CN110172474B - 紫参毛状根的诱导与快速扩繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了紫参毛状根的诱导和快速繁殖方法，属于生物培养技术，该方法包括以下步骤：(1)用发根农杆菌侵染液侵染紫参外植体；(2)侵染后的外植体进行共培养；(3)共培养后的外植体移至诱导培养基中进行诱导培养；(4)将诱导产生的紫参毛状根进行继代除菌培养和扩增培养。本发明对显著影响紫参毛状根诱导效率的发根农杆菌类型、外植体类型以及外植体预培养时间、侵染时间、共培养时间等关键参数进行了优化，显著提高了紫参毛状根的诱导效果，实现了紫参毛状根快速高效的诱导，扩大了获取环肽的来源，具有取材方便、操作简便、诱导速度快、遗传稳定等优点。

Description

紫参毛状根的诱导与快速扩繁方法

技术领域

本发明属于生物培养技术，特别是涉及一种紫参毛状根的诱导与快速繁殖方法。

背景技术

紫参Rubia yunnanensis(Franch.)Diels，又名滇茜草，为茜草科(Rubiaceae)茜草属(Rubia)药用植物，为我国特有，分布于四川西南部(木里)和云南各地，生于海拔1700-2500米的灌丛、草坡或路边。其根及根茎肉质，条状，为云南特产药材小红参，民间常用抗肿瘤药物。传统中医认为，小红参味甘，性温，活血舒筋，祛瘀生新，调养气血；现代药理研究表明小红参具有抗肿瘤、升高白细胞及免疫调节、抗炎抗风湿、抗心肌缺血、抗氧化等活性，具有重要的药用价值和经济价值。

小红参的化学成分主要包括蒽醌类、乔木烷型三萜类以及茜草科类型环肽类等，特别是茜草科类型环肽(Rubiaceae-type cyclopeptides，RAs)，其为茜草科植物所特有，普遍存在茜草属植物中，是一类双环均环六肽化合物，通常是由一个D-α-丙氨酸、一个N-甲基-L-α-丙氨酸、三个N-甲基-L-α-酪氨酸和一个其它类型L-α-氨基酸以肽链形成环六肽，六个氨基酸缩合成十八元环，其中两个相邻的酪氨酸之间的苯环经氧桥连接形成一个具有较大张力的十四元环。RAs因其新颖独特的双环结构和显著的体内外抗肿瘤活性而备受关注，具有显著的抗肿瘤细胞活性，活性与紫杉醇相当，是一类极具潜力的天然抗肿瘤药物候选分子。RAs主要从茜草属植物中获取，特别是紫参，但所在课题组前期在全国范围内开展广泛的茜草属植物资源调查工作时发现茜草属资源和环境资源遭到破坏，导致RAs资源紧张。利用传统农业方法获得植物次级代谢产物，不仅生产周期长产量不稳定，而且还要受到生产环境、病虫害等多种因素的影响。利用生物技术获得RAs是一个潜在有效的解决方法。

植物毛状根(hairy roots)是由于发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染植物后，发根农杆菌Ri质粒中的Vir基因激活并表达，协助质粒中的T-DNA片段转移、插入并稳定地在植物细胞基因组中表达而诱导产生的。相较于传统的组织培养，植物毛状根具有培养时生长迅速、分枝多、弱向地性、激素自养、遗传稳定、不受病虫害、地理和季节等环境因素影响等特点，拥有原植物的特征次级代谢途径、能合成与原植物相同或相似的次生代谢产物，并且植物次生代谢产物可从毛状根中快速大量地提取。因此，毛状根的诱导及组织培养技术是一条利用生物技术生产次生代谢产物的有效途径，为植物次生代谢产物的工业化、规模化生产提供了基础，其成为继组织培养、细胞培养之后当代生物技术领域重要的研究和开发热点。

由于紫参根茎中RAs突出的药用价值，加之紫参根茎中的RAs含量在茜草属植物中较高，利用紫参毛状根诱导结合组织培养技术，可以为RAs的高效工业化生产提供一条新的途径，具有极高的应用前景。但是，有关紫参毛状根的诱导扩繁研究几乎空白，并未见相关专利的报道，为紫参毛状根诱导技术的发展产生了一定的局限性。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术存在的缺陷，本申请提供了一种紫参毛状根诱导与快速扩繁方法。

