CN1742562A - 培养新疆雪莲毛状根和再生苗及生产紫丁香甙的方法 - Google Patents

Abstract

一种培养新疆雪莲毛状根和再生苗及生产紫丁香甙的方法：取新疆雪莲种子萌发后的绿色子叶置于诱导丛生苗培养基上进行培养，诱导培养获得丛生芽；丛生芽置于苗生长培养基，进行单株培养；单株移置于诱根培养基培养，获得下端长有实生根的再生苗；有实生根的苗的外植体切段(叶片、叶柄和根段)，置于预培养培养基上暗培养，经发根农杆菌介导进行转化，其外植体于弱光培养诱导发根，出现的毛状根接入筛选培养基上继代培养，选择抗Km且PCR检测显阳性的发根根系，切取根尖1－2cm用于进行液体扩大培养和再生苗的获得。毛状根及其再生苗培养物用于干燥、粉碎、有机溶剂分离、提取、制备雪莲紫丁香甙。

Description

培养新疆雪莲毛状根和再生苗及生产紫丁香甙的方法

技术领域

本发明属于植物生物技术工程领域，具体地涉及一种新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir)毛状根和再生苗的培养方法。

本发明还涉及利用上述毛状根和再生苗生产紫丁香甙的方法。

技术背景

雪莲又名雪莲花，是我国二级珍稀保护植物，早在《西北域记》和《相园小识》中，就有关于雪莲的记载，并把二者合而为一，统称雪莲花。作为雪莲花，其原生植物种类较多，如西藏等地用三指雪兔子(Saussurea tridactyla)；四川、云南等地用绵头雪兔子(Saussurea lanicps)；甘肃、青海等地用水母雪莲(Saussurea medusa)；青海也用雪兔子(Saussureagossypiphora)；新疆用新疆雪莲(Saussurea involucrata)等，但均属于菊科凤毛菊属(Saussurea)雪兔子亚属(Subgen Eriocorye)植物。上述各种雪莲，虽然据中药文献记载均可同等入药，但其品质有优劣之分。其中药用价值最高的是新疆雪莲，其次为水母雪莲和青海雪兔子。

新疆雪莲为多年生草本植物，是民间常用的一类名贵中药材，产量大，质量好。其性温，味微苦，入肝、脾、肾三经，具有散寒除湿，活血通经、强筋助阳、抗炎、镇痛、收缩子宫等功能。民间常用于治疗风湿性关节炎，动脉硬化、延缓衰老、终止妊娠，妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症。然而，新疆雪莲生境恶劣，多分布于海拔3,500-4,000米以上的高山流石滩上，其自然生长极其缓慢。更加上近年来无节制地采集雪莲入药，对雪莲野生植物资源已造成近于毁灭性的破坏，并且直接导致生态环境的恶化。为此，我国早已将雪莲列为国家二级保护植物。紫丁香甙是雪莲中所含有的一种苯丙素类化合物，具有杀菌、抗疲劳、延缓衰老、促性腺、抗辐射及止血等重要的药用价值，可以起到护肝、抗超敏性、调节免疫力和抑制某些肿瘤细胞生长的作用。但是紫丁香甙在野生雪莲和种植雪莲中的含量不高(-0.4％)，在其他天然药用植物中不超过1.0％(其中紫丁香甙含量较高的刺五加原植物中约为0.5％)，而且还受到产地、收获季节和生长时间等条件的影响。针对上述情况，迫切需要寻找一条新的途径来解决新疆雪莲药用资源问题。

近年来，世界上许多国家如美、英、日、韩及我国都曾对药用植物发根培养技术进行过深入的研究。研究表明，毛状根培养系统具有单细胞起源性和激素自主性等特点，不仅生长迅速，遗传稳定，能够大量积累次生代谢物质，而且容易获得再生植株，这是细胞培养和一般器官培养所不能同时达到的。因此，在几乎所有的双子叶植物以及部分单子叶植物中合成的某些次生代谢物，大多数都可以用毛状根培养的方法来生产，从而为利用发根培养技术生产具有重要药用价值的次级代谢物(如生物碱、苯丙素类、萜类、多胺类、黄酮类物质等)开辟了新途径。到目前为止，已经先后在31个科100多种植物中实现了毛状根的成功转化。其中，报道的关于毛状根诱导和培养的药用植物有西洋参、绞股蓝、长春花、蒲公英、直立杂种紫杉、野葛、曼佗罗、芜菁等。而关于新疆雪莲毛状根及其再生苗培养的研究，在国内外尚未见诸报道。

