CN109504704A - 一种增强单子叶植物抵御rna病毒侵染的方法 - Google Patents

一种增强单子叶植物抵御rna病毒侵染的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增强单子叶植物抵御RNA病毒侵染的方法，以南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)为模式病毒，首次受限了利用CRISPR/Cas13a系统有效的抑制SRBSDV在植物中的增殖，从而提高植物的抗病能力。鉴于此方法的设计仅基于病毒的基因组序列，而不需要了解病毒基因的具体功能，所以该方法可以广泛地应用于抵御序列已知的各种RNA病毒。

Description

一种增强单子叶植物抵御RNA病毒侵染的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学和基因工程领域，尤其涉及一种增强单子叶植物抵御RNA病毒侵染的方法。
背景技术
病毒病是农业生产中的重要病害，会极大的影响植物生长，对多种农作物造成危害。根据病毒的基因组构成，可分为RNA病毒和DNA病毒两种。其中植物RNA病毒广泛存在于自然界中，具有非常广泛的宿主。已知的RNA病毒中多数会通过各种途径传播，对粮食作物和经济作物带来巨大的损失。
以侵染水稻的南方水稻黑条矮缩病毒为例，它是一种由白背飞虱传播的非常严重的植物病毒病害，病毒粒体呈球状，直径70～75nm，其基因组为双链RNA，共10个片段。该病害自发现后发生面积不断扩大，为害逐年加重，是当前我国南部稻区及南亚、东南亚稻区最主要、危害最严重的水稻病毒病害之一。
传统的在植物中抵御病毒的方式主要针对于抑制病毒的复制、组装或干扰其致病相关蛋白的表达。当病毒在侵染宿主细胞后，病毒会表达复制相关的蛋白，该蛋白会与病毒基因组结合并起始病毒的复制，同时病毒也会表达外壳蛋白，将复制后的病毒基因组进行组装形成新生成的病毒粒子。因此，通过转入全长或部分外源复制蛋白或外壳蛋白，使植物生成针对这些病毒蛋白的小干扰RNA，从而抑制病毒的复制和组装。然而，高表达量、干扰宿主细胞生长、非普适性、抗性丢失等问题使得该技术具有巨大的劣势。也有报道利用RNAi技术来干扰病毒致病蛋白的表达从而达到抗病毒的目的，但是该技术也因为其同源依赖性、以及病毒具有对抗RNAi抑制子的问题而不具有普适性。
近年来随着基因编辑技术的发展，利用外源人工锌指蛋白系统(Artificial zincfinger proteinAZP)、转录激活因子样效应物核酸酶系统(Transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和成簇的规律间隔短回文重复序列系统(ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeat sequences，CRISPR)开发了多种在植物上的抗病毒技术。尤其是利用细菌中获得的CRISPR系统，靶向性的切割外源病毒的基因组DNA能够产生很高的抗病毒效率。但是，利用这些基因编辑技术的抗病毒体系，主要都是针对DNA病毒的，且目前都只有在双子叶植物中有效。针对包含多种粮食作物的单子叶植物，如水稻、玉米、小麦等，目前依然没有发开出有效的基于基因编辑技术的抗病毒体系，尤其是针对单子叶植物上危害更为严重的RNA病毒。
随着对不同细菌来源的CRISPR系统的深入研究和筛选，在Leptotrichia shahii细菌中，发现其表达的Cas13a核酸内切酶(LshCas13a)能够靶向切割RNA。如果能将该针对RNA的CRISPR系统表达于单子叶植物中，并靶向侵染植物的RNA病毒，将能够显著提高单子叶植物的抗病毒能力。
发明内容
本发明的目的是将该针对RNA的CRISPR系统表达于单子叶植物中，并靶向侵染植物的RNA病毒，将能够显著提高单子叶植物的抗病毒能力。
具体方案为：构建一种培育对RNA病毒的抵御能力提高的单子叶植物的方法，包括以下步骤：
S 11从待抵御的RNA病毒的基因组序列中选取若干靶序列，针对各靶序列，分别设计合成与所述靶序列反向互补的DNA片段(双链)，
所述靶序列为符合5’-NX-3’序列排列规则的序列，其中，N表示A、G、C、U中的任一种，25≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的核糖核苷酸；
S 12将步骤S 101中获得的若干个所述DNA片段分别构建到用于表达CRISPR/Cas13a核酸酶的载体中，得到若干个重组载体；
S 1将若干个所述重组载体分别导入受体植物，从导入所述重组载体的受体植物中获得对RNA病毒抵御能力提高的植物，所述RNA病毒包括双链RNA病毒和单链RNA病毒。