技术方案：本发明所述的紫参毛状根的诱导与快速扩繁方法，包括以下步骤：

(1)用发根农杆菌侵染紫参外植体；

(2)将步骤(1)侵染后的紫参外植体在黑暗条件下进行共培养；

(3)将步骤(2)共培养后的紫参外植体转移至诱导培养基中诱导培养；

(4)将步骤(3)诱导产生的紫参毛状根进行除菌继代培养和扩增培养。

步骤(1)中，所述紫参外植体为无菌紫参组培苗的幼茎或带叶的幼茎。优选带叶的幼茎。其中无菌紫参组培苗通过紫参当年生嫩芽的节接入含有0.5～1.5mg/L TDZ的MS固体培养基诱导而来。

步骤(1)中，所述发根农杆菌选自农杆菌菌株A4、LBA9402、ACCC10060、ATCC15834。优选A4。

步骤(1)中，所述紫参外植体可以先进行预培养，所述预培养是组培苗的幼茎或带叶的幼茎置于MS固体培养基中，在22～25℃光照16h，然后18～22℃黑暗8h培养0～2d。优选的预培养时间是0d。

步骤(1)中，所述侵染是指采用发根农杆菌菌液浸泡紫参外植体10～40min。优选的侵染时间为20-30min，最优选的条件是用OD值为0.8的A4侵染液侵染紫参外植体30min。

步骤(2)中，所述共培养是将发根农杆菌侵染后的紫参外植体置于MS固体培养基上，在22～25℃条件下共培养0～4d，优选为3d。

步骤(3)中，所述诱导培养基为含有200～300mg/L头孢噻肟钠(Cef)的MS培养基，诱导培养条件为黑暗环境，22～25℃，诱导时间为20d以上。

步骤(4)中，所述除菌继代培养为：每2周将紫参外植体转移到新鲜的含有抗生素Cef的MS固体培养基中继代培养，直至长出毛状根；继代培养条件为：黑暗条件，温度22～25℃；毛状根从紫参外植体的伤口处长出1-3cm后，切下毛状根，转移至含有抗生素Cef的MS固体培养基中于22～25℃黑暗条件下进行除菌继代培养，抗生素Cef的浓度逐渐降低，依次为：200mg/L，100mg/L，50mg/L，0mg/L，直至除菌完全；已诱导出的毛状根每4-6周继代一次。

步骤(4)中，所述扩增培养为：将紫参毛状根转移至含有无激素MS液体培养基中，置于22～25℃的摇床上进行暗培养，转速110～120r/min。

本发明在得到紫参无菌组培苗后，分别使用不同的发根农杆菌菌株A4、LBA9402、ACCC10060及ATCC15834侵染组培苗幼茎以及带叶的幼茎，实验结果发现，发根农杆菌A4直接侵染紫参无菌组培苗带叶幼茎的毛状根诱导率最高，可以达到50％；因此本发明中优选的农杆菌和外植体为A4和带叶幼茎。

本发明用发根农杆菌A4及紫参组培苗的带叶幼茎外植体进行毛状根诱导实验，研究发现未经预培养的外植体被A4菌液侵染后的诱导率较高，黑暗共培养条件下平均诱导率可达63.33％；因此本发明外植体优选的预培养时间为0d。

本发明用未经预培养的紫参外植体进行下一步的发根农杆菌侵染实验，即使用OD值为0.8的A4侵染液侵染紫参外植体10～40min。实验结果发现，黑暗共培养条件下侵染时间为30min的毛状根诱导率较好，为64.44％。

本发明通过实验进一步发现，步骤(2)中的共培养时间对毛状根诱导率也有较为显著的影响。本发明采用不同的共培养时间(0～4d)发现，共培养3d的紫参毛状根诱导率最高，特别是黑暗共培养条件下的诱导率达到68.89％；因此，步骤(2)中的最佳共培养时间为3d。

