CN110904144B - 一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法，包括以下步骤：(1)发根农杆菌活化；(2)侵染；(3)鸭茅毛状根的诱导；(4)除菌培养：(5)继代培养：可实现鸭茅毛状根的高效诱导和规模化培养，生产周期短、生产成本低。

Description

一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法。

背景技术

鸭茅(Dactylis glomerataL.)是禾本科，鸭茅属多年生草本植物。鸭茅草质柔软，牛、马、羊、兔等均喜食。幼嫩时尚可用以喂猪。叶量丰富，叶占60％，茎约占40％。鸭茅可作用放牧或制作干草，也可收割青饲或制作青贮料。鸭茅具有生长迅速、分蘖能力强、产量高、耐瘠薄等优良特性，是中国南方草地农业生产中广泛使用的草种。

随着分子生物学的发展，很多涉及到基因功能验证的实验需要通过组织培养进行遗传转化。传统的组培方式多以鸭茅的幼嫩花穗，茎节或者幼苗为外植体进行愈伤的诱导，试验耗时，成本较高。

发明内容

有鉴于此，本申请提供一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法，可实现鸭茅毛状根的高效诱导和规模化培养，生产周期短、生产成本低。

为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法，包括以下步骤：

(1)发根农杆菌活化：发根农杆菌活化，得到活化的发根农杆菌菌液；

(2)侵染：以无菌鸭茅幼苗为外植体，所述活化的发根农杆菌菌液针刺侵染所述无菌鸭茅幼苗茎尖生长点，得到侵染后的外植体；

(3)鸭茅毛状根的诱导：

吸干所述侵染后的外植体表面菌液后，接种到共培养基上共培养，得到共培养后的外植体；所述共培养基为：MS基本培养基+200umol·L^－1AS；

(4)除菌培养：所述共培养后的外植体至于除菌培养基上除菌培养，直到彻底去除发根农杆菌，得到彻底除菌后的毛状根；所述除菌培养基为：1/2MS基本培养基+Cef，Cef初始添加浓度为500mg·L^－1；

(5)继代培养：

取所述彻底除菌后的毛状根接种到继代培养基上继代培养；所述继代培养基为：1/2MS固体培养基。

优选的，所述继代培养得到继代培养后的鸭茅毛状根

所述方法还包括：鸭茅毛状根分子检测；

所述鸭茅毛状根PCR检测包括：

DNA提取：提取所述继代培养后的鸭茅毛状根DNA；

PCR体系：获得含有rolB引物的PCR体系；

PCR反应：PCR反应扩增所述继代培养后的鸭茅毛状根Ri质粒rolB基因；

PCR扩增产物检测：琼脂糖凝胶电泳检测目标条带。

优选的，所述rolB引物为：

正向引物，其序列(5'-3')为SEQ ID No：1，GCTCTTGCAGTGCTAGATTT；

正向引物，其序列(5'-3')为SEQ ID No：2，GAAGGTGCAAGCTACCTCTC。

优选的，所述PCR反应的PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸15min，4℃保温。

优选的，所述发根农杆菌为发根农杆菌A4。

优选的，所述发根农杆菌菌液菌液浓度为OD₆₀₀＝0.5～0.6。

优选的，所述发根农杆菌活化过程具体包括：

I、发根农杆菌划线接种到含50mg·L^－1rif的YEB固体培养基上，28℃培养2-3 d；

II、挑取发根农杆菌单菌落，接菌于YEB液体培养基,28℃，220r·min^－1振荡培养12-16h；

III、取1ml步骤II得到的菌液接于含50mg·L^－1rif的50mLYEB液体培养基中， 28℃，220r·min^－1振荡，分装于无菌EP管,5000r·min^－1离心5min,去上清；

