttagcgat aagagccacg ggacacctaa tctccacaca 2160

atgtatttca agctgctctt cgacgagaat aaccacggcc aaatcaggtt gtcaggaggg 2220

gctgaactct tcatgcggcg cgctagcctt aagaaggagg agcttgtagt ccaccctgcg 2280

aatagtccaa ttgcgaataa gaacccggac aatcctaaaa agactacaac attgagctac 2340

gacgtgtaca aggataagag gttttccgag gatcagtacg agctccacat cccgattgcg 2400

atcaacaagt gcccaaagaa tattttcaag ataaacacag aggtgcgtgt actcctgaag 2460

catgacgaca atccttacgt cattgggatt gatcggggcg agaggaacct cctctatatt 2520

gtggtggtgg acgggaaggg gaacatagtc gaacagtact cccttaacga aataattaac 2580

aatttcaacg gcatccgtat caagaccgac taccattcgt tgctggacaa gaaggagaag 2640

gagagatttg aggcgcggca aaattggaca agtatcgaga acatcaagga actcaaagca 2700

ggttatatct ctcaagttgt gcataagata tgcgagctgg ttgagaagta tgacgcagtg 2760

atcgctcttg aggacctcaa ctcgggcttt aagaattcta gagttaaagt ggagaagcag 2820

gtctatcaaa agttcgagaa gatgcttata gataagctca actacatggt cgataagaaa 2880

tcgaacccat gtgccaccgg cggcgcactc aaaggttacc aaataacaaa caaattcgag 2940

tccttcaaat cgatgagtac tcagaatggg ttcatatttt atataccggc gtggcttacg 3000

tctaagatcg acccgtcaac tggttttgtc aacctgttga agacgaaata cacgtccatt 3060

gccgattcga aaaagttcat atctagtttt gatcgtatta tgtacgtccc agaggaagat 3120

cttttcgagt ttgctctcga ctacaaaaac ttttcgcgga ccgatgcgga ttacattaaa 3180

aaatggaaac tctattcgta cggcaacaga atcaggattt ttcgcaaccc taagaagaat 3240

aacgtctttg attgggagga agtttgcttg actagcgcgt acaaggagct ctttaataag 3300

tatggcatta actaccaaca gggtgatatc agagcactgc tttgcgaaca atctgacaag 3360

gctttctact catccttcat ggctttgatg agcctgatgc tccagatgag aaattcaatt 3420

acaggcagaa ccgacgtgga tttcttgatc tccccggtta aaaattctga tggcatcttt 3480

tacgatagca ggaactatga agcgcaagag aatgcgattc tgccaaaaaa tgcagacgcc 3540

aacggtgcct ataacatcgc caggaaagtc ctgtgggcga tcggccagtt caaaaaggcc 3600

gaagacgaaa aattggacaa ggtcaaaatc gctatcagca acaaagagtg gctggagtat 3660

gctcagacat ccgtaaagca t 3681

<210> 31

<211> 3456

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

atgaaagtga ccaaggtcga cggcatcagc cacaagaagt acatcgaaga gggcaagctc 60

gtgaagtcca ccagcgagga aaaccggacc agcgagagac tgagcgagct gctgagcatc 120

cggctggaca tctacatcaa gaaccccgac aacgcctccg aggaagagaa ccggatcaga 180

agagagaacc tgaagaagtt ctttagcaac aaggtgctgc acctgaagga cagcgtgctg 240

tatctgaaga accggaaaga aaagaacgcc gtgcaggaca agaactatag cgaagaggac 300

atcagcgagt acgacctgaa aaacaagaac agcttctccg tgctgaagaa gatcctgctg 360

aacgaggacg tgaactctga ggaactggaa atctttcgga aggacgtgga agccaagctg 420

aacaagatca acagcctgaa gtacagcttc gaagagaaca aggccaacta ccagaagatc 480

aacgagaaca acgtggaaaa agtgggcggc aagagcaagc ggaacatcat ctacgactac 540

tacagagaga gcgccaagcg caacgactac atcaacaacg tgcaggaagc cttcgacaag 600