本发明考察了在黑暗和光照条件下共培养对毛状根诱导率的影响，研究结果表明，在黑暗条件下共培养有利于毛状根诱导率的提高；所以发根农杆菌侵染后的外植体置于MS固体培养基上在22～25℃黑暗条件下进行共培养。

在本发明中，所述的发根农杆菌侵染液可参照以下方法进行制备：

将于-80℃冰箱保存的发根农杆菌A4在YEB固体培养基上划线培养，将划线平板置于28℃恒温培养箱中倒置培养以活化。取接菌针挑取单菌落，将单菌落置于放有10mL含50mg/L利福平(Rif)的YEB液体培养基的离心管中，置于摇床内，28℃，160r/min，过夜培养，待菌液摇至OD₆₀₀为0.8左右时，作为以后摇菌制备菌液的母液。取500μL农杆菌母液接种于含50mg/L Rif的50mLYEB液体培养基中置于摇床内进行培养，培养条件为28℃，160r/min，培养过夜。待农杆菌菌液生长至对数期，即OD值为0.8左右时，取出菌液，倒入50mL离心管中，放置离心机中4000r/min，4℃离心15min。离心后取出离心管，倒去上清液，然后加入含有50mg/L乙酰丁香酮(AS)的MS重悬液混匀备用。

步骤(3)中所述的诱导培养基为含有200mg/L Cef的MS培养基，诱导培养条件为黑暗环境，25℃。

步骤(4)中所述的除菌继代培养包括：每2周将外植体转移到新鲜的含有抗生素Cef的MS固体培养基中在光照培养箱中进行继代培养，直至长出毛状根；期间光照培养箱的条件为黑暗条件，温度25℃；待毛状根从外植体的伤口处长出3cm左右，从外植体上切下毛状根，转移至含有抗生素Cef的MS固体培养基中于25℃黑暗条件下进行除菌继代培养，以确保毛状根可以在更充足的空间中生长，抗生素Cef的浓度逐渐降低，依次为：200mg/L，100mg/L，50mg/L，0mg/L，直至除菌完全；已诱导出的毛状根每4-6周继代一次，通过转移到新鲜培养基后，获得增长迅速且无菌的毛状根。

步骤(4)中所述的扩增培养包括：将毛状根转移至含有无激素MS液体培养基的锥形瓶中，将锥形瓶置于25℃的摇床上进行暗培养，转速120r/min。

有益效果：本发明通过紫参毛状根诱导的发根农杆菌和外植体筛选、发根农杆菌侵染外植体诱导紫参毛状根、紫参毛状根的除菌继代培养等技术环节，实现了对紫参毛状根的高效、快速诱导，有效提高了紫参毛状根的诱导率。本发明方法操作简便、节约成本，并且有利于RAs的提取利用，不但可以解决RAs新药研究的原料问题，而且有利于保护日益严重的生态环境，诱导出的毛状根生长迅速、激素自养、遗传稳定、培养时间短，为紫参毛状根的大量诱导培养、茜草科类型环肽RAs的规模化生产提供了技术基础，具有重要的意义。

附图说明

图1紫参毛状根的诱导过程；

图2预培养时间对紫参毛状根诱导率的影响；

图3侵染时间对紫参毛状根诱导率的影响；

图4共培养时间对紫参毛状根诱导率的影响；

图5紫参毛状根系的rolB、rolC基因的PCR检测：其中(1)、(2)分别是根据rolB、rolC基因序列设计的两对引物所扩增的PCR产物的电泳图；M为DL2000DNA Mark；H1、H2、H3为诱导出毛状根的rolB、rolC基因；N为无菌组培苗阴性对照；P为菌液阳性对照；

图6紫参毛状根RAs的LC-MS检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。

菌液的购买和培养基的配制：

发根农杆菌菌株A4、LBA9402、ACCC10060及ATCC15834获赠于云南农业大学中药材工程中心杨生超教授课题组。

MS液体培养基组成为：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖，pH 5.8。MS固体培养基组成为：MS基本培养基，附加30g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH 5.8。YEB液体培养基组成为：牛肉浸粉5g/L，酵母浸膏1g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，pH 7.0。YEB固体培养基组成为：牛肉浸粉5g/L，酵母浸膏1g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，琼脂15g/L，pH 7.0。MS重悬液组成为：MS基本培养基，附加10g/L蔗糖，20g/L葡萄糖，pH5.2。