发明内容

针对上述存在的野生雪莲药用资源的破坏和枯竭问题，而种植雪莲难以达预期效用，本发明的目的在于提供一种新疆雪莲(S.involucrata Kar.et Kir.)毛状根及其再生植株培养体系和培养方法。

本发明的另一个目的在于提供一种从新疆雪莲毛状根及其再生苗的培养物中提取制备雪莲紫丁香甙的方法。

本发明提供的新疆雪莲(S.involucrata Kar.et Kir.)毛状根及其再生植株培养体系和培养方法，具体步骤如下：

a)萌发新疆雪莲的无菌种子，取子叶柄，置于诱导丛生苗培养基上诱导培养获得丛生苗；培养基MS+BA(2.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)，25℃，光强2000lux，24小时光照；

b)丛生苗置于苗生长培养基MS+BA(1.0mg/L)+NAA(0.1/L)，25℃，光强2000lux，24小时光照，25天继代一次进行单株培养；

c)单株移置于诱根培养基(1/2MS+0.5mg/L IAA)，获得下端长有实生根的苗；

d)有实生根苗的叶片切段为外植体，置于预培养基MS+NAA(2.0mg/L)+BA(0.5mg/L)中暗培养2-4天，经发根农杆菌介导进行转化，其外植体于弱光培养诱导毛状根；

e)诱导出的毛状根接入筛选培养基1/2MS(3％蔗糖)+Cef(300mg/L)+GA₃(0.5mg/L)+Km(50mg/L)上再培养，选择抗Km且PCR(聚合酶链式反应)检测显阳性的根系，切取根尖用液体扩大培养再生苗；

f)切取根尖接种于MS固体培养基，获得来自毛状根的再生芽；毛状根的再生芽接种于MS培养基，再生芽陆续生根最终获得毛状根的再生苗。

所述的培养方法，步骤a中的子叶柄是指萌发3天苗龄的绿色子叶柄。

所述的培养方法，步骤d中的发根农杆菌有R1601、R1000、LBA9402或A4。

所述的培养方法，步骤d中的发根农杆菌是在乙酰丁香酮(As50μM)和脯氨酸(250mg/L)培养过的发根农杆菌。

所述的培养方法，步骤d中的培养诱导发根是指除菌后，叶片培养于1/2MS(蔗糖30g/L)+GA₃(0.5mg/L)+Cef(500mg/L)，光照培养3-5天，然后进行弱光培养诱导发根。

所述的培养方法，步骤e的毛状根液体扩大培养采用液体MS培养基，有菌再生时则加入Cef 200-500mg/L，培养优化基为蔗糖40g/L，GA₃1-2mg/L。

所述的培养方法，步骤f的毛状根再生芽培养基为：MS固体培养基附加1mg/L BA+0.1mg/L NAA；毛状根再生芽的生根培养基为：MS培养基附加2.0mg/L IAA。

