CN107372106A - 一种利用丹参毛状根获得再生植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用丹参毛状根获得再生植株的方法，包括如下步骤：将暗培养条件下新产生的丹参毛状根外植体切段，置于诱导培养基中，于25℃，暗培养一个月，诱导产生愈伤组织。然后移至25℃，16h/8h光/暗条件下培养，约7d后，在愈伤组织上形成不定芽。将长有不定芽的愈伤组织置于诱导培养基上继续进行扩繁培养。然后将不定芽从愈伤组织中切下，并转移至生根培养基，于25℃，16h/8h光/暗条件下培养。待不定根生长至2‑3厘米时，移栽至温室中进行炼苗处理，获得可正常生长的丹参植株。本发明提供的丹参毛状根再生植株方法，不定芽诱导率为50％以上，生根率为100％。本发明为丹参植株的快速扩繁及基因工程提供一种新的组织培养方法。

Description

一种利用丹参毛状根获得再生植株的方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及一种利用丹参毛状根获得再生植株的方法。

背景技术

唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza)是一类治疗和预防心脑血管疾病、高血脂和急性缺血性中风的临床常用中药(Zhou LM，et al.，2005)。由于丹参的化学组成比较丰富，其药理作用也比较全面。丹参中的水溶性成分中的丹酚酸A和丹酚酸B具有抑制自由基和抗氧化的功效(John HK，et al.，2014)。丹参类药物可以有效抑制肝星状细胞增殖及纤维化，在治疗肝硬化中具有独特的功效(Liu CH，et al.，2000)。丹参素可以抑制钙离子涌入血管平滑肌并打开钾离子通道，从而促进血管舒张和心血管健康(Lam FF，et al.，2005)。丹参还能够抑制血小板聚集，减少或延迟发展成动脉硬化并防止脑梗(Lin TH，etal.，2010)。此外，丹参中的丹酚酸A、丹酚酸B、丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮等均具有抗肿瘤活性，在治疗肝癌和乳腺癌方面有较高的应用价值(Huang XY，et al.，2009；Yang W，et al.，2010)。由于丹参在治疗心血管系统疾病中的重要作用及无毒负作用的特点，国内外对丹参药物的需求量不断增加。受资源和环境条件的限制，以及丹参中有效成分含量较低等因素的影响，仅仅依靠采集野生资源或人工种植很难满足需要。现代生物技术的发展为丹参的工业化生产，解决中药资源紧缺及品质和抗性改良提供了有效的技术途径(张夏楠，2014)。

尽管基于发根农杆菌Ri质粒携带基因诱发产生的毛状根系统为丹参药物的工业化生产提供了一个良好的操作平台，但目前利用丹参毛状根系统实现商业化的例子还很少。如何充分利用已有丹参毛状根系统最新研究进展，加快丹参品质改良，提高丹参有效成分的含量，为医药工业提供高品质丹参药源是目前丹参研发与生产中急需解决的关键问题。另一方面，提高丹参抗病虫和耐逆性，对于降低丹参种植成本，减少农药残留，提高丹参产品的安全性也是目前所关注的重要问题。

基因工程技术为丹参品质改良及优良品种选育提供了有效的技术手段。目前丹参遗传转化采用的主要方法为农杆菌介导法，常用的外植体包括叶片和原生质体(Yan YP，etal.，2007；Han LM，et al.，2007；成海宁等，2014)。尽管利用叶片作为外植体进行遗传转化具有外植体取样方便，重复性好等优势，但该方法存在转化效率低、纯合较为困难以及嵌合体等方面的问题。与叶片外植体相比，利用丹参毛状根作为外植体具有多方面的优势。由于毛状根为单细胞起源，由毛状根再生的植株是纯合体，有效解决了嵌合体的问题。同时，丹参毛状根转化简单易行，通过转基因毛状根直接再生植株，可以避免农杆菌介导转化法中复杂的转化、筛选及再生等过程，因而更加高效、简便，大幅度缩短选育周期。更为重要的是，该方法可以将毛状根系统的最新研究成果快速应用到实际生产中，因而具有广阔的应用前景。目前尚未发现与本发明主题提及的利用丹参毛状根获得再生植株的相关报道。基于上述理解，提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用丹参毛状根获得再生植株的方法，该方法以丹参毛状根为外植体，通过组织培养获得可正常生长的丹参植株，为丹参快速扩繁及基因工程提供一种新的组织培养方法。

本发明采用以下技术方案来实现：

一种利用丹参毛状根获得再生植株的方法，包括如下步骤：

(1)将暗培养条件下新产生的丹参毛状根切成2-3厘米的小段，置于诱导培养基中，于25℃条件下，暗培养一个月，诱导产生愈伤组织；然后移至25℃，16h/8h光/暗条件下培养；7d后，在愈伤组织上分化出绿色不定芽；