实施例1紫参毛状根最优诱导体系的筛选和优化

1、实验方法

1.1不同发根农杆菌菌株和外植体类型对紫参毛状根诱导的影响

(1)紫参组织培养无菌苗的获得：选择紫参植株当年生嫩芽的节、根茎及叶片作为外植体，于0.5％次氯酸钠震荡处理8min，接着使用无菌水冲洗2次，每次5min。再用0.1％升汞消毒5～8min，接着用无菌水冲洗4次，每次5min。之后，将灭菌后的外植体均匀铺于已灭菌的滤纸上，吸干其表面残留水分后将当年生嫩芽的节、根茎切成0.5cm大小长度，叶片切成0.5cm×0.5cm大小，分别接入含有0.5mg/L、1mg/L及2mg/L TDZ的MS固体培养基上，放置于光照培养箱中，培养条件为白天25℃光照16h，夜间22℃持续8h。20d左右从当年生嫩芽的节中可诱导出紫参无菌组培苗(图1A)。

(2)紫参毛状根诱导外植体的制备：取30日龄的紫参无菌苗，在超净工作台内剪取组培苗的幼茎、带叶的幼茎(切成0.5cm段)作为外植体供之后的发根农杆菌侵染使用。

(3)发根农杆菌侵染液的制备：分别将发根农杆菌菌株A4、LBA9402、ACCC10060及ATCC15834在YEB固体培养基上划线培养，之后将划线平板倒置于28℃恒温培养箱中活化。随后取接菌针挑取单菌落，将单菌落置于放有10mL含50mg/L Rif的YEB液体培养基的离心管中，置于摇床内，28℃，160r/min，过夜培养，待菌液摇至OD₆₀₀为0.8左右时，作为以后摇菌制备菌液的母液。取500μL农杆菌母液接种于含50mg/L Rif的50mL YEB液体培养基中置于摇床内进行培养，培养条件为28℃，160r/min，培养过夜。待农杆菌菌液生长至对数期，即OD₆₀₀值为0.8左右时，取出菌液，倒入50mL离心管中，放置离心机中4000r/min，4℃离心15min。离心后取出离心管，倒去上清液，然后加入含有50mg/L AS的50mL MS重悬液混匀备用。

(4)发根农杆菌菌株及外植体的筛选：未经预培养的紫参不同外植体置于活化好的不同发根农杆菌菌株侵染液中进行侵染10～20min，取出后在无菌滤纸上吸干菌液；之后置于MS固体培养基中于22～25℃、黑暗条件下共培养2d；无菌水冲洗后，再将外植体接种于含有200mg/L Cef的MS固体培养基中诱导培养，40d后记录毛状根的诱导率及数量，以筛选出最佳外植体及发根农杆菌菌株。1.2毛状根诱导条件的优化

(1)发根农杆菌侵染外植体诱导紫参毛状根：将最佳外植体置于MS固体培养基中在光照培养箱中进行预培养，培养条件为25℃光照16h，22℃黑暗8h。将经过预培养的紫参外植体置于最佳发根农杆菌A4侵染液中于摇床上120r/min，28℃进行震荡侵染，之后将侵染后的外植体置于无菌滤纸上，吸干外植体上残留的菌液。随后将外植体水平置于MS固体培养基上放于光照培养箱中，25℃条件下进行共培养。共培养结束后，取出外植体用无菌水冲洗3遍后转移至含有200mg/L Cef的MS固体培养基中，之后即有毛状根产生(图1B)。

