CN106047924A - 苦荞麦毛状根的诱导和快速扩繁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了苦荞麦毛状根的诱导和快速扩繁方法，包括：(1)将无菌的苦荞麦外植体进行预培养；(2)用发根农杆菌侵染液侵染预培养后的苦荞麦外植体；(3)侵染后的外植体进行共培养；(4)共培养后的外植体移至诱导培养基中进行诱导培养；(5)将诱导产生的苦荞麦毛状根进行继代培养和扩增培养。本发明对显著影响苦荞麦毛状根诱导效率的外植体预培养时间、菌体侵染液浓度、侵染时间、共培养时间以及发根农杆菌的类型等关键参数进行了优化，显著提高了苦荞麦毛状根的诱导效果，实现了苦荞麦毛状根快速、高效的诱导。本发明方法适用于多种苦荞品种毛状根的诱导，具有取材方便、适用性强、操作简便、诱导速度快、遗传稳定及节约成本等优点。

Description

苦荞麦毛状根的诱导和快速扩繁方法
技术领域
本发明涉及一种苦荞麦毛状根的诱导和快速繁殖方法，尤其涉及一种利用发根农杆菌诱导苦荞麦产生毛状根并采用组织培养进行快速扩繁的方法，属于苦荞麦毛状根的诱导和快速繁殖领域。
背景技术
苦荞麦(F.tataricum Gaertn)属蓼科(Polygonaceae)，荞麦属(Fagopyrum)，为一年生双子叶草本植物，是一种药食同源的植物。苦荞发源于中国，其具有益气力、续精神、利耳目、降气宽肠健胃等极高的营养保健功能。苦荞富含多种维生素、氨基酸、蛋白质和可溶性膳食纤维，同时含有多种矿物质和微量元素，特别是其富含黄酮类物质，使其具有出色的“降血糖、降血压、降血脂”的作用，被誉为“三降食品”。随着对苦荞营养价值和药用价值研究的不断深入，其越来越受到人们的青睐。苦荞是许多绿色食品和重要的功能性食品的生产原料。苦荞种子被磨成面粉后常被人们制成各种面食，种子经烘烤后制成老少皆宜的苦荞茶，其嫩芽还可以制成芽菜，作为一种绿色蔬菜供人们食用。
植物毛状根(hairy roots)是由于发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染植物后，通过农杆菌和植物细胞之间的附着，发根农杆菌Ri质粒中的Vir基因激活并表达，质粒中的T-DNA片段被转移、插入并稳定地在植物细胞基因组中表达而诱导产生的。相较于其他组织器官，毛状根具有生长速度快、分枝多、弱向地性、激素自养、生理生化遗传特征稳定、不受病虫害、地理和季节等环境因素影响等特点，最重要的是毛状根具有稳定的次生代谢物质合成能力，并且植物次生代谢产物可从毛状根中直接提取，并快速、高效的回收与利用。因而，毛状根常被用于次生代谢物的生产、作物品种改良乃至环境污染修复等诸多方面。通常，亲本植株能合成的次生代谢物均可利用毛状根来生产，且次生代谢产物的产量往往高于植物自身所能合成的量。因而，毛状根的诱导与组织培养技术是一条利用生物技术生产次生代谢产物的有效途径。通过诱导毛状根来生产次生代谢物具有突出的优势，为植物次生代谢产物的工业化、规模化生产提供了基础，其成为继组织培养、细胞培养之后当代生物技术领域重要的研究和开发热点。
利用传统农业方法获得植物次级代谢产物，不仅生产周期长产量不稳定，而且还要受到生产环境、病虫害等多种因素的影响。同时，传统的植物细胞培养方法也存在诸如细胞生长缓慢，需添加激素维持等弊端，而且其次生代谢物的产量有限，生产能力也不稳定。但是，毛状根诱导及组织培养技术却具有生长迅速、遗传稳定以及次生代谢产物合成旺盛的优点，可以快速大量的提取植物体中有效化学成分。将苦荞麦突出的营养保健价值和毛状根固有特点相结合，利用苦荞麦毛状根诱导结合植物组织培养技术，可以为苦荞麦次生代谢物的高效工业化生产提供一条新的方法，具有极高的应用前景。但是，中国有关苦荞麦毛状根的诱导及组织培养研究还比较零散，并未见相关专利的报道，这就为苦荞麦毛状根诱导技术的发展产生了一定的局限性。