ctgtataaga aagaggatat cgagaaactg tttttcctga tcgagaacag caagaagcac 660

gagaagtaca agatccgcga gtactatcac aagatcatcg gccggaagaa cgacaaagag 720

aacttcgcca agattatcta cgaagagatc cagaacgtga acaacatcaa agagctgatt 780

gagaagatcc ccgacatgtc tgagctgaag aaaagccagg tgttctacaa gtactacctg 840

gacaaagagg aactgaacga caagaatatt aagtacgcct tctgccactt cgtggaaatc 900

gagatgtccc agctgctgaa aaactacgtg tacaagcggc tgagcaacat cagcaacgat 960

aagatcaagc ggatcttcga gtaccagaat ctgaaaaagc tgatcgaaaa caaactgctg 1020

aacaagctgg acacctacgt gcggaactgc ggcaagtaca actactatct gcaagtgggc 1080

gagatcgcca cctccgactt tatcgcccgg aaccggcaga acgaggcctt cctgagaaac 1140

atcatcggcg tgtccagcgt ggcctacttc agcctgagga acatcctgga aaccgagaac 1200

gagaacgata tcaccggccg gatgcggggc aagaccgtga agaacaacaa gggcgaagag 1260

aaatacgtgt ccggcgaggt ggacaagatc tacaatgaga acaagcagaa cgaagtgaaa 1320

gaaaatctga agatgttcta cagctacgac ttcaacatgg acaacaagaa cgagatcgag 1380

gacttcttcg ccaacatcga cgaggccatc agcagcatca gacacggcat cgtgcacttc 1440

aacctggaac tggaaggcaa ggacatcttc gccttcaaga atatcgcccc cagcgagatc 1500

tccaagaaga tgtttcagaa cgaaatcaac gaaaagaagc tgaagctgaa aatcttcaag 1560

cagctgaaca gcgccaacgt gttcaactac tacgagaagg atgtgatcat caagtacctg 1620

aagaatacca agttcaactt cgtgaacaaa aacatcccct tcgtgcccag cttcaccaag 1680

ctgtacaaca agattgagga cctgcggaat accctgaagt ttttttggag cgtgcccaag 1740

gacaaagaag agaaggacgc ccagatctac ctgctgaaga atatctacta cggcgagttc 1800

ctgaacaagt tcgtgaaaaa ctccaaggtg ttctttaaga tcaccaatga agtgatcaag 1860

attaacaagc agcggaacca gaaaaccggc cactacaagt atcagaagtt cgagaacatc 1920

gagaaaaccg tgcccgtgga atacctggcc atcatccaga gcagagagat gatcaacaac 1980

caggacaaag aggaaaagaa tacctacatc gactttattc agcagatttt cctgaagggc 2040

ttcatcgact acctgaacaa gaacaatctg aagtatatcg agagcaacaa caacaatgac 2100

aacaacgaca tcttctccaa gatcaagatc aaaaaggata acaaagagaa gtacgacaag 2160

atcctgaaga actatgagaa gcacaatcgg aacaaagaaa tccctcacga gatcaatgag 2220

ttcgtgcgcg agatcaagct ggggaagatt ctgaagtaca ccgagaatct gaacatgttt 2280

tacctgatcc tgaagctgct gaaccacaaa gagctgacca acctgaaggg cagcctggaa 2340

aagtaccagt ccgccaacaa agaagaaacc ttcagcgacg agctggaact gatcaacctg 2400

ctgaacctgg acaacaacag agtgaccgag gacttcgagc tggaagccaa cgagatcggc 2460

aagttcctgg acttcaacga aaacaaaatc aaggaccgga aagagctgaa aaagttcgac 2520

accaacaaga tctatttcga cggcgagaac atcatcaagc accgggcctt ctacaatatc 2580

aagaaatacg gcatgctgaa tctgctggaa aagatcgccg ataaggccaa gtataagatc 2640

agcctgaaag aactgaaaga gtacagcaac aagaagaatg agattgaaaa gaactacacc 2700

atgcagcaga acctgcaccg gaagtacgcc agacccaaga aggacgaaaa gttcaacgac 2760