(2)紫参毛状根的除菌继代培养：每2周将外植体转移到新鲜的含有抗生素Cef的MS固体培养基中于25℃黑暗条件下进行继代培养，20d后，外植体的伤口部位开始出现毛状根(图1B)。待毛状根从外植体的伤口处长出至3cm左右，从外植体上切下毛状根，转移至含有抗生素Cef的MS固体培养基中于25℃黑暗条件下进行除菌继代培养，以确保毛状根可以在更充足的空间中生长。抗生素Cef的浓度逐渐降低，依次为：200mg/L，100mg/L，50mg/L，0mg/L，直至除菌完全；已诱导出的毛状根每4-6周继代一次。通过反复转移到新鲜培养基后，获得无菌且增长快速的毛状根(图1C)。最后，将毛状根转移至100mL含有无激素MS液体培养基的锥形瓶中进行扩增培养(图1D)，将锥形瓶置于22～25℃的摇床上进行暗培养，转速110～120r/min。

(3)诱导条件的优化：为得到快速、高效的紫参毛状根诱导体系。我们对预培养时间、侵染时间和共培养时间3个发根农杆菌诱导植物毛状根的关键因素进行研究，包括外植体的预培养时间(0d、1d、2d)、侵染时间(10min、20min、30min、40min)及共培养时间(1d、2d、3d、4d)，优化试验统一采用单因素变量试验的方法，对其中一个因素进行实验，其它因素保持不变。在预培养时间的探索中，预培养时间为变量，其他因素分别为侵染时间20min，共培养时间2d；设置农杆菌侵染10min、20min、30min、40min四个实验组，不经预培养，共培养时间2d；在不同共培养时间1d、2d、3d、4d下，侵染20min。每组实验3个重复，每个重复侵染30个外植体。

2、实验结果

2.1紫参无菌苗的诱导

紫参当年生嫩芽的节、根茎及叶片接入含TDZ的MS固体培养基后，根茎容易褐化，叶片容易污染，均不能诱导出无菌苗；仅当年生嫩芽的节在含TDZ的MS培养基中20d后从伤口处诱导出嫩芽，且在0.5mg/L及1mg/L TDZ的MS培养基中的诱导率分别为92％，98％。20～30d后嫩芽长大形成无菌苗(表1，图1A)。

表1紫参不同部位的无菌苗诱导效果

2.2不同发根农杆菌菌株和外植体类型对紫参毛状根诱导的影响

在得到紫参无菌苗后，分别使用4种不同的发根农杆菌菌株A4、LBA9402、ACCC10060及ATCC15834侵染无菌苗茎段、带叶的幼茎。经实验发现，4种发根农杆菌侵染带叶的幼茎后，在其伤口处发现一定程度的愈伤化，共培养结束20d后A4、LBA9402开始诱导出毛状根，ACCC10060、ATCC15834分别在共培养结束后的34d、45d诱导紫参长出毛状根，与此同时，A4、LBA9402诱导的毛状根数量陆续增加；其中，A4对紫参毛状根的诱导能力最强，诱导率和毛状根数量分别为50％和52，其次是ATCC15834；除了菌株LBA9402，其余菌株均不能侵染茎段诱导出紫参毛状根，而且LBA9402侵染茎段对毛状根的诱导率仅为5％。具体结果详见表2。

表2不同发根农杆菌菌株和外植体类型对紫参毛状根诱导的影响

实验结果发现，在紫参毛状根的诱导过程中，使用发根农杆菌A4对紫参带叶的幼茎进行侵染，可以达到较好的诱导效果。因此，紫参毛状根诱导的最佳发根农杆菌及外植体为A4及带叶的幼茎。

2.3毛状根诱导条件的优化

通过图2可以看出，无论共培养条件是黑暗还是光照环境下，预培养时间对毛状根的诱导率具有显著的影响，预培养0d的外植体被A4侵染后毛状根的诱导率最高，黑暗共培养条件下的平均诱导率为63.33％，光照共培养条件下的平均诱导率为18.89％。

用未经预培养的紫参外植体进行下一组的实验，利用A4侵染液对紫参外植体进行不同时间的侵染，结果表明当侵染时间为20min、30min时的毛状根诱导率显著高于其它两个处理，且侵染时间为30min时毛状根诱导率最高，在黑暗和光照共培养条件下分别为64.44％、23.33％(图3)。