本发明从新疆雪莲毛状根及其再生苗的培养物中提取雪莲紫丁香甙的方法，主要步骤如下：

i)取雪莲毛状根及其再生苗培养物于空气循环干燥器40-60℃烘干，得到的干粉，粉碎成20-30目的物料；

ii)按每克物料加入5-10ml的比例加入浓度为50-70％的乙醇，室温下浸取6-10小时；

iii)上一步骤得到的浸取液按体积比1∶10-1∶5加入正丁醇萃取，得到紫丁香甙。

所述的提取方法，步骤ii可以重复进行数次。

所述的提取方法，步骤ii得到的浸取液按体积比1∶10-1∶5依次加入石油醚和乙醚进行萃取除杂后，再进行步骤iii。

所述的方法，步骤iii得到的紫丁香甙用以下步骤进行提纯：

硅胶拌匀，水浴蒸干，转移至硅胶层析柱中，用2-3倍柱体积地洗脱液洗脱，该洗脱液按体积比为氯仿∶甲醇＝9-7∶1-3；收集洗脱液并蒸干。

本方法所获得的紫丁香甙含量为毛状根干重的4-5％(毛状根的生长效率-6-8g/L/25d干重)，毛状根再生苗干重的3-4％(毛状根再生苗的生长效率-12-15g/L/25d干重)，毛状根中紫丁香甙生产率为240-400mg/L/25d，毛状根再生苗中紫丁香甙生产率为360-600mg/L/25d。

本发明通过发根农杆菌诱导新疆雪莲得到的毛状根，经25天液体培养后，其生物量(干重)能够达到初始接种量的15-20倍，其紫丁香甙含量可达到毛状根干重的4-5％，比种植雪莲和野生生药的0.4％有显著的提高。

另外，本发明还可以利用培养高产紫丁香甙的雪莲毛状根及其再生苗达到产业化生产雪莲紫丁香甙化合物的目的。通过毛状根再生技术，可较容易地获得再生苗。所得到的再生苗不但能够栽培成活，而且生长迅速，紫丁香甙生产效率可达到360-600mg/L/25d。因此，通过毛状根诱导和培养技术并结合毛状根再生苗快繁和栽培技术将成为解决雪莲资源问题是一条有效的途径，可是目前尚未见到关于用毛状根诱导技术培养生产雪莲紫丁香甙的报道。因此，本发明不仅可以保护有限的野生植物资源免受破坏和维护人类赖以生存的生态环境，而且为走雪莲工业化培养的道路，生产紫丁香甙化合物开辟新途径。

本发明与已有的栽培技术相比具有如下优点：

(1)应用新疆雪莲毛状根大量培养生产雪莲紫丁香甙化合物与栽培和野生的植物相比，不但可获得好的质量和高的产量，而且不受自然条件的限制和影响。

(2)不需占用耕地面积，只需要占用有限的厂房和培养室。

(3)可以通过人工调节与控制毛状根的生长和次生产物的合成；可极大地提高紫丁香甙化合物的产量

(4)该项技术，不使用光照，在暗中进行毛状根培养，故可节省电力，减少成本价格。产量与含量稳定，污染率极低，适合工业化生产。

附图说明

图1新疆雪莲的种子萌发。

图2新疆雪莲的再生苗。

图3R1601第二次活化生长曲线。

图4发根农杆菌R1601感染雪莲茎段、根段外植体14天后形成的发根。

图5发根农杆菌R1601感染雪莲叶片外植体14天后形成的发根。

图6新疆雪莲发根及其再生苗中rolB基因的PCR检测，图中：

1、Marker(GeneRulerTM 100bpDNA ladder)；2、-CK(系统负对照)；3、negative(未经感染的新疆雪莲的叶片)；4、positive(R1601质粒)；4、Hr(新疆雪莲的毛状根)；5、Rp(新疆雪莲毛状根再生植株叶片)。

图7液体培养中的新疆雪莲发状根高产Hr系。

图8新疆雪莲发状根再生植株Rp。

图9新疆雪莲发状根再生植株的移栽。

图10新疆雪莲发根及其再生苗中紫丁香甙的HPLC(高压液相色谱)检测，图中：

A、野生新疆雪莲提取物；B、新疆雪莲毛状根再生苗提取物；C、新疆雪莲毛状根提取物。

S：syringin；Retention time of syringin：16.6min。

具体实施式

为了更好理解本发明，通过如下实施例予以进一步说明，但并非是对本发明的限定。

实施例中涉及的缩写术语、培养基：

1)外植体：新疆雪莲的无菌试管苗新展开叶片、茎段、根段及种子萌发产生的子叶、胚轴、胚根，切开成1.0cm²、0.1cm×1cm的小段。

2)发根农杆菌菌种：R1000、R1601(均由北京大学林忠平教授赠送)；LBA9402(由清华大学郭志钢教授惠赠)；A4(为野生型)。这里提到的R1601是R1000的人工改造菌株，涉及的改造为：第一、农杆碱型pRiA4质粒的TL--DNA上插入新霉素磷酸转移霉基因(NPT II)，转基因细胞可以用卡那霉素筛选，第二、引入高毒力Ti质粒pTiBo542的Vir区域，提高了R1601的感染效率。以上所述的四种发根农杆菌菌种的出处如下：