gaggactaca aagagtatga gaaggccatc ggcaacatcc agaagtacac ccacctgaag 2820

aacaaggtgg aattcaatga gctgaacctg ctgcagggcc tgctgctgaa gatcctgcac 2880

cggctcgtgg gctacaccag catctgggag cgggacctga gattccggct gaagggcgag 2940

tttcccgaga accactacat cgaggaaatt ttcaatttcg acaactccaa gaatgtgaag 3000

tacaaaagcg gccagatcgt ggaaaagtat atcaacttct acaaagaact gtacaaggac 3060

aatgtggaaa agcggagcat ctactccgac aagaaagtga agaaactgaa gcaggaaaaa 3120

aaggacctgt acatccggaa ctacattgcc cacttcaact acatccccca cgccgagatt 3180

agcctgctgg aagtgctgga aaacctgcgg aagctgctgt cctacgaccg gaagctgaag 3240

aacgccatca tgaagtccat cgtggacatt ctgaaagaat acggcttcgt ggccaccttc 3300

aagatcggcg ctgacaagaa gatcgaaatc cagaccctgg aatcagagaa gatcgtgcac 3360

ctgaagaatc tgaagaaaaa gaaactgatg accgaccgga acagcgagga actgtgcgaa 3420

ctcgtgaaag tcatgttcga gtacaaggcc ctggaa 3456

<210> 32

<211> 2898

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

atcgagaaga agaagagctt cgccaagggc atgggagtga agagcaccct ggtgtccggc 60

tctaaggtgt acatgaccac atttgctgag ggaagcgacg ccaggctgga gaagatcgtg 120

gagggcgata gcatcagatc cgtgaacgag ggagaggctt tcagcgccga gatggctgac 180

aagaacgctg gctacaagat cggaaacgcc aagttttccc acccaaaggg ctacgccgtg 240

gtggctaaca acccactgta caccggacca gtgcagcagg acatgctggg actgaaggag 300

acactggaga agaggtactt cggcgagtcc gccgacggaa acgataacat ctgcatccag 360

gtcatccaca acatcctgga tatcgagaag atcctggctg agtacatcac aaacgccgct 420

tacgccgtga acaacatctc cggcctggac aaggatatca tcggcttcgg aaagttttct 480

accgtgtaca catacgacga gttcaaggat ccagagcacc accgggccgc ttttaacaac 540

aacgacaagc tgatcaacgc catcaaggct cagtacgacg agttcgataa ctttctggat 600

aaccccaggc tgggctactt cggacaggct ttcttttcta aggagggcag aaactacatc 660

atcaactacg gaaacgagtg ttacgacatc ctggccctgc tgagcggact gaggcactgg 720

gtggtgcaca acaacgagga ggagtctcgg atcagccgca cctggctgta caacctggac 780

aagaacctgg ataacgagta catctccaca ctgaactacc tgtacgacag gatcaccaac 840

gagctgacaa acagcttctc caagaactct gccgctaacg tgaactacat cgctgagacc 900

ctgggcatca acccagctga gttcgctgag cagtacttca gattttccat catgaaggag 960

cagaagaacc tgggcttcaa catcacaaag ctgagagaag tgatgctgga cagaaaggat 1020

atgtccgaga tcaggaagaa ccacaaggtg ttcgattcta tcagaaccaa ggtgtacaca 1080

atgatggact ttgtgatcta caggtactac atcgaggagg atgccaaggt ggccgctgcc 1140

aacaagagcc tgcccgacaa cgagaagtct ctgagcgaga aggatatctt cgtgatcaac 1200

ctgagaggct cctttaacga cgatcagaag gacgctctgt actacgatga ggccaacagg 1260

atctggagaa agctggagaa catcatgcac aacatcaagg agttccgggg aaacaagacc 1320

cgcgagtaca agaagaagga cgctccaagg ctgcctagga tcctgcctgc tggaagggac 1380

gtgagcgcct tcagcaagct gatgtacgcc ctgacaatgt ttctggacgg aaaggagatc 1440

aacgatctgc tgaccacact gatcaacaag ttcgacaaca tccagtcttt tctgaaagtg 1500