最后，经过不同时间的共培养，紫参毛状根的诱导率也存在显著的差异，黑暗共培养3d的毛状根诱导率最高，可以达到68.89％，而黑暗共培养4d的毛状根诱导率为0％，是由于共培养时间过长造成外植体受发根农杆菌侵害而死；光照条件下，仅共培养2d、3d可以诱导出毛状根，共培养时间过长或过短均不能诱导出毛状根(图4)。

综上所述，紫参毛状根诱导的最佳诱导条件应该是：利用发根农杆菌A4侵染未经预培养的无菌苗带叶幼茎30min，再经过3d的黑暗共培养，显著提高紫参毛状根的诱导效果，得到较高的毛状根诱导率。

实验例2本发明所诱导和扩繁的紫参毛状根的分子检测

1、实验方法

当发根农杆菌感染植物形成毛状根时，发根农杆菌A4的Ri质粒的T-DNA区中的致根rol基因转移至植物基因组中，最终诱导产生毛状根。为确认诱导出的根是否为毛状根，除了形态上的观察和区分外，还需要对毛状根进行分子水平的检测，确定诱导出的毛状根中是否插入rol基因。

待实验例1中诱导的毛状根生长到1～3cm长度后，使用北京擎科新业生物技术有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取随机选取的3份紫参毛状根的基因组DNA，利用特异性引物对毛状根中含有的rol基因(rolB、rolC基因)进行PCR检测。

根据rolB基因序列分别设计两对特异性引物如下：

rolB1-F：5’-CTATTCCTTCCACGATTTCA-3’，

rolB1-R：5’-CCGGCTGACTAACAAACATA-3’；PCR产物大小为256bp。

rolB2-F：5’-GTCTGCTATCATCCTCCTATG-3’，

rolB2-R：5’-AGAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’；PCR产物大小为300bp。

根据rolC基因序列分别设计两对特异性引物如下：

rolC1-F：5’-CTGAGCCCTCTATTGACCT-3’，

rolC1-R：5’-AATGAGCGTAAACCCTTG-3’；PCR产物大小为230bp。

rolC2-F：5’-TACGTCGACTGCCCGACGATG-3’，

rolC2-R：5’-TGCATTCGCCATGCCTCACC-3’；PCR产物大小为350bp。

PCR检测的反应体系：采用25μL的反应体积：DNA模板50ng(2μL)，上下游引物各0.5μL，Mix(Green，北京擎科新业生物技术有限公司，含DNApolymerase、dNTPs、buffer、Mg²⁺、双蒸水)22μL。

PCR反应条件：第一步，98℃预变性2min；第二步，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸2min，-20℃保存。

取5μL扩增产物加入1μL DNA loading buffer，置于1％琼脂糖凝胶(加入1μL核酸染料，使胶呈微红色)电泳上进行110V恒压电泳，18min后停止电泳，取出凝胶，置凝胶成像系统下观察并记录结果。

2、实验结果

紫参毛状根系的rolB、rolC基因的PCR检测结果如图5所示，随机选取3份实施例1诱导的紫参毛状根，均能扩增出目的片段，即存在rolB、rolC基因，说明发根农杆菌A4的rol基因已整合到紫参的基因组中，诱导出的根是紫参毛状根。

实验例3本发明所诱导和扩繁的紫参毛状根RAs的LC-MS检测

1、实验方法

紫参毛状根经MS液体培养基培养60d后，通过LC-MS检测毛状根是否含有RAs。

称取1g实验例1中得到的烘干至恒重的毛状根置于25mL具塞锥形瓶中，移取10mL83％甲醇浸泡过夜，超声室温处理86min，提取3次，将锥形瓶中的溶液转移合并至EP管中，13,500×g离心5min，取上清液转移至新的EP管待用。取1mL上清液用0.22μm尼龙滤膜过滤，用于UPLC-MS检测。

基于RAs的结构特点和质谱裂解规律，利用Waters ACQUITY UPLC H Classsystem串联Waters XEVO TQD，对RAs进行定性检测。液相条件：色谱柱为Waters ACQUITY