IV、用含200umol·L^－1AS的MS液体培养基重悬，28℃且黑暗条件下，220r·min ^－1振荡培养30min，得到活化的发根农杆菌菌液。

优选的，所述侵染过程具体包括：以无菌鸭茅幼苗为外植体，使用无菌注射器吸取所述活化的发根农杆菌菌液，针刺侵染所述无菌鸭茅幼苗茎尖生长点，得到侵染后的外植体。

优选的，所述共培养过程具体包括：吸干所述侵染后的外植体表面菌液后，接种到共培养基上，23～27℃且黑暗条件下共培养2d，得到共培养后的外植体。

优选的，所述除菌培养过程具体包括：所述共培养后的外植体置于1/2MS基本培养基+Cef的除菌培养基上除菌培养，长出毛状根后，更换除菌培养基，逐步降低 Cef浓度，直到彻底去除所述发根农杆菌，得到彻底除菌后的毛状根，Cef初始添加浓度为500mg·L^－1。

优选的，所述更换除菌培养基频率为每周更换一次。

优选的，所述除菌培养的条件为：23～27℃，光照强度为1000lx条件下光照培养。

优选的，所述继代培养过程具体包括：取所述彻底除菌后的毛状根接种到无菌的1/2MS固体培养基下继代培养。

本申请与现有技术相比，其详细说明如下：

发根农杆菌诱导极少数单子叶植物(小麦、玉米等)和多数双子叶植物产生毛状根，但目前禾本科牧草很难诱导形成毛状根。本发明以无菌鸭茅幼苗为外植体，利用发根农杆菌A4菌株针刺侵染而诱导无菌鸭茅幼苗产生毛状根，通过人工调控优化培养条件，提高毛状根的生长和次生代谢产物的合成，保证毛状根诱导率。保障了无菌鸭茅幼苗的可持续利用。本发明鸭茅毛状根是由无菌鸭茅幼苗经过发根农杆菌感染，在感染过程中发根农杆菌将其携带的Ri质粒上的T-DNA转移到植物细胞中，并且在宿主细胞基因组中发生整合，进而形成类似于毛发一样细长的根状组织。毛状根属于激素自养型，可有效降低生产成本。且毛状根粗壮且增殖快，无向地，生产周期短、易规模化、不受外界环境干扰，而且具有生理代谢活力强、有效成分产量高、遗传稳定性好等特点。

附图说明

图1为实施例1鸭茅毛状根rolB基因的PCR检测；

图2为不同菌液浓度侵染鸭茅毛状根诱导率；

图3为发根农杆菌侵染的叶片与对照的差异；图3A对照例1为发根农杆菌侵染鸭茅叶片、根段；图3B实施例2发根农杆菌侵染无菌鸭茅幼苗；图3C对照例2 发根农杆菌侵染土培鸭茅幼苗；图3D实施例2鸭茅毛状根的诱导；图3E为实施例 2为共培养和除菌培养共20d时鸭茅毛状根情况；图3F为实施例2继代培养后的鸭茅毛状根和普通根同时存在。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

供试材料：

发根农杆菌：为发根农杆菌A4，市售发根农杆菌菌株A4添加灭菌甘油至终浓度的20％(甘油配80％浓度，高压灭菌后添加)，于-80℃冰箱保存。

植物材料：鸭茅‘安巴’由美国种质资源提供，于实验室培养获得无菌苗和土培苗。

(3)发根农杆菌培养基

YEB液体培养基：琼脂粉15g·L^－1+5g·L^－1蛋白胨+lg·L^－1酵母提取物+5g·L^－1蔗糖+0.5g·L^－1MgSO₄，pH＝7.0-7.2

YEB液体培养基：5g·L^－1蛋白胨+lg·L^－1酵母提取物+5g·L^－1蔗糖+0.5g·L^－1MgSO₄，pH＝7.0-7.2。

(4)植物培养基

共培养基:MS基本培养基+200umol·L^－1AS(39.2mg/l)

除菌培养基：1/2MS基本培养基+500mg·L^－1Cef(初始添加浓度)