atgcctctga tcggcgtgaa cgctaagttc gtggaggagt acgccttctt taaggacagc 1560

gccaagatcg ctgatgagct gcggctgatc aagtcctttg ccaggatggg agagccaatc 1620

gctgacgcta ggagagctat gtacatcgat gccatccgga tcctgggaac caacctgtct 1680

tacgacgagc tgaaggctct ggccgacacc ttcagcctgg atgagaacgg caacaagctg 1740

aagaagggca agcacggaat gcgcaacttc atcatcaaca acgtgatcag caacaagcgg 1800

tttcactacc tgatcagata cggcgaccca gctcacctgc acgagatcgc taagaacgag 1860

gccgtggtga agttcgtgct gggacggatc gccgatatcc agaagaagca gggccagaac 1920

ggaaagaacc agatcgaccg ctactacgag acctgcatcg gcaaggataa gggaaagtcc 1980

gtgtctgaga aggtggacgc tctgaccaag atcatcacag gcatgaacta cgaccagttc 2040

gataagaaga gatctgtgat cgaggacacc ggaagggaga acgccgagag agagaagttt 2100

aagaagatca tcagcctgta cctgacagtg atctaccaca tcctgaagaa catcgtgaac 2160

atcaacgcta gatacgtgat cggcttccac tgcgtggagc gcgatgccca gctgtacaag 2220

gagaagggat acgacatcaa cctgaagaag ctggaggaga agggctttag ctccgtgacc 2280

aagctgtgcg ctggaatcga cgagacagcc cccgacaaga ggaaggatgt ggagaaggag 2340

atggccgaga gagctaagga gagcatcgac tccctggagt ctgctaaccc taagctgtac 2400

gccaactaca tcaagtactc cgatgagaag aaggccgagg agttcaccag gcagatcaac 2460

agagagaagg ccaagaccgc tctgaacgcc tacctgagga acacaaagtg gaacgtgatc 2520

atccgggagg acctgctgcg catcgataac aagacctgta cactgttccg gaacaaggct 2580

gtgcacctgg aggtggctcg ctacgtgcac gcctacatca acgacatcgc cgaggtgaac 2640

tcctactttc agctgtacca ctacatcatg cagaggatca tcatgaacga gagatacgag 2700

aagtctagcg gcaaggtgtc tgagtacttc gacgccgtga acgatgagaa gaagtacaac 2760

gatagactgc tgaagctgct gtgcgtgcct ttcggatact gtatcccacg gtttaagaac 2820

ctgagcatcg aggccctgtt cgaccgcaac gaggctgcca agtttgataa ggagaagaag 2880

aaggtgagcg gcaactcc 2898

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

cgaaagtgaa gatgaccaca gatccttccg 30

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

actgaatcaa caatcgagtc aattgtttgg 30

<210> 35

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

aattctaata cgactcacta tagggcgaaa gtgaagatga ccacagatcc ttccg 55

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

catgatagac tacaaaccgt agaaactagc 30

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

gagcaggaac ttcacgacaa catttatcta 30

<210> 38

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

aattctaata cgactcacta tagggcatga tagactacaa accgtagaaa ctagc 55

<210> 39

<211> 8

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

cccccccc 8

<210> 40

<211> 8

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 40

cccccccc 8

Claims (5)

1.一种基于CRISPR-Cas系统检测RBSDV病毒的试剂盒，其特征在于，包括CRISPR-AsCas12a、CRISPR-LbCas12a、CRISPR-LwCas13a、CRISPR-RfCas13d系统中的至少一种；