BEH C₁₈column(50mm×2.1mm,1.7μm,Waters,Wexford,Ireland)(35℃)。流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸的乙腈。质谱条件：正离子MRM采集模式，质量范围为100-1000m/z，保护气为N₂，脱溶剂气温度为450℃；离子源温度为148℃；碰撞气体为氩气。锥电压和碰撞能量通过自动优化确定。

2、实验结果

LC-MS检测结果表明毛状根中含有7种RAs：RY-II([M+H]⁺＝935)、RA-XIII([M+H]⁺＝977)、RA-XII([M+H]⁺＝919)、RA-I([M+H]⁺＝773)、RA-XI([M+H]⁺＝815)、RA-V([M+H]⁺＝757)、RA-VII([M+H]⁺＝771)(图6)。

Claims (7)

1.一种紫参毛状根的诱导与快速扩繁方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用发根农杆菌侵染紫参外植体；

(2)将步骤(1)侵染后的紫参外植体在黑暗条件下进行共培养；

(3)将步骤(2)共培养后的紫参外植体转移至诱导培养基中进行诱导培养；

(4)将步骤(3)诱导产生的紫参毛状根进行除菌继代培养和扩增培养；

(5)将步骤(4)获得的紫参毛状根通过LC-MS进行环肽类成分RAs检测；

步骤(1)中，所述紫参外植体为20～50日龄无菌紫参组培苗的幼茎或带叶的幼茎，其中无菌紫参组培苗通过紫参当年生嫩芽的节接入含有0.5～1.5mg/L TDZ的MS固体培养基诱导而来；

步骤(1)中，所述发根农杆菌选自农杆菌菌株A4、LBA9402、ACCC10060、ATCC15834；

步骤(4)中，所述除菌继代培养为：每2周将紫参外植体转移到新鲜的含有抗生素头孢噻肟钠(Cef)的MS固体培养基中继代培养，直至长出毛状根；继代培养条件为：黑暗条件，温度22～25℃；毛状根从紫参外植体的伤口处长出1～3cm后，切下毛状根，转移至含有抗生素Cef的MS固体培养基中，于22～25℃黑暗条件下进行除菌继代培养，抗生素Cef的浓度逐渐降低，依次为：200mg/L，100mg/L，50mg/L，0mg/L，直至除菌完全；已诱导出的毛状根每4-6周继代一次；

步骤(5)中，所述LC-MS分析条件为：将紫参毛状根用83％甲醇超声提取3次，过滤，13,500×g离心5min，滤液进行LC-MS分析。液相条件：流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸的乙腈；质谱条件：正离子MRM采集模式。

2.根据权利要求1所述的紫参毛状根的诱导与快速扩繁方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发根农杆菌选择A4，外植体选择无菌紫参组培苗带叶的幼茎。

3.根据权利要求1所述的紫参毛状根的诱导与快速扩繁方法，其特征在于，步骤(1)中，所述紫参外植体先进行预培养，所述预培养是组培苗的幼茎或带叶的幼茎置于MS固体培养基中，在22～25℃光照14～18h，然后18～22℃培养0～2d。

4.根据权利要求1所述的紫参毛状根的诱导与快速扩繁方法，其特征在于，步骤(1)中，所述侵染是指采用发根农杆菌菌液浸泡紫参外植体10～40min。

5.根据权利要求1所述的紫参毛状根的诱导与快速扩繁方法，其特征在于，步骤(2)中，所述共培养是将发根农杆菌侵染后的紫参外植体置于MS固体培养基上，在22～25℃条件下共培养0～4d。

6.根据权利要求1所述的紫参毛状根的诱导与快速扩繁方法，其特征在于，步骤(3)中，所述诱导培养基为含有200～300mg/L抗生素Cef的MS培养基，诱导培养条件为黑暗环境，22～25℃，诱导时间为20d以上。

7.根据权利要求1所述的紫参毛状根的诱导与快速扩繁方法，其特征在于，步骤(4)中，所述扩增培养为：将紫参毛状根转移至无抗生素MS液体培养基中，置于22～25℃的摇床上进行暗培养，转速110～120r/min。

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