继代培养基：1/2MS培养基

(5)试剂配置

抗生素Cef(Cefotaxime Sodium for Injection,头孢噻肟钠)溶液的配制：浓度500 mg·mL^－1，粉末称取后用蒸馏水溶解定容，超净工作台中使用0.22um无菌注射器过滤，分装保存在-20℃冰箱。

AS(乙酰丁香酮)溶液的配制：浓度100umoL·mL^－1，粉末称取后用少量DMSO 溶解再加蒸馏水定容，保存在-20℃冰箱[。

利福平(rif)配置:浓度20mg·L^－1，粉末称取后用蒸馏水溶解定容，超净工作台中使用0.45um无菌注射器过滤,分装保存于-20℃冰箱。

实施例1

一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法，包括以下步骤：

(1)发根农杆菌活化：

I、发根农杆菌划线接种到含50mg·L^－1rif的YEB固体培养基上，28℃培养2-3 d；

II、挑取发根农杆菌单菌落，接菌于YEB液体培养基,28℃，220r·min^－1振荡培养12-16h；

III、取1ml步骤II得到的菌液接于含50mg·L^－1rif的50mLYEB液体培养基中，28℃，220r·min^－1振荡至OD₆₀₀＝0.5，分装于无菌EP管,5000r·min^－1离心5min,去上清；

IV、用含200umol·L^－1AS的MS液体培养基重悬，28℃且黑暗条件，220r·min ^－1振荡培养30min，得到活化的发根农杆菌菌液。

(2)侵染：以无菌鸭茅幼苗(活体苗)为外植体，使用无菌注射器吸取所述活化的发根农杆菌菌液，针刺侵染所述无菌鸭茅幼苗茎尖生长点，得到侵染后的外植体；

(3)鸭茅毛状根的诱导：

吸干所述侵染后的外植体表面菌液后，接种到共培养基上23～27℃且黑暗条件下共培养2d，得到共培养后的外植体；所述共培养基为：MS基本培养基+200umol·L ^－1AS；

(4)除菌培养：所述共培养后的外植体至于1/2MS基本培养基+Cef的除菌培养基上除菌培养，长出毛状根后，更换除菌培养基，逐步降低Cef浓度，直到彻底去除所述发根农杆菌，得到彻底除菌后的毛状根，Cef初始添加浓度为500mg·L^－1；所述除菌培养的条件为：23～27℃，光照强度为1000lx条件下光照培养；

(5)继代培养：

取所述彻底除菌后的毛状根接种到继代培养基上，在23～27℃，无菌的1/2MS 固体培养基上继代培养7-14d，得到继代培养后的鸭茅毛状根；所述继代培养基为： 1/2MS培养基；

(6)鸭茅毛状根PCR分子检测

DNA提取：采用植物基因组DNA提取试剂盒(DP305，北京天根)提取分枝较多的所述继代培养后的鸭茅毛状根总DNA和未转化的根基因组DNA(阴性对照)，每管称取1g，作为PCR扩增的模板；

PCR体系：获得含有rolB引物的PCR体系；所述rolB引物为：正向引物，其序列(5'-3')为SEQ ID No：1，GCTCTTGCAGTGCTAGATTT；正向引物，其序列(5'-3') 为SEQ ID No：2，GAAGGTGCAAGCTACCTCTC；

PCR反应：PCR反应扩增鸭茅毛状根Ri质粒rolB基因；所述PCR反应的PCR 程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸15min，4℃保温，得到PCR扩增产物；

PCR扩增产物检测：采用1％琼脂糖凝胶电泳检测目标条带；

检测结果判断：若毛状根提取显示出较亮的特征带，阴性对照(未转化根)无此带，表示鸭茅毛状根诱导产生。

检测结果：见图1(鸭茅毛状根rolB基因的PCR检测)；

得到继代培养后的鸭茅毛状根能够扩增出预期rolB基因扩增产物条带，产物大小为423bp(条带B)，与发根农杆菌A4阳性对照扩增条带一致[条带(+)]。同时，检测阴性对照[条带(-)]和毛状根侧部长出的根(条带A)，无扩增条带产生。