R1000：《发根农杆菌对野葛的遗传转化及其影响因素》于树宏、李玲等，《高技术通讯》，2002，03；《长春花转化毛状根诱导及培养条件的优化》孙敏、汪洪等，《西南师范大学学报》2002，27(4)；

R1601：《Ri质粒转化牛膝及其发状根的培养》郭凤蕊、唐桂芬等，《河南科学》，1997，15(4)；《发根土壤杆菌对葛属药用植物的遗传转化》刘传飞、于树宏等，《植物学报》，2002，42(9)：936-939；

LBA9402：《何首乌毛状根培养及其活性成分的产生》王莉、于荣敏等《生物工程学报》，2002，18(1)：；《PRi 9402转化桔梗的研究》王义、张美萍等，《吉林农业大学学报》，1997，19(4)：52-55；

A4：《不同理化因子对发根农杆菌Ri质粒转化骆驼刺的影响》，步怀宇、景建洲等，《西北植物学报》，2000，20(4)：577-584；《甘草毛状根培养系统的建立及化学成分分析》向德军等，《植物资源与环境学报》2001，10(1)：7-10；《四倍体菘蓝毛状根培养系统的建立及外界因子对其生长的影响》李博华 张汉明等，《中草药》2000，31(2)。

3)发根农杆菌培养基：YEB(出处为Verviliet et al.1975)

4)植物基本培养基：MS(出处为Murashige and Skoog，1962)

5)抗生素：Km(kanamycin，卡那霉素)、Cef(cephamycin，头胞霉素)

6)激素：BA(Benzyladenine，6-苄基腺嘌呤)、GA₃(Gibberellic acid，赤霉素)、IAA(Indoleacetic acid，3-吲哚乙酸)、NAA(Naphthaleneacetic acid，α-奈乙酸)

7)标准品：紫丁香甙(syringin)

8)其他试剂：乙酰丁香酮AS(3，5-methoxy-4-hydroxyacetophenone)、脯氨酸Pro(proline)

实施例1

1.建立新疆雪莲高频再生体系

1.1、种子消毒处理

种子来源：2002年于新疆天山博格达峰采摘的新疆雪莲(S.Involucrata)干品，从花序中剥得种子。

清洗：挑选健康饱满，无霉变的种子，自来水冲洗4遍，室温浸泡过夜，流水冲洗1h。

消毒：70％乙醇浸泡30s，0.1％升汞作用20-25min，无菌水清洗4-6次。

种子萌发：无激素MS培养基，3％蔗糖，0.8％琼脂，25℃，光强2000lux，连续光照，3天后种子陆续萌发。(图1新疆雪莲种子萌发生苗)

1.2、诱导子叶出丛生苗

外植体处理：挑选发芽3天后子叶展开，色绿的幼苗，于子叶柄、叶片、胚根处切开，子叶上留2mm左右的子叶柄。

丛生苗诱导培养基：MS+BA(2.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)+3％蔗糖

丛生苗诱导：25℃，光强2000lux，24h光照，3-7天后有子叶柄、叶片、根段上有数个直径1mm左右的深绿色突起出现，两周后于突起上长出丛生苗。(图2新疆雪莲的再生苗)。

1.3、试管苗的继代培养和生根诱导

苗的挑选：将健壮、高1cm左右的丛生苗分成单株，苗下端带少量愈伤组织。

苗的培养：培养基为MS+BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)，培养条件为25℃，光强2000lux，24h光照，25天继代一次。