进一步包括，在S102中，所述重组载体能转录向导RNA和表达LshCas13a蛋白；所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA通过碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有由所述DNA片段转录所得的RNA片段。
一种增强单子叶植物抵御RNA病毒侵染的方法，包括如下步骤：
S 21按照包括如下步骤的方法获得目的DNA片段；
S 211从待抵御的RNA病毒的基因组序列中选取若干靶序列，针对各靶序列，分别设计合成与所述靶序列反向互补的DNA片段(双链)；
所述靶序列为符合5’-NX-3’序列排列规则的序列，其中，N表示A、G、C、U中的任一种，25≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的核糖核苷酸；
S 212将步骤S 211中获得的若干个所述DNA片段分别构建到用于表CRISPR/Cas13a核酸酶的载体中，得到若干个重组载体；
S 213将若干个所述重组载体分别导入受体植物1，从导入所述重组载体的受体植物1中获得对所述RNA病毒抵御能力提高的植物，记为目的植物；
在所述目的植物中，被导入的所述重组载体上携带的所述DNA片段记为目的DNA片段；
S 22按照步骤S 212和S 213的方法，将所述目的DNA片段导入所述用于表达CRISPR/Cas13a核酸酶的载体中，将所得重组载体导入受体植物2，从而提高所述受体植物2对所述RNA病毒的抵御能力；
所述RNA病毒包括双链RNA病毒和单链RNA病毒。
进一步包括，所述重组载体能转录向导RNA和表达LshCas13a蛋白；所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA通过碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有由所述DNA片段转录所得的RNA片段。
进一步包括，所述受体植物1和所述受体植物2为同一种受体植物，或所述受体植物1和所述受体植物2为不同种受体植物。
在上述方法中，所述“从导入所述重组载体的受体植物(或受体植物1)中获得对所述RNA病毒抵御能力提高的单子叶植物”具体是通过包括如下步骤的方法完成的：
(I)在进行如上步骤(3)的过程中，设置向所述受体植物(或受体植物1)中导入空载体的对照组；
所述空载体即为所述用于表达CRISPR/Cas13a核酸酶的载体(与所述重组载体对应的未插入所述DNA片段的空载体)。
(II)向若干导入所述重组载体的受体植物(或受体植物1)中分别接种所述RNA病毒，得到若干植物A；向导入所述空载体的受体植物中接种所述RNA病毒，得到植物B；检测所述若干植物A和所述植物B中所述RNA病毒的含量，从所述若干植物A中选出所诉RNA病毒含量显著低于(P<0.05)所述植物B中所诉RNA病毒含量的个体，记为植物A’，所述植物A’对应的导入所述重组载体的受体植物(或受体植物1)即为对所述RNA病毒抵御能力提高的植物。
其中，所述“从所述若干植物A中选出所诉RNA病毒含量显著低于(P<0.05)所述植物B中所诉RNA病毒含量的个体”进一步为：从所述若干植物A中选出所诉RNA病毒含量极显著低于(P<0.01)所述植物B中所诉RNA病毒含量的个体；更进一步为：从所述若干植物A中选出无任何病态表型的个体。
进一步包括，所述用于表达CRISPR/Cas13a核酸酶的载体为pCR12载体，所述重组载体为由所述pCR12载体的两个酶切位点BsaI之间插入所述DNA片段后得到的重组质粒。
进一步包括，所述X为28。
进一步包括，所述植物为单子叶植物。
进一步包括，所述RNA病毒为双链RNA病毒。
进一步包括，所述双链RNA病毒为南方水稻黑条矮缩病毒。
本发明所提供的方法是模拟细菌的相应免疫系统(选取来自Leptotrichiashahii细菌中的针对RNA的CRISPR系统)，在植物中表达与病毒靶位点特异识别的crRNA，引导LshCas13a蛋白特异性的清除机体内的病毒RNA。本发明以南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)为模式病毒，首次受限了利用CRISPR/Cas13a系统有效的抑制SRBSDV在植物中的增殖，从而提高植物的抗病能力。鉴于此方法的设计仅基于病毒的基因组序列，而不需要了解病毒基因的具体功能，所以该方法可以广泛地应用于抵御序列已知的各种RNA病毒。
附图说明
图1为pCR12载体图；
图2为SRBSDV病毒相对含量检测结果；
图3为转基因水稻接种SRBSDV后的表型。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式和技术方案作进一步的详述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商，均为可以通过市购获得的常规产品。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到。