因此，提供一种快速、高效和简便的苦荞麦毛状根的快速诱导技术，不但可以缓解日益增长的市场需求，而且有利于解决日益严重的生态环保问题，也将会大大促进植物天然代谢产物生产的现代化发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种苦荞麦毛状根的快速诱导技术，通过利用该技术可以实现苦荞麦毛状根的快速、高效诱导，进而减少组培成本，为苦荞天然次生代谢产物的工业化、规模化生产提供技术基础。
为达到以上目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明公开了苦荞麦毛状根的诱导与快速扩繁方法，包括：(1)将无菌的苦荞麦外植体在光照培养箱中进行预培养；(2)用发根农杆菌侵染液侵染预培养后的苦荞麦外植体；(3)将侵染后的外植体在光照培养箱中进行共培养；(4)将共培养后的外植体转移至诱导培养基中进行诱导培养；(5)诱导产生的苦荞麦毛状根进行继代培养和扩增培养。
其中，步骤(1)中所述无菌的苦荞麦外植体优选为无菌苦荞麦组培苗的下胚轴或子叶；步骤(1)中所述的预培养是将无菌的苦荞麦外植体置于MS固体培养基上在光照培养箱中进行预培养。
本发明通过试验发现，预培养2d的外植体被农杆菌侵染后毛状根的诱导率较高，三组试验的平均诱导率可以达到41.73％；因此，本发明对预培养的时间优选为2d；另外，在预培养过程中所采用的光照以及温度条件优选为：光照16h，温度25℃；黑暗8h，温度20℃。
本发明用预培养2d后的苦荞麦外植体进行下一步的发根农杆菌侵染试验，即，使用OD值为0.2-1.5的发根农杆菌侵染液侵染苦荞外植体。实验结果表明，当发根农杆菌侵染液OD值为0.6-0.8时，毛状根的诱导率可以达到56.7％；本发明使用OD为0.8的农杆菌侵染液对苦荞进行不同时间(5-15min)的侵染，实验结果发现，侵染时间为10min时的毛状根诱导率较好，可以达到58.4％。
本发明通过实验进一步发现，步骤(3)中的共培养时间对于毛状根诱导率也有较为显著的影响。本发明采用不同的共培养时间(0-3d)发现，共培养2d的苦荞毛状根诱导率最高，达到59.98％，因此，步骤(3)中的共培养时间优选为2d；此外，步骤(3)中所述的共培养是将发根农杆菌侵染后的外植体置于MS固体培养基上在25℃黑暗的条件下进行共培养。
在本发明中，所述的发根农杆菌侵染液可参照以下方法进行制备：
将发根农杆菌在YEB固体培养基上划线培养，将划线平板置于28℃恒温培养箱中活化，挑取单菌落；将单菌落置于放有500μl YEB液体培养基的1.5mL EP管中，置于摇床内进行扩大培养，培养条件为28℃，200r/min，过夜培养；将菌液接种于50mg/L的YEB液体培养基中置于摇床内进行培养，培养条件为28℃，200r/min，培养12h；待农杆菌生长至对数期，OD为0.8-1.2之间后，再将50mL的发根农杆菌菌液倒入离心管中，5000r/min离心15min，收集菌体，之后用MS液体培养基重悬菌体，在分光光度计下调节侵染液的OD值。
本发明选取了三个不同的苦荞品种，在得到无菌苗后，分别使用三种不同的发根农杆菌菌株A4、K599和15834分别侵染三个苦荞品种的下胚轴。实验结果发现，发根农杆菌A4对于不同品种的苦荞麦毛状根的诱导效果均为最好，因而在苦荞毛状根的诱导过程中，使用A4发根农杆菌对苦荞外植体进行侵染，可以达到最佳的诱导效果。
步骤(4)中所述的诱导培养基为含有300mg/L Cef的MS培养基。
步骤(5)中所述的继代培养包括：每2周将外植体转移到新鲜的含有抗生素的MS培养基中在光照培养箱中进行继代培养；期间光照培养箱的培养条件为25℃光照16h，暗培养8h，温度20℃；待毛状根从外植体的伤口处长出，之后从外植体上切下毛状根，并转移到单个培养基中进行继代培养，以确保毛状根可以在更充足的空间中生长；已经诱导出的毛状根每4-6周继代一次。反复转移到新鲜培养基后，获得增长迅速且无菌的的毛状根；