所述CRISPR-AsCas12a系统包括：引物对S5-F/S5-R或S10-F/S10-R；AsCas12a蛋白；ssDNA探针；As-S5-crRNA或As-S10-crRNA；

所述CRISPR-LbCas12a系统包括：引物对S5-F/S5-R或S10-F/S10-R；LbCas12a蛋白；ssDNA探针；Lb-S5-crRNA或Lb-S10-crRNA；

所述CRISPR-LwCas13a系统包括：引物对（T7）S5-F/S5-R或（T7）S10-F/S10-R；LwCas13a蛋白；ssRNA探针；Lw-S5-crRNA或Lw-S10-crRNA；

所述CRISPR-RfCas13d系统包括：引物对（T7）S5-F/S5-R或（T7）S10-F/S10-R；RfCas13d蛋白；ssRNA探针；Rf-S5-crRNA或Rf-S10-crRNA；

所述crRNA的序列如下：

As-S5-crRNA：UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGCUUUUUGCCAUUUU

AGCAA；SEQ ID NO.21；

Lb-S5-crRNA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCUUUUUGCCAUUU

UAGCAA；SEQ ID NO.22；

Lw-S5-crRNA：GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAA

CGUUAUCGGCUUGUUCGUGGUUGAGAAUUCU；SEQ ID NO.23；

Rf-S5-crRNA：CAAGUAAACCCCUACCAACUGGUCGGGGUUUGAAAC

GUUAUCGGCUUGUUCGUGGUUGAGAAUUCU；SEQ ID NO.24；

As-S10-crRNA：UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUCAGACCCUAACGAA

CAACG；SEQ ID NO.25；

Lb-S10-crRNA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCAGACCCUAACGA

ACAACG；SEQ ID NO.26；

Lw-S10-crRNA：GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAA

ACCACGUUCUAUUUGUUCAGCAUCAAGUUUGG；SEQ ID NO.27；

Rf-S10-crRNA：CAAGUAAACCCCUACCAACUGGUCGGGGUUUGAAA

CCACGUUCUAUUUGUUCAGCAUCAAGUUUGG；SEQ ID NO.28；

所述引物序列如下：

S5-F：5’-CGAAAGTGAAGATGACCACAGATCCTTCCG-3’；SEQ ID NO.33；

S5-R：5’-ACTGAATCAACAATCGAGTCAATTGTTTGG-3’；SEQ ID NO.34；

（T7）S5-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGAAAGTGAAG

ATGACCACAGATCCTTCCG-3’；SEQ ID NO.35；

S10-F：5’-CATGATAGACTACAAACCGTAGAAACTAGC-3’；SEQ ID NO.36；

S10-R：5’-GAGCAGGAACTTCACGACAACATTTATCTA-3’；SEQ ID NO.37；

（T7）S10-F：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCATGATAGACTA

CAAACCGTAGAAACTAGC-3’；SEQ ID NO.38；

所述ssDNA探针的序列如下：

Poly C：5’-CCCCCCCC-3’；SEQ ID NO.39；探针5’端标记荧光报告基团；3’端标记荧光淬灭集团；

所述ssRNA探针的序列如下：

Poly rU：5’-rUrUrUrUrU-3’；探针5’端标记荧光报告基团；3’端标记荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas系统检测RBSDV病毒的试剂盒，其特征在于，还包括侧向流试纸条探针，探针序列如下：

5’-CCCCCCCC-3’；SEQ ID NO.40；

探针5’端标记荧光报告基团；3’端标记生物素亲和基团。

3.一种基于CRISPR-Cas系统检测RBSDV病毒的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的试剂盒，包括如下步骤：

1）制备RBSDV病毒粗提取样本作为模板；

2）RT-RPA扩增：

（1）反应体系：10µM RPA-F引物2.4µL，10µM RPA-R引物2.4µL，buffer 29.5µL，模板2µL，0.5µl反转录酶，加水补齐到47.5µL，混合均匀后加入2.5µL MgOAc立即反应；