(2)将长有绿色不定芽的愈伤组织转移至新鲜诱导培养中，进行扩繁培养，培养条件为25℃，16h/8h光/暗培养，2-3周更换一次诱导培养基；

(3)将不定芽从愈伤组织中切下，并转移至生根培养基，于25℃，16h/8h光/暗条件下培养，约1-2周后长出不定根；待不定根生长至2-3厘米时，移栽至温室中进行炼苗处理，获得可正常生长的丹参植株；

(4)提取丹参再生植株叶片DNA，利用发根农杆菌rolB和rolC基因特异性引物进行PCR扩增，确定再生植株中整合了来自于发根农杆菌Ri质粒的诱导毛状根基因。

作为优选，所述诱导培养基为1×MS培养基+6-苄基腺嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.8；所述诱导培养基可以用于丹参毛状根外植体不定芽的诱导和组培扩繁培养。

作为优选，新产生的丹参毛状根外植体切段，在暗培养条件下诱导产生愈伤组织后，再转移至16h/8h光/暗条件下培养，诱导不定芽的发生。

作为优选，所述生根培养基为1/2×MS+吲哚丁酸0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH 5.8。

作为优选，所述发根农杆菌为ATCC15834。

所述丹参毛状根再生植株基因组中整合了来自于发根农杆菌Ri质粒的诱导毛状根基因。

所述rolB基因检测引物为：RolB-F：5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’(上游引物)，RolB-R：’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’(下游引物)，扩增片段大小为423bp。所述rolC基因检测引物为：RolC-F：5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’(上游引物)，RolC-R：5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’(下游引物)，扩增片段大小为626bp。

本发明的有益效果是：

本发明利用丹参毛状根作为外植体，在诱导培养基上形成不定芽，并经生根培养形成可正常生长的丹参植株。

本发明提供一种利用丹参毛状根获得再生植株的方法，不定芽诱导率为50％以上，生根率为100％。本发明提供的方法避免了常规农杆菌介导法复杂的转化、筛选及再生等过程，因而更为高效、简便。另外，本发明可以实现毛状根系统最新研究成果在生产实际中的快速应用，为丹参优良品种选育和种植，满足医药工业对高品质丹参药源的需求具有重要意义。

附图说明

图1为丹参毛状根在诱导培养基上形成不定芽；

图2为丹参毛状根不定芽在诱导培养基上增殖扩繁；

图3为生根培养基上再生的丹参植株；

图4为丹参毛状根再生植株rolB基因PCR检测；

图5为丹参毛状根再生植株rolC基因PCR检测。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。

如图1-3所示，

实施例1：利用丹参毛状根获得再生植株

1.将发根农杆菌ATCC15834诱导产生的丹参毛状根在25℃条件下暗培养2-3周后，利用无菌接种刀将新产生的毛状根切成2-3厘米的小段，并分别置于诱导培养基SIM-1、SIM-2、SIM-3、SIM-4中，每个培养基接种10个外植体，重复5次。于25℃条件下，暗培养一个月，诱导产生愈伤组织。将愈伤组织转移至25℃，16h/8h(光/暗)条件下培养。约7d后，在愈伤组织上分化出绿色不定芽。

表1.四种丹参毛状根不定芽诱导培养基

2.将愈伤组织上的不定芽切下，并转接生根培养基(1/2×MS+吲哚丁酸0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，PH 5.8)。培养条件为25℃，16h/8h(光/暗)培养，约1-2周后长出不定根。待不定根生长至2-3厘米时，移栽至温室中进行炼苗处理，获得可以正常生长的丹参植株。

表2.四种不定芽诱导培养基诱导率和生根率

在选用的四种丹参毛状根不定芽诱导培养基中，SIM-1诱导率最高，为51.25％。诱导发生的不定芽在生根培养基上均可以产生不定根，生根率为100％。

实施例2：丹参毛状根再生植株的快速扩繁

将长有绿色不定芽的愈伤组织转移至新鲜诱导培养中，通过切割增殖在诱导培养基上进行扩繁培养，培养条件为25℃，16h/8h(光/暗)，2-3周更换一次诱导培养基。将大量发生的不定芽从愈伤组织中分别切下，并转接生根培养基(1/2×MS+吲哚丁酸0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，PH 5.8)，待不定根生长至2-3厘米时，移栽至温室中获得可正常生长的丹参植株。通过毛状根再生植株的快速扩繁，可以在短期内获得大批量丹参组培苗。