步骤(5)中所述的扩增培养包括：将毛状根转移至含有无激素MS液体培养基的烧瓶中进行扩增培养，烧瓶置于28℃的摇床上暗培养，转速120r/min。
本发明中，所述MS液体培养基组成为：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖，pH为5.8-6.2。
所述MS固体培养基组成为：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5.8-6.2。
所述YEB液体培养基组成为：胰蛋白胨5.0g/L，酵母提取物1.0g/L，蔗糖5.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L；
所述YEB固体培养基组成为：胰蛋白胨5.0g/L，酵母提取物1.0g/L，蔗糖5.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，琼脂粉15.0g/L；
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明通过苦荞麦毛状根诱导外植体的制备及预培养、发根农杆菌侵染外植体诱导苦荞麦毛状根、苦荞麦毛状根的继代培养等技术环节，实现了对苦荞麦毛状根的高效诱导、快速繁殖，有效提高了苦荞麦毛状根的诱导效率。本发明方法取材方便、操作简便、节约成本等优点，并且有利于苦荞天然次生代谢产物的提取利用，诱导出的苦荞麦毛状根生长分化快速，增殖系数高，遗传稳定，培养时间短，为苦荞麦后期转基因研究提供了技术基础，对苦荞麦毛状根的大量诱导培养及次生产物的生物转化都具有积极作用。
附图说明
图1为预培养时间对苦荞麦毛状根诱导的影响；
图2为农杆菌侵染液OD值对苦荞麦毛状根诱导的影响；
图3为侵染时间对苦荞麦毛状根诱导的影响；
图4为共培养时间对苦荞麦毛状根诱导的影响；
图5为发根农杆菌菌株及苦荞品种对苦荞麦毛状根诱导的影响；
图6为苦荞麦毛状根系的RolAB基因的PCR检测：M为DL2000DNA Mark；泳道1-5为诱导出的苦荞麦毛状根中的RolAB基因；+为阳性对照；W为非苦荞麦毛状根对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、菌液的购买和培养基的配置
发根农杆菌A4、K599购自Biovector质粒载体菌种保藏中心；
发根农杆菌ATCC15834购自上海瑞楚生物科技有限公司；
MS液体培养基组成为：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖，pH为5.8-6.2；
MS固体培养基组成为：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5.8-6.2；
YEB液体培养基组成为：胰蛋白胨5.0g/L，酵母提取物1.0g/L，蔗糖5.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L；
YEB固体培养基组成为：胰蛋白胨5.0g/L，酵母提取物1.0g/L，蔗糖5.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，琼脂粉15.0g/L。
实验例1苦荞麦毛状根最优诱导体系的筛选和优化
1、实验方法
1.1诱导条件的优化