抑制玻璃化：提高琼脂浓度到0.9-1.1％；添加活性碳0.2-0.4％。

诱根培养：培养基用1/2 MS+IAA(0.5mg/L)，24h光照，10天后雪莲再生的下端出现4-7条直径为0.5-1.5mm、长0.5-2.0cm的实生根。

实施例2：建立新疆雪莲转化体系

2.1、转化准备实验1-确定发根农杆菌菌种：

农杆菌菌种的确定：用烟草测试农杆碱型发根农杆菌LBA9402，R1601，R1000、A4的感染效果，发现R1601的毒性最强，被其感染的烟草叶片出发根所用时间最短，所诱导的发根有典型的发根形态特征(抗卡那霉素100mg/L，纤细，多根毛、向地性弱，沿瓶壁生长，斜向次生根)，而且已有同科植物青蒿、水母雪莲被R1601以90％的诱导率得到发根，因此本发明首选发根农杆菌R1601感染新疆雪莲。

2.2、转化准备实验2--确定Km筛选压

丛生苗在附加有一定浓度(50、100、150、200mg/L)Km的保持培养基中培养，4周后所有的苗都表现出黄化和生长受抑制现象，其中卡那霉素150、200mg/l可以在30天内完全杀死新疆雪莲幼苗。所以，确定100mg/l为Km筛选压浓度。

2.3、R1601工程菌液的制备

R1601工程菌液的制备：在YEB(Km100mg/l)的保持平板上，挑单菌落接种于5ml液体YEB(Km100mg/l)，于恒温摇床上29℃，180r/min培养24h，4℃保存菌液。感染前取100μl保存菌液加入5ml新鲜液体YEB(Km100mg/l)中，培养条件同上，在600nm波长下测定培养一定时间菌液的OD值，绘制该条件下R1601的生长曲线(图3R1601的生长曲线)，确定第二次活化的R1601菌液达到生长对数期所需的培养时间为9h左右。达对数生长期的R1601二次活化菌液，用液体无激素MS(pH5.8)稀释4-6倍，添加乙酰丁香酮AS(50μmol/l)和脯氨酸Pro(250mg/l)，室温诱导0.5-1h，作为工程菌液备用。

2.4、外植体预培养

外植体切段，于MS(3％蔗糖+0.5mg/l BA+2mg/l NAA)上，暗培养2-4天。

2.5、感染：

预培养后，外植体切段浸泡于备用的工程菌液3-10min。

2.6、共培养：

取出感染后的外植体，用无菌吸水纸吸去多余的菌液，放回原培养基，暗培养1-2天。

2.7、除菌：

当共培养的外植体周围出现明显菌斑时，取出外植体，用无菌水清洗4-6次，然后在液体无激素MS(附加500mg/l Cef)培养基中浸泡20-45min，其间轻微摇动。

2.8、诱导发根：

外植体除菌后，于1/2MS(30g/l蔗糖+0.5mg/l GA₃+500mg/l Cef)上，光照培养3-5天，然后进行弱光培养诱导发根，5-7天更换一次培养基。7-15天后有发根于外植体切口处出现(图4、图5发根农杆菌R1601感染雪莲外植体14天后形成的发根)。

2.9、不同发根农杆菌诱导雪莲外植体产生毛状根的频率：

通过下列表1和表2予以说明：

表1、4种发根农杆菌对茎段外植体感染的结果

	外植体数目(段)	外植体生根数(条)	感染率(％)
				对照	40	2.67	6.68
A4	40	0.67	1.68
				R1601	40	33	82.5
R1000	40	2	5
				LBA9402	40	0.33	0.83

*上述数据均为发根农杆菌开始感染后21天的统计结果，每个数据重复三次，P＜0.05

表2、R1601对叶片、茎段以及根段外植体感染产生发状根的频率

发根农杆菌	R1601对叶片、茎段以及根段外植体感染产生发状根的频率
					外植体类型	外植体数目	外植体生成发根数	形成的发根(％)
	对照	叶	50	0					0
茎					50	3	6
		根	34	0				0
R1601					叶	50	37		74
	茎	50	43	86
					根	36	35	97.2

*添加乙酰丁香酮AS(50μmol/l)和脯氨酸Pro(250mg/l)