从图1的检测结果可以证明，发根农杆菌A4菌株的毛状根基因rolB已转移并整合到鸭茅毛状根基因组中，因此无菌鸭茅幼苗(活体苗)产生的毛状根是叶片感染发根农杆菌A4后毛状根基因rolB表达的结果。对于无菌鸭茅幼苗(活体苗)而言，毛状根和普通根同时存在，两者存在形态和生长差异，毛状根粗壮且增殖快，无向地性，普通根为须根，生长于毛状根侧部，具有向地性。

实施例2

本实施例和实施例1的区别仅在于OD₆₀₀＝0.6。

实施例3

本实施例和实施例1的区别仅在于OD₆₀₀＝0.7。

实施例4

本实施例和实施例1的区别仅在于OD₆₀₀＝0.8。

对照例1

本对照例和实施例1的区别仅在于：

(2)侵染：取无菌条件培养的鸭茅植株幼嫩叶片切成0.5cm²小段作为外植体，根段剪成0.5cm并切除根尖生长点作为外植体，接种于无激素的MS培养基上预培养2d得到预培养的外植体；50mL无菌离心管中加入所述活化的发根农杆菌菌液，将预培养的外植体浸泡其中，28℃，120rpm振荡10min，得到侵染后的外植体。

对照例2

本对照例和实施例1的区别仅在于：

(2)侵染：以土培鸭茅幼苗为外植体，使用无菌注射器吸取所述活化的发根农杆菌菌液，针刺侵染所述土培鸭茅幼苗茎尖生长点，得到侵染后的外植体。

诱导能力比较：

一、实施例1～4改变菌液浓度，测定不同菌液浓度对毛状根诱导能力影响

侵染：

以无菌鸭茅幼苗为外植体，使用无菌注射器吸取所述活化的发根农杆菌菌液，OD₆₀₀＝0.5、0.6、0.7、0.8针刺侵染所述外植体，得到侵染后的外植体，1 周后发现乳白色、粗壮毛状根。

鸭茅毛状根的诱导：

鸭茅毛状根的诱导过程处理后，分析毛状根诱导率；

毛状根诱导率＝产生毛状根的外植体数/外植体总数×100％。

毛状根诱导率见图2(不同菌液浓度侵染鸭茅毛状根诱导率)，OD₆₀₀＝0.5时诱导率为50％，OD₆₀₀＝0.6时诱导率为68.75％，OD₆₀₀＝0.7时诱导率为81.25，OD₆₀₀＝0.8 时诱导率为75％。

对比不同菌液出根情况得，随菌液浓度的升高，毛状根诱导率逐渐增大，至0.8时开始减少。

继代培养：OD₆₀₀为0.5、0.6时毛状根呈乳白、粗壮且产生细长分枝，生物量不断增大，而OD₆₀₀为0.7、0.8时继代易除菌不彻底，尤其当OD₆₀₀为0.8 时毛状根易被菌落毒害至死亡。

二、实施例2、对照例1～2改变外植体和侵染方法，测定外植体、侵染方法鸭茅毛状根的诱导差异

影响结果见表1：

表1

外植体	外植体数	生根数目	诱导率％
				叶片	30	0	0
根段	30	0	0
				无菌苗	64	44	68.75
土培苗	16	0	0

备注：表中数据为2个重复的平均数。

图3为发根农杆菌侵染的叶片与对照的差异

图3A对照例1为发根农杆菌侵染鸭茅叶片、根段；图3B实施例2发根农杆菌侵染无菌鸭茅幼苗；图3C对照例2发根农杆菌侵染土培鸭茅幼苗；图3D实施例2 鸭茅毛状根的诱导；图3E为实施例2为共培养和除菌培养共20d时鸭茅毛状根情况；图3F为实施例2继代培养后的鸭茅毛状根和普通根同时存在。