(1)苦荞麦组织培养无菌苗的获得：选择颗粒饱满的苦荞种子，在100mg/L的赤霉素溶液中浸泡2h，剥去种皮，之后用75％的乙醇浸泡60s，再用10％的次氯酸钠(其中含有0.1％Tween 20)震荡处理8min，接着使用无菌水冲洗3次，每次5min。最后，将灭菌后的种子均匀铺于滤纸上，吸干其表面残留水分后均匀播撒至MS培养基上。之后，将处理好的种子放于光照培养箱中，温度为白天25℃光照16h，夜间20℃持续8h。
(2)苦荞麦毛状根诱导外植体的制备及预培养：取12-15日龄的苦荞麦无菌苗，在超净工作台内剪取苦荞组培苗的下胚轴(下胚轴切成1cm的段)与子叶作为外殖体供之后的农杆菌侵染使用。随后，将外植体置于MS培养基中在光照培养箱中进行预培养，培养条件为光照16h温度25℃，黑暗8h温度20℃。
(3)发根农杆菌侵染液的配置：将发根农杆菌A4在YEB固体培养基上划线培养，之后将划线平板置于28℃恒温培养箱中活化，随后挑取单菌落；再将单菌落置于放有500μlYEB培养液的1.5mL EP管中，置于摇床内进行扩大培养，培养条件为28℃，200r/min，过夜培养。然后，将A4菌液接种于50mg/L的YEB液体培养基中置于摇床内进行培养，培养条件为28℃，200r/min，培养12h。待农杆菌生长至对数期，OD为0.8-1.2之间后，再将50mL的发根农杆菌A4菌液倒入离心管中，5000r/min离心15min，收集菌体，之后用MS液体培养基重悬菌体，在分光光度计下调节侵染液的OD值。
(4)发根农杆菌侵染外植体诱导苦荞麦毛状根：将经过预培养的苦荞麦外植体置于发根农杆菌A4侵染液中进行侵染，之后将侵染后的外植体置于滤纸上，吸干外植体上残留的菌液。再将外植体水平置于MS固体培养基上，放于光照培养箱中，在25℃黑暗的条件下共培养2d。共培养结束后，将外植体转移至含有300mg/L Cef的MS培养基中，随后即有经发根农杆菌诱导的毛状根的产生。
(5)苦荞麦毛状根的继代培养：每2周将外植体转移到新鲜的含有抗生素的MS培养基中进行继代培养。15-20d后，外植体的伤口部位便可观察到毛状根的出现。期间光照培养箱的培养条件为25℃光照16h，暗培养8h，温度20℃；待毛状根从外植体的伤口处长出，之后从外植体上切下毛状根，并转移到单个培养基中，以确保毛状根可以在更充足的空间中生长。已经诱导出的毛状根每4-6周继代一次。反复转移到新鲜培养基后，获得增长迅速且无菌的的毛状根；最后，将毛状根转移至100mL含有无激素MS液体培养基的烧瓶中进行扩增培养，烧瓶置于28℃的摇床上暗培养，转速120r/min。
为得到快速、高效的苦荞麦毛状根诱导体系。我们对包括预培养时间在内的多个发根农杆菌诱导植物毛状根的关键因素进行研究，包括外植体预培养时间(0d、1d、2d、3d)、发根农杆菌侵染液OD值(0.2、0.6、0.8、1.0、1.5)、侵染时间(5min、10min、15min)、共培养时间(0d、1d、2d、3d)，优化试验统一采用单因素变量试验的方法。在预培养时间的探索中，预培养时间为变量，其他因素选取最小值，即侵染OD选0.2、侵染5min、共培养0d。分别设置农杆菌侵染后0d，1d，2d，3d四个实验组，每组试验侵染20个外植体，每个试验重复2次。
1.2不同菌株对不同苦荞品种的毛状根诱导的影响
选取三个苦荞品种(园子荞、川荞1号、九江苦荞)，获得无菌苗外植体后，用三种不同的发根农杆菌菌株K599、A4、15834侵染下胚轴。每个苦荞品种选取20个下胚轴叶供单一菌株侵染，共侵染三个菌种。对照组中用无菌水代替菌液侵染。记录每次的出根时间和数量，每组试验重复2次。
2、实验结果
2.1诱导条件的优化
通过图1可以看出，预培养的时间对于毛状根的诱导具有显著性的影响，当预培养2d的外植体被农杆菌侵染后毛状根的诱导率最高，三组试验的平均诱导率可以达到41.76％。
用预培养2d后的苦荞麦外植体进行下一组的试验，利用不同浓度的侵染液侵染苦荞外植体，结果表明当侵染液OD值为0.6-0.8时，毛状根的诱导率可以达到56.7％(图2).