实施例3：丹参毛状根再生植株分子检测

1.丹参毛状根再生植株基因组DNA提取

采用CTAB法小量提取丹参毛状根、丹参毛状根再生植株叶片及丹参植株叶片基因组DNA，具体方法如下：

(1)分别剪取丹参毛状根、丹参毛状根再生植株叶片及丹参植株叶片(非转化植株)各200mg，加入液氮后，迅速研磨成粉状。

(2)加入800μl CTAB缓冲液(含0.1mol/L Tris-HCl(PH8.0)，1.4mol/L氯化钠，2％CTAB，0.02mol/L EDTA-Na₂，0.2％巯基乙醇)，于65℃水浴1h，中间摇动2～3次。

(3)12000rpm离心15min，转移上清至另一离心管中，加入氯仿/异戊醇(24∶1)600μl，置于摇床摇5min。

(4)12000rpm离心15min，转移上清于另一离心管中，加入2/3体积的预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置2h。

(5)12000rpm离心15min，去上清，加入75％的乙醇1ml，颠倒混匀。

(6)12000rpm离心15min，去上清，空气中干燥10-15min，加入50μl ddH₂O，-20℃保存，用于PCR检测。

2.丹参毛状根再生植株rolB和rolC基因PCR检测

根据Ri质粒诱导毛状根基因rolB和rolC设计特异性检测引物。rolB基因检测引物为：RolB-F：5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’(上游引物)，RolB-R：’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’(下游引物)，预期扩增片段大小为423bp。rolC基因检测引物为：RolC-F：5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’(上游引物)，RolC-R：5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’(下游引物)，预期扩增片段大小为626bp。

PCR反应体系(25ul)为：10×PCR缓冲液2.5uL，10mmol/L dNTPs 0.5uL，5U/uL Taq酶0.5uL，样品DNA 1.0uL，10umol/L上游引物0.5uL，10umol/L下游引物0.5uL，ddH₂O19.5uL。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，58℃30s，72℃ 1min，共30个循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，并利用EB进行染色，以确定是否存在特异性扩增条带。

如图4、图5所示，其中：

图4为丹参毛状根再生植株rolB基因PCR检测；

M：DNA标准分子量(2K)，Ctl+：丹参毛状根(阳性对照)，Wt：非转化丹参植株叶片(阴性对照)，1-6：丹参毛状根再生植株叶片；

图5为丹参毛状根再生植株rolC基因PCR检测；

M：DNA标准分子量(2K)，Ctl+：丹参毛状根(阳性对照)，Wt：非转化丹参植株叶片(阴性对照)，1-6：丹参毛状根再生植株叶片。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种利用丹参毛状根获得再生植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将暗培养条件下新产生的丹参毛状根切成2-3厘米的小段，置于诱导培养基中，于25℃条件下，暗培养一个月，诱导产生愈伤组织；然后移至25℃，16h/8h光/暗条件下培养；7d后，在愈伤组织上分化出绿色不定芽；

(2)将长有绿色不定芽的愈伤组织转移至新鲜诱导培养中，进行扩繁培养，培养条件为25℃，16h/8h光/暗培养，2-3周更换一次诱导培养基；

(3)将不定芽从愈伤组织中切下，并转移至生根培养基，于25℃，16h/8h光/暗条件下培养，约1-2周后长出不定根；待不定根生长至2-3厘米时，移栽至温室中进行炼苗处理，获得可正常生长的丹参植株；

(4)提取丹参再生植株叶片DNA，利用发根农杆菌roIB和roIC基因特异性引物进行PCR扩增，确定再生植株中整合了来自于发根农杆菌Ri质粒的诱导毛状根基因。

2.根据权利要求1所述的利用丹参毛状根获得再生植株的方法，其特征在于：所述诱导培养基为1×MS培养基+6-苄基腺嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.8；所述诱导培养基可以用于丹参毛状根外植体不定芽的诱导和组培扩繁培养。

3.根据权利要求1所述的利用丹参毛状根获得再生植株的方法，其特征在于：新产生的丹参毛状根外植体切段，在暗培养条件下诱导产生愈伤组织后，再转移至16h/8h光/暗条件下培养，诱导不定芽的发生。

4.根据权利要求1所述的利用丹参毛状根获得再生植株的方法，其特征在于：所述生根培养基为1/2×MS+吲哚丁酸0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.8。

5.根据权利要求1所述的利用丹参毛状根获得再生植株的方法，其特征在于：丹参毛状根再生植株基因组中整合了来自于发根农杆菌Ri质粒的诱导毛状根基因。

6.根据权利要求1所述的利用丹参毛状根获得再生植株的方法，其特征在于：所述发根农杆菌为ATCC15834。