所述RPA-F引物为S5-F、（T7）S5-F、S10-F或（T7）S10-F；所述RPA-R引物为S5-R或S10-R；

（2）将RT-RPA反应体系置于42℃恒温金属浴中反应20-30min；

（3）结束后扩增产物直接用作CRISPR-Cas检测反应检测底物；

3）CRISPR-Cas旁切检测

（1）AsCas12a检测体系：2µL 10× NEB CutSmart Buffer，100nM AsCas12a蛋白，1µL40µM ssDNA探针，1µL 20ng/µL As-crRNA，1µL检测底物，用Nuclease-free水补充至20µL；

（2）LbCas12a检测体系：2µL 10× NEB CutSmart Buffer，100nM LbCas12a蛋白，1µL40µM ssDNA探针，1µL 20ng/µL Lb-crRNA，1µL检测底物，用Nuclease-free水补充至20µL；

（3）LwCas13a检测体系：2µL 10× NEB CutSmart Buffer，100nM LwCas13a蛋白，1µL40µM ssRNA探针，0.05µL T7聚合酶，0.8µL rNTP Mix，0.5µL RNA酶抑制剂，1µL 20ng/µLLw-crRNA，1µL检测底物，用Nuclease-free水补充至20µL；

（4）RfCas13d检测体系：2µL 10× NEB CutSmart Buffer，100nM RfCas13d蛋白，1µL40µM ssRNA探针，0.05µL T7聚合酶，0.8µL rNTP Mix，0.5µL RNA酶抑制剂，1µL 20ng/µLRf-crRNA，1µL检测底物，用Nuclease-free水补充至20µL；

将反应置于37℃荧光仪中，每5min采集一次荧光信号，检测时间为20-60min，取出置于手持式荧光灯下进行拍照；

4）检测结果呈现：若样品有肉眼可见荧光，为携带RBSDV病毒的阳性样品；若没有肉眼可见荧光，为未携带RBSDV病毒的阴性样品。

4.一种基于CRISPR-Cas系统检测RBSDV病毒的方法，其特征在于，利用权利要求2所述的试剂盒，包括如下步骤：

1）制备RBSDV病毒粗提取样本作为模板；

2）RT-RPA扩增：

（1）反应体系：10µM RPA-F引物2.4µL，10µM RPA-R引物2.4µL，buffer 29.5µL，模板2µL，0.5µl反转录酶，加水补齐到47.5µL，混合均匀后加入2.5µL MgOAc立即反应；

所述RPA-R引物为S5-F、（T7）S5-F、S10-F或（T7）S10-F；所述RPA-R引物为S5-R或S10-R；

（2）将RT-RPA反应体系置于42℃恒温金属浴中反应20-30min；

（3）结束后扩增产物直接用作侧向试纸条检测底物；

3）侧向试纸条检测：

2µL 10× NEB CutSmart Buffer，100nM Cas蛋白，1µL 20µM探针，1µL 20ng/µLcrRNA，1µL检测底物，用Nuclease-free水补充至20µL；

反应结束后将20µL检测液加入到80µL试纸条反应buffer中，混合均匀，插入试纸条，观察显色条带；

4）检测结果呈现：若试纸条质控带和检测带均有条带，为携带RBSDV病毒的阳性样品；若仅有质控带有条带，为未携带RBSDV病毒的阴性样品。

5.根据权利要求3或4所述的一种基于CRISPR-Cas系统检测RBSDV病毒的方法，其特征在于，步骤1）制备RBSDV病毒粗提取样本的步骤如下：

（1）取单头灰飞虱或50mg接种侵染14天后的水稻、小麦及玉米叶片，置于1.5 ml离心管中；

（2）单头灰飞虱加入20µl裂解液，其他样品加入100 µl裂解液，插入研磨棒触壁室温研磨1 min，温育4min；

（3）裂解液直接加入到RT-RPA反应体系中进行扩增反应。

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