进而使用OD为0.8的农杆菌侵染液对苦荞进行不同时间的侵染，从图3中可以看出，不同侵染时间对毛状根诱导具有显著性的差异，当侵染时间为10min时的毛状根诱导率较好，可以达到58.4％，明显高于其他的浸染时间；
最终，经过不同时间的共培养，苦荞麦毛状根的诱导率也存在一定的差异，共培养2d的苦荞麦毛状根诱导率最高，达到59.98％(图4)。
综上所述，苦荞麦毛状根诱导的最佳诱导条件应该是：先对外植体预处理2d，之后将处于对数生长期的发根农杆菌侵染液浓度调至OD值为0.6-0.8，侵染10min后再经过2d的共培养，这样可以显著提高苦荞麦毛状根的诱导效果，得到较高的毛状根诱导率。
2.2不同菌株对不同苦荞品种的毛状根诱导的影响
选取了三个不同的苦荞品种，在得到无菌苗后，分别使用三种不同的发根农杆菌菌株A4、K599和15834侵染苦荞下胚轴。经试验发现，发根农杆菌A4侵染的三个苦荞品种下胚轴伤口处会发现一定程度的愈伤化。2周后，园子荞开始首先诱导出根。之后第二天，川荞1号也有毛状根诱导出现，但数量少于园子荞。共培养结束将近20天后，九江苦荞开始诱导出毛状根，与此同时，园子荞和川荞1号的毛状根数量陆续增加。通过试验可以看出，发根农杆菌A4对园子荞毛状根的诱导能力最强。需要注意的是，对照组也有根的产生，所不同的是，其根生长具有向地性，生长速度缓慢且4周后会逐渐停止生长最终死亡，具体试验结果详见图5及表1。
表1苦荞基因型对发根农杆菌A4诱导毛状根能力的影响
发根农杆菌15834侵染的苦荞麦外植体同样有毛状根长出，其诱导时间要长于A4菌株。首先长出毛状根的仍然是园子荞，在发根农杆菌15834诱导的第22天川荞1号和九江苦荞也出现了第一个毛状根。但是，这两个品种的毛状根诱导速度低于园子荞，九江苦荞在第29天才有第二个外植体出现毛状根。具体实验结果详见图5及表2。
表2苦荞基因型对发根农杆菌15834诱导毛状根能力的影响
最后，发根农杆菌K599菌株在诱导16天后，园子荞在外植体伤口处发现有毛状根的长出。诱导后20天川荞1号、九江苦荞陆续有毛状根长出，九江苦荞发根速度仍然较慢，在第27天才有第二个外植体出现毛状根。最后发现，园子荞毛状根数量可以达到17个，是本组试验中毛状根的总数最多的。具体实验结果详见图5及表3。
表3苦荞基因型对发根农杆菌K599诱导毛状根能力的影响
实验结果发现，发根农杆菌A4对于苦荞麦毛状根的诱导效果较好，因而在苦荞麦毛状根的诱导过程中，使用A4发根农杆菌对苦荞外植体进行侵染，可以达到较好的诱导效果。
综上所述，本苦荞麦毛状根的快速诱导与组织培养技术的实用性较广，筛选的试验方法能够显著提高苦荞麦毛状根的诱导效果，可以适用于多个苦荞品种毛状根的诱导，实现对苦荞麦毛状根的快速高效诱导。
实验例2本发明所诱导和扩繁的苦荞麦毛状根的分子检测
1、实验方法
当发根农杆菌感染植物形成毛状根时，rol基因连同在T-DNA的其它基因，一同转移到植物基因组中，最终诱导产生毛状根。为确认诱导出的根是否为毛状根，除了要进行形态学上的观察和区分外，还需要对毛状根进行分子水平的检测，确定诱导出的毛状根中插入了rol基因；待苦荞麦毛状根生长到一定程度后，提取其基因组DNA，对毛状根中含有的发根农杆菌Ri质粒T-DNA区的rol基因进行PCR检测，引物设计如下：