pCR12载体，见图1，公众可从华南农业大学农学院植物病毒研究室获得。
水稻(日本晴栽培种)，公众可从华南农业大学农学院植物病毒研究室获得。
南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)毒源及病毒介体白背飞虱，公众可从华南农业大学农学院植物病毒研究室获得。
农杆菌菌株EHA105：优宝生物公司产品，产品编号ST1140。
实施例1、提高植物抵御RNA病毒的能力的方法的建立
本实施例选用南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)作为待抵御的RNA病毒，选用水稻作为SRBSDV攻击的单子叶植物，说明建立提高单子叶植物抵御RNA病毒的能力的方法。
SRBSDV的基因组为双链RNA，本发明针对病毒RNA基因组设计了三个特异性的crRNA，引导LshCas13a降低SRBSDV在单子叶植物体内的积累。
一、单子叶CRISPR/Cas13a系统双元载体的构建
1、依据对南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)的测序结果，在SRBSDV基因组上选取3个靶标片段(表1)。另外构建一个非病毒序列的靶标片段作为对照。
表1靶标片段设计
编号 基因组位置 序列
SA 基因组第1条链 CTATTGCGCATTGTACTGACCTTGGTAA
SB 基因组第6条链 CAAATCACGTCATCCTGATGGTCAATCC
SC 基因组第10条链 CAAGATGAGTACGAACTAACTGGACTGT
2、根据步骤1设计的各靶标片段，合成带有粘性末端(小写部分)的单链引物(表2)。经过引物退火程序形成有粘性末端的双链DNA(可编码与所述靶标片段互补结合的RNA)，正向插入到pCR12载体的两个酶切位点BsaI之间，得到重组质粒。经测序表明在pCR12载体的两个酶切位点BsaI之间正向插入表1中靶标片段的反向互补序列后得到的重组质粒为阳性，记为pCR12-crRNA。阳性重组质粒可转录出特异于相应靶标片段的向导RNA(crRNA)，并表达出LshCas13a蛋白。
表2对应于靶标片段的单链引物
二、通过转基因水稻表达pCR12-crRNA并检测对病毒的抗性
本发明首次在单子叶植物中通过表达CRISPR系统来获得对RNA病毒的抗性。
1、转基因水稻的获得
通过农杆菌介导的组织培养法获得转化了pCR12-crRNA的水稻，利用潮霉素抗性筛选获得转基因阳性植株。阳性植株收获种子后对其后代进行抗病性检测。
2、病毒接种实验
将白背飞虱饲养在实验室保存的感染了南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)的水稻植株上，获毒15天后，将白背飞虱转移至待测试的表达pCR12-crRNA的转基因植株或者对照植株上，取食2天后移除白背飞虱。
3、转基因植株抗病性评价
30天后，记录各组水稻植株的表型差异，并取样叶片，用液氮研磨至粉末，用Trizol(Invitrogen)提取RNA。选取水稻中EF1a基因作为内参基因，选取一合适片段为206bp，其上下游引物为：
EF1a-F：5’-ACATTGCCGTCAAGTTTGCTG-3’；
EF1a-R：5’-AACAGCCACCGTTTGCCTC-3’。
SRBSDV病毒扩增片段大小为144bp，其上下游引物为：
SRBSDV-F：5’-TGTTGTCGTGAAGTTCCTGCTC-3’；
SRBSDV-R：5’-GGTCGTAACCGCCATAGTGTGTC-3’。
qPCR所用试剂为Vazyme HiScript II Q RT SuperMix for qPCR。qPCR反应体系为：2×mix5μL；上下游引物各0.25μL；ddH2O 3.5μL；RNA模板1μL。
根据2-ΔΔCt法，计算各实验组烟草中SRBSDV病毒相对于对照组的相对含量：
(1)将各组SRBSDV含量归一化。病毒含量＝2(Ct(内参EF1a)-Ct(SRBSDV))
(2)实验组相对于对照组的病毒含量为病毒含量实验组/病毒含量对照组，并依据结果构建Excel表格，并进行差异统计分析。
各组水稻中SRBSDV病毒的相对含量结果如图2所示，由图可以看出，与野生型水稻和转化pCR12空载体水稻对照组相比，三个实验组中的SRBSDV病毒的相对含量均较低。经过差异统计分析，各实验组与对照组均具有极显著差异(P<0.01)。由图3所示，野生型水稻和转化pCR12空载体水稻植株呈现明显的SRBSDV病态，而表达pCR12-SA、pCR12-SB、pCR12-SC的转基因水稻均表现出极强的抵御病毒的表型。