实施例3：毛状根的筛选

切取已除菌完全的毛状根1.0-2.5cm长的根尖接入筛选培养基1/2MS(3％蔗糖+300mg/l Cef+100mg/l Km)上，弱光培养。10-12d后，切取抗Km根系的1.0-2.5cm根尖进行液体培养。

实施例4：毛状根RolB基因的PCR检测：

材料

样品：培养10代的新疆雪莲发根(Hr)；培养10代的新疆雪莲毛状根再生苗(Rp)；新疆雪莲的器官根(NR)；新疆雪莲的叶片外植体(Leaf)；R1601菌体。

试剂

1)R1601质粒提取试剂：

STE：0.1M NaCl 10MTris·Cl(pH8.0)1mMEDTA(pH8.0)；

Solution I：4mg/ml溶菌酶，50mM葡萄糖，10mM EDTA，25mMTris·Cl pH8.0；

Solution II：3％SDS，0.2mol/LnaOH；

Solution III：5MNaAc 60ml，冰乙酸11.5ml，超纯水28.5ml，pH4.8；

TE buffer：1mM EDTA，10mM Tris·Cl pH8.0；

2)雪莲基因组DNA提取试剂：

2×CTAB：2％CTAB，100Mm Tris-HCl pH8.0，1.4M NaCl，20mmEDTApH8.0，室温下放置；

Rnase：使用前，在100℃下处理10min彻底使残留的Dnase失活，用高压灭菌过的超纯水配成200μg/ml，备用。

操作

A、R1601质粒的提取：

1)挑取R1601单菌落于10mlYEB培养基中，28℃，180rpm，过夜培养。

2)吸取8ml培养好的菌液，加入10ml离心管中，4,000rpm，离心5min。倾去培养液，加入2ml预冷的STE，重新悬浮细胞。分别吸取1ml菌悬液，加入1.5mlEppendorf管中，12,000rpm离心2min，倾去培养液，获得适量的菌体细胞。

3)加入200μl冰浴过的Solution I，涡旋振荡使细胞均匀分布，室温下放置10min。

4)加入400μl新鲜配置好的Solution II，轻轻颠倒混匀，冰浴5min。

5)加入300μl Solution III，反复颠倒数次，使溶液在粘稠的菌体裂解物中分散均匀，然后置冰上5min；

6)12,000rpm离心10min，小心吸取上清液加入1.5mlEppendorf管中。

7)加入等体积的饱和酚：氯仿，通过剧烈振荡混合有机相和水相，12,000rpm离心5min。

8)小心吸取上清液加入一新的1.5mlEppendorf管中，用等体积的氯仿重新抽提一次；

9)小心吸取上清液加入一新的1.5mlEppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/LnaAC，冰浴30min，12,000rpm，离心10min；倾去上清液，倒置在吸水纸上，使溶液流尽。

10)加入1ml70％乙醇洗涤两次，12,000rpm离心5min，收集沉淀；

11)倾去洗涤液，倒置于吸水纸上吸干残余的溶液，在超净工作台上吹干。

12)加入50μlTE重悬，备用。

B、CTAB法提取新疆雪莲基因组DNA：

1)取280mg经继代培养的新疆雪莲的毛状根在液氮中充分研磨至粉状；

2)用药匙小心转移至1.5mlEppendorff管中，加入65℃预热的600μl2×CTAB，在65℃下水浴60min，每隔5-10min轻轻振荡一次；

3)取出Eppendorff管冷却至室温，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀后，12,000rpm，离心10min；

4)用一只剪去前端的枪头，小心将上清液移入一只新的Eppendorf管中，并加入两倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，即见到丝状沉淀，-20℃下放置30min，10,000rpm离心5min，得到淡黄色的沉淀；

5)倾去上清液，并用吸水纸吸净残余溶液，加入300μl超纯水重新溶解，在加入600μl-20℃预冷的无水乙醇，沉淀过夜；

6)12,000rpm，离心10min，得到白色的胶状沉淀。倾去上清液，并用吸水纸吸净残余溶液，加入800μl70％乙醇洗涤沉淀2-3次；

7)吸净残余溶液，置超净工作台中吹干(约需10-15min)；

8)加入40-60μl超纯水，溶解沉淀，加入3μlRnase，室温放置30min后，于-20℃下保存。

C、PCR检测：

PCR引物根据Slightom等RiA4baTL-DNA序列分析结果设计rol B基因的上、下游引物：

Primer1

5’TACTGCAGCAGGCTTCATGCA 3’