RolAB-F:ATGGAATTAGCCGGACTAAACG；
RolAB-R：ATGGATCCCAAATTGCTATTCC；
2、实验结果
苦荞麦毛状根系的RolAB基因的PCR检测结果如图6所示，从结果中可以看出：诱导出的苦荞麦毛状根中存在的RolAB基因，即发根农杆菌的rol基因已整合在苦荞麦的基因组中，说明诱导出来的根是毛状根。

Claims (10)

1.苦荞麦毛状根的诱导与快速扩繁方法，其特征在于，包括：(1)将无菌的苦荞麦外植体在光照培养箱中进行预培养；(2)用发根农杆菌侵染液侵染预培养后的苦荞麦外植体；(3)将侵染后的外植体在光照培养箱中进行共培养；(4)将共培养后的外植体转移至诱导培养基中进行诱导培养；(5)诱导产生的苦荞麦毛状根进行继代培养和扩增培养。
2.按照权利要求1所述的诱导与快速扩繁方法，其特征在于：步骤(1)中所述无菌的苦荞麦外植体为无菌苦荞麦组培苗的下胚轴或子叶；所述的预培养是将无菌的苦荞麦外植体置于MS固体培养基上在光照培养箱中进行预培养。
3.按照权利要求1或2所述的诱导与快速扩繁方法，其特征在于：所述预培养的时间为2d；在预培养过程中所采用的光照以及温度条件为：光照16h，温度25℃；黑暗8h，温度20℃。
4.按照权利要求1所述的诱导与快速扩繁方法，其特征在于：用OD值为0.2-1.5的发根农杆菌侵染液侵染苦荞外植体；优选的，用OD值为0.6-0.8的发根农杆菌侵染液侵染苦荞外植体；最优选的，用OD值为0.8的发根农杆菌侵染液侵染苦荞外植体。
5.按照权利要求4所述的诱导与快速扩繁方法，其特征在于：用OD为0.8的农杆菌侵染液侵染苦荞外植体5-15min；优选的，用OD为0.8的农杆菌侵染液侵染苦荞外植体10min。
6.按照权利要求1所述的诱导与快速扩繁方法，其特征在于：步骤(3)中的共培养为0-3d，优选为2d；所述的共培养是将发根农杆菌侵染后的外植体置于MS固体培养基上在25℃黑暗的条件下进行共培养。
7.按照权利要求1、4或6所述的诱导与快速扩繁方法，其特征在于：所述的发根农杆菌菌株为A4、K599或15834。
8.按照权利要求1所述的诱导与快速扩繁方法，其特征在于：步骤(4)中所述的诱导培养基为含有300mg/L Cef的MS培养基。
9.按照权利要求1所述的诱导与快速扩繁方法，其特征在于：步骤(5)中所述的继代培养包括：每2周将外植体转移到新鲜的含有抗生素的MS培养基中在光照培养箱中进行继代培养；期间光照培养箱的培养条件为25℃光照16h，暗培养8h，温度20℃；待毛状根从外植体的伤口处长出，从外植体上切下毛状根，转移到单个培养基中进行继代培养；已经诱导出的毛状根每4-6周继代一次。
10.按照权利要求1所述的诱导与快速扩繁方法，其特征在于：步骤(5)中所述的扩增培养包括：将毛状根转移至含有无激素MS液体培养基的烧瓶中，将烧瓶置于28℃的摇床上进行暗培养，转速120r/min。
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