对于所公开的实施例的上述说明，是本领域专业技术人员能够实现或使用本发明，对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明件该不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种培育对RNA病毒的抵御能力提高的单子叶植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S 11从待抵御的RNA病毒的基因组序列中选取若干靶序列，针对各靶序列，分别设计合成与所述靶序列反向互补的DNA片段，
所述靶序列为符合5’-NX-3’序列排列规则的序列，其中，N表示A、G、C、U中的任一种，25≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的核糖核苷酸；
S 12将步骤S 101中获得的若干个所述DNA片段分别构建到用于表达CRISPR/Cas13a核酸酶的载体中，得到若干个重组载体；
S 1将若干个所述重组载体分别导入受体植物，从导入所述重组载体的受体植物中获得对RNA病毒抵御能力提高的植物，所述RNA病毒包括双链RNA病毒和单链RNA病毒。
2.根据权利要求1所述的培育对RNA病毒的抵御能力提高的单子叶植物的方法，其特征在于，在S102中，所述重组载体能转录向导RNA和表达LshCas13a蛋白；所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA通过碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有由所述DNA片段转录所得的RNA片段。
3.一种增强单子叶植物抵御RNA病毒侵染的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S 21按照包括如下步骤的方法获得目的DNA片段；
S 211从待抵御的RNA病毒的基因组序列中选取若干靶序列，针对各靶序列，分别设计合成与所述靶序列反向互补的DNA片段；
所述靶序列为符合5’-NX-3’序列排列规则的序列，其中，N表示A、G、C、U中的任一种，25≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的核糖核苷酸；
S 212将步骤S 211中获得的若干个所述DNA片段分别构建到用于表CRISPR/Cas13a核酸酶的载体中，得到若干个重组载体；
S 213将若干个所述重组载体分别导入受体植物1，从导入所述重组载体的受体植物1中获得对所述RNA病毒抵御能力提高的植物，记为目的植物；
在所述目的植物中，被导入的所述重组载体上携带的所述DNA片段记为目的DNA片段；
S 22按照步骤S 212和S 213的方法，将所述目的DNA片段导入所述用于表达CRISPR/Cas13a核酸酶的载体中，将所得重组载体导入受体植物2，从而提高所述受体植物2对所述RNA病毒的抵御能力；
所述RNA病毒包括双链RNA病毒和单链RNA病毒。
4.根据权利要求3所述的增强单子叶植物抵御RNA病毒侵染的方法，其特征在于，所述重组载体能转录向导RNA和表达LshCas13a蛋白；所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA通过碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有由所述DNA片段转录所得的RNA片段。
5.根据权利要求3所述的增强单子叶植物抵御RNA病毒侵染的方法，其特征在于，所述受体植物1和所述受体植物2为同一种受体植物，或所述受体植物1和所述受体植物2为不同种受体植物。
6.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述用于表达CRISPR/Cas13a核酸酶的载体为pCR12载体，所述重组载体为由所述pCR12载体的两个酶切位点BsaI之间插入所述DNA片段后得到的重组质粒。
7.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于，所述X为28。
8.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于，所述植物为单子叶植物。
9.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于，所述RNA病毒为双链RNA病毒。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述双链RNA病毒为南方水稻黑条矮缩病毒。
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