Primer2

25’GCTTTCCCGACCAGAGACTG 3

因为RolB基因存在于Ri质粒的TL-DNA中，而且该基因在发根农杆菌感染植物产生毛状根表型中起到关键性作用，如果能够从新疆雪莲毛状根中扩增出862bp的条带，而对照未受感染的新疆雪莲外植体中不能扩出该条带，就可以证明R1601质粒的TL-DNA已经整合在了新疆雪莲的基因组内。

1)PCR反应体系：

PCR反应体系：单位μl

10×PCR buffer：2.5

dNTP            0.5

Primer1         0.5

Primer2         0.5

Model           1

Taq酶           1U

H₂O            20

2)PCR反应条件：

1)94℃，预变性，4min；

2)94℃，热变性，1min；55℃，退火，1min；72℃，延伸，1min；35cycles；

3)72℃，延伸，5min。

3)1％琼酯糖电泳，EB染色，紫外光下摄影，结果分析：(图9PCR检测结果)

实施例5新疆雪莲毛状根的培养：

材料：选择抗Km且PCR检测显阳性的发根根系，切下长2.0-4.0cm根尖部分，于液体培养基中，进行扩大培养，初步获得Hr1和Hr2两个高产毛状根系。

培养基：液体MS培养基，如果有菌再生则加入Cef200-500mg/L。

培养条件：30ml培养基分装于100ml三角瓶，弱光或暗培养条件下，于摇床上以50-80rpm振荡培养，25天继代一次。

培养优化：蔗糖40g/L，GA₃1-1.5mg/L，有利于发状根的生长和紫丁香甙的积累，一个周期的发状根生长量(干重)为接种量时的15-20倍。液体培养的新疆雪莲发状根如图6(液体培养的高产系新疆雪莲发状根Hr)所示。

实施例6新疆雪莲毛状根再生植株的获得及培养：

切取长2-3cm的毛状根根尖，接种于附加0.5mg/L IAA的MS液体培养基，25℃、110r/m暗培养，诱导愈伤组织。切取部分愈伤组织，转接于附加1mg/L BA+0.1mg/L NAA的MS固体培养基上诱导产生丛生芽。切取丛生芽接种于附加2.0mg/L IAA的MS培养基上，诱导生根，获得再生苗(图7毛状根再生苗)。再生苗移栽至花盆中，在植物园的气候条件下，能够成活(图8毛状根再生苗移栽)。

实施例7雪莲毛状根紫丁香甙化合物的分离提取工艺(本实施例中给出了工艺条件的一个范围，在这个范围内均能够完成本发明)：

取雪莲毛状根及其再生苗的培养物，于空气循环干燥器中，40-60℃烘干。干粉以粉碎机粉碎成20-30目的粗粉物料，加入50-70％乙醇(每克物料加入乙醇5-10ml)，室温下浸取6-10小时。为保证浸取效果，可用乙醇重复浸取数次，合并浸出液，浓缩至原体积的1/3，加入1/10-1/5浓缩液体积的正丁醇萃取(正丁醇的加入量是多少？)。进一步，还可以先依次用1/10-1/5浓缩液体积的石油醚和乙醚萃取浸出液，除去浸出液中的叶绿素及脂溶性物质等杂质，再用正丁醇萃取。将正丁醇萃取液缩至小体积，用硅胶拌匀，水浴蒸干，定量转移至硅胶层析柱中。先用2倍柱体积的氯仿冲洗，洗脱液弃取，继而用3倍柱体积的氯仿∶甲醇(9∶1)洗脱，收集洗脱液，得到紫丁香甙。