用发根农杆菌A4诱导鸭茅叶片、根段、幼苗发现：

通过侵染鸭茅叶片及根段，筛选不同菌液OD值及共培养天数，都无法诱导产生毛状根，长期继代培养后叶片或根段逐渐死亡；通过针刺侵染所述无菌鸭茅幼苗茎尖生长点，能有效诱导毛状根，毛状根从伤口处长出，OD₆₀₀＝0.6，诱导率为68.75％；此外，通过注射法侵染鸭茅土培苗，用保鲜袋套住植株于培养箱内培养3周，未诱导出毛状根。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctcttgcag tgctagattt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtgcaa gctacctctc 20

Claims (9)

1.一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法，其特征在于， 包括以下步骤：

（1）发根农杆菌活化：发根农杆菌活化，得到活化的发根农杆菌菌液；所述发根农杆菌为发根农杆菌A4;

（2）侵染：以无菌鸭茅幼苗为外植体，所述活化的发根农杆菌菌液针刺侵染所述无菌鸭茅幼苗茎尖生长点，得到侵染后的外植体；

（3）鸭茅毛状根的诱导：吸干所述侵染后的外植体表面菌液后，接种到共培养基上共培养，得到共培养后的外植体；所述共培养基为 ：MS基本培养基+200 umol·L^－1AS ；

（4）除菌培养：所述共培养后的外植体至于除菌培养基上除菌培养，直到彻底去除发根农杆菌，得到彻底除菌后的毛状根；所述除菌培养基为：1/2MS基本培养基+ Cef，Cef初始添加浓度为500mg·L^－1 ；

（5）继代培养：取所述彻底除菌后的毛状根接种到继代培养基上继代培养；所述继代培养基为：1/2MS固体培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述继代培养得到继代培养后的鸭茅毛状根，所述方法还包括：鸭茅毛状根PCR分子检测；

所述鸭茅毛状根PCR分子检测包括：

DNA提取：提取所述继代培养后的鸭茅毛状根DNA；

PCR体系：获得含有rolB引物的PCR体系；

PCR反应：PCR反应扩增所述继代培养后的鸭茅毛状根Ri质粒rolB基因；

PCR扩增产物检测：琼脂糖凝胶电泳检测目标条带。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发根农杆菌菌液菌液浓度为OD₆₀₀=0.5~0.6。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发根农杆菌活化过程具体包括：

I、发根农杆菌划线接种到含50 mg•L^－1 rif的YEB 固体培养基上，28 ℃培养2-3 d；

II、挑取发根农杆菌单菌落，接菌于YEB液体培养基,28 ℃，220 r·min^－1振荡培养12-16 h;

III、取1 ml步骤II得到的菌液接于含50 mg·L^－1rif的50 mLYEB液体培养基中，28 ℃，220 r·min^－1振荡，分装于无菌EP管，5000 r·min^－1离心5 min，去上清;

IV、用含200umol·L^－1AS的MS液体培养基重悬，28 ℃且黑暗条件下，220 r·min^－1振荡培养30 min，得到活化的发根农杆菌菌液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培养过程具体包括：吸干所述侵染后的外植体表面菌液后，接种到共培养基上，23~27℃且黑暗条件下共培养2 d，得到共培养后的外植体。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述除菌培养过程具体包括：所述共培养后的外植体置于1/2MS基本培养基+Cef的除菌培养基上除菌培养，长出毛状根后，更换除菌培养基，逐步降低Cef浓度，直到彻底去除所述发根农杆菌，得到彻底除菌后的毛状根，Cef初始添加浓度为500mg·L^－1 。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述更换除菌培养基频率为每周更换一次。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述除菌培养的条件为：23~27℃，光照强度为1000lx条件下光照培养。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述继代培养过程具体包括：取所述彻底除菌后的毛状根接种到无菌的1/2MS固体培养基上继续培养7-14天。

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