取紫丁香甙，用于高压液相测定(图10HPLC分析)。粗品减压浓缩至干，残渣加入少量正丁醇溶解，放置过夜，析出晶体，晶体以95％乙醇重结晶，得到紫丁香甙精品，通过高压液相检验其纯度(晶体中紫丁香甙纯度可达90％以上)。本方法由新疆雪莲培养物的粗提品中，获得的紫丁香甙含量为毛状根干重的4-5％，为毛状根再生苗干重的3-4％，毛状根中紫丁香甙生产率为240-400mg/L/25d，毛状根再生苗中紫丁香甙生产率为360-600mg/L/25d。

Claims (11)

1、一种培养新疆雪莲毛状根和再生苗的方法，其步骤如下：

a)萌发新疆雪莲的无菌种子，取子叶柄，置于诱导丛生苗培养基上诱导培养获得丛生苗；培养基MS+BA(2.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)，25℃，光强2000lux，24小时光照；

b)丛生苗置于苗生长培养基MS+BA(1.0mg/L)+NAA(0.1/L)，25℃，光强2000lux，24小时光照，25天继代一次进行单株培养；

c)单株移置于诱根培养基(1/2MS+0.5mg/L IAA)，获得下端长有实生根的苗；

d)有实生根苗的叶片切段为外植体，置于预培养基MS+NAA(2.0mg/L)+BA(0.5mg/L)中暗培养2-4天，经发根农杆菌介导进行转化，其外植体于弱光培养诱导毛状根；

e)诱导出的毛状根接入筛选培养基1/2MS(3％蔗糖)+Cef(300mg/L)+GA₃(0.5mg/L)+Km(50mg/L)上再培养，选择抗Km且PCR检测显阳性的根系，切取根尖用液体扩大培养再生苗；

f)切取根尖接种于MS固体培养基，获得来自毛状根的再生芽；毛状根的再生芽接种于MS培养基，再生芽陆续生根最终获得毛状根的再生苗。

2.权利要求1的培养方法，其特征在于，步骤a中的子叶柄是指萌发3天苗龄的绿色子叶柄。

3.权利要求1的培养方法，其特征在于，步骤d中的发根农杆菌有R1601、R1000、LBA9402或A4。

4.权利要求1或3的培养方法，其特征在于，步骤d中的发根农杆菌是在乙酰丁香酮(As50μM)和脯氨酸(250mg/L)培养过的发根农杆菌。

5.权利要求1的培养方法，其特征在于，步骤d中的培养诱导发根是指除菌后，叶片培养于1/2MS(蔗糖30g/L)+GA₃(0.5mg/L)+Cef(500mg/L)，光照培养3-5天，然后进行弱光培养诱导发根。

6.权利要求1的培养方法，其特征在于，步骤e的毛状根液体扩大培养采用液体MS培养基，有菌再生时则加入Cef 200-500mg/L，培养优化基为蔗糖40g/L，GA₃ 1-2mg/L。

7.权利要求1的培养方法，其特征在于，步骤f的毛状根再生芽培养基为：MS固体培养基附加1mg/L BA+0.1mg/L NAA；毛状根再生芽的生根培养基为：MS培养基附加2.0mg/L IAA。

8.一种从权利要求1培养的新疆雪莲毛状根和再生苗中提取雪莲紫丁香甙的方法，主要步骤如下：

i)取雪莲毛状根及其再生苗培养物于空气循环干燥器40-60℃烘干，得到的干粉，粉碎成20-30目的物料；

ii)按每克物料加入5-10ml的比例加入浓度为50-70％的乙醇，室温下浸取6-10小时；

iii)上一步骤得到的浸取液按体积比1∶10-1∶5加入正丁醇萃取，得到紫丁香甙。

9.权利要求8的方法，其特征在于，步骤ii重复进行数次。

10.权利要求8的方法，其特征在于，步骤ii得到的浸取液按体积比1∶10-1∶5依次加入石油醚和乙醚进行萃取除杂后，再进行步骤iii。

11.权利要求8的方法，其特征在于，步骤iii得到的紫丁香甙用以下步骤进行提纯：

硅胶拌匀，水浴蒸干，转移至硅胶层析柱中，用2-3倍柱体积地洗脱液洗脱，该洗脱液按体积比为氯仿∶甲醇＝9-7∶1-3；收集洗脱液并蒸干。

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