CN1259822C - 一种培养水母雪莲毛状根生产雪莲黄酮类有效成份的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用雪莲毛状根细胞系及液体培养毛状根生产雪莲黄酮类化合物的方法，该方法涉及如下步骤：取其萌发3天苗龄的绿色子叶置于诱导丛生苗培养基上进行培养，诱导培养获得丛生苗；丛生苗置于苗生长和壮苗培养基，进行单株培养；单株移置于诱根培养基培养，获得下端长有实生根的苗；有实生根的苗的叶片切段为外植体，置于预培养培养基上暗培养，经发根农杆菌介导的进行转化，其外植体于弱光培养诱导发根，毛状根出现的叶片接入延迟筛选和筛选培养基上再培养，选择抗Km且甘露碱检测显阳性的发根根系，切取根尖1-2cm用于进行液体扩大培养，培养物用于干燥、粉碎、有机溶剂分离、提取制备雪莲黄酮类化合物。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术工程领域，具体地说涉及一种高产黄酮的雪莲毛状根的培养方法，还包括黄酮的分离、提取、制备工艺方法。
技术背景
雪莲花又名雪莲，是我国三类珍稀植物，早在《西北域记》和《相园小识》中，就有关于雪莲的记载，并把二者合而为一，统称雪莲花。作为雪莲花，原生植物名称随产地而别，如西藏等地用三指雪兔子S.tridactyla Sch.Bip.；四川、云南等地用绵头雪兔子S.lanicps Hand.-Mazz.；甘肃、青海等地用水母雪莲S.medusa Maxim；青海也用雪兔子S.gossypiphora D.Don.；新疆用天山雪莲(雪荷花)S.involucrata Kar.et Kir，等，但均属于菊科风毛菊属Saussurea雪兔子亚属Subgen Eriocorye植物，且一般分布于海拔4,000米以上的高山流石滩上。
雪莲花是生长在海拔4000米以上的高山雪线附近的民间常用的一类名贵药用植物，属多年生草本植物。雪莲花性温，味微苦，入肝、脾、肾三经。具有散寒除湿，活血通经、强筋助阳、抗炎、镇痛、收缩子宫等功能，民间用于治疗风湿性关节炎，延缓衰老、动脉硬化、终止妊娠，妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症。雪莲花原生植物种类较多，虽然据中药文献记载均可同等入药，但其品质有优劣之分。如雪兔子为大体型的雪莲，产量较大；绵头雪兔子(又称绵头雪莲花)也是一种较大体型的雪莲，产量大；水母雪兔子(又称水母雪莲花)为一种小体型的雪莲；三指雪兔子(又称三指雪莲花)也为一种小体型的雪莲。据有关报道，在以上几种雪莲中销售量最大的是新疆天山雪莲(雪荷花)S.involucrata Kar.et Kir.和水母雪莲S.medusa Maxim。
雪莲为多年生草本植物，自然生长缓慢，采集野生雪莲入药对野生资源具有严重的破坏而且还会造成对资源生态环境的破坏。为此，我国早已将雪莲列为国家三级保护植物。野生雪莲中有效成分——黄酮类化合物含量低，通常只有干重的0.7％左右。为此，迫切需要解决药用雪莲资源问题。
现代生物技术的运用使大规模生产植物次生代谢物成为可能。利用发根农杆菌诱导植物产生的毛状根具有单细胞起源性、激素自主性、生长快速性、遗传稳定性和次生代谢物高量积累性，使其成为继植物细胞发酵培养后又一种更具有优势的工业化获得某些有效成分开辟了新途径。目前，国内报道有诱导毛状根成功的中草药大约人参、西洋参、宁夏枸杞、绞股蓝、荞麦、露水草、松蓝、青蒿、长春花、何首乌、丹参、恬楼、栗米草、甘草、膜荚黄芪、银杏、龙胆、毛喉鞘蕊花、少花龙葵、紫果西番莲、桔梗、红豆草、墨旱莲、红豆杉、天山大黄、决明、天仙子、薯蓣、莨菪等23科50余种药用植物，其具体数目正不断增加。因此，通过毛状根诱导及培养技术解决雪莲资源问题是一种有效的途径，可是，由于建立一种雪莲毛状根细胞系及毛状根的培养方法有相当的难度，所以目前尚未见到有关用雪莲毛状根培养生产雪莲黄酮类化合物这方面的报道。
发明内容
为了解决雪莲毛状根细胞系及毛状根的培养技术难题和克服雪莲自然资源的匮乏和由于采集造成对自然资源的破坏，本发明的目的在于建立一种雪莲毛状根细胞系及毛状根的培养方法，从而利用培养的高产黄酮的雪莲毛状根达到产业化生产雪莲黄酮类化合物的目的。该方法步骤涉及：
1.水母雪莲转化体系及毛状根细胞系的建立：
水母雪莲的无菌种子置MS培养基萌发。取3天苗龄的绿色子叶(留2mm左右的子叶柄)置MS+BA(2.0mg/l)+NAA(0.1mg/l)培养基上，诱导培养获得丛生苗。丛生苗置MS+BA(1.0mg/l)+IAA(0.5mg/l)培养基，进行单株培养。选用MS+BA(1.0mg/l)+IAA(0.2mg/l)+CH(200mg/l)+KCI(60mg/l)培养基时能使苗更健壮。单株移置诱根培养基(1/2MS+IAA(1.0mg/l)+NAA(0.5mg/l)+KCl(60mg/l))，10天后即出现4-7条直径为0.5-1.5mm、长0.5-2.0cm的实生根。
以在MS+2，4-D(1.0mg/l)+BA(0.2mg/l)+AgNO3(1.5mg/l)中暗培养2-4天的叶片切段为外植体，经在乙酰丁香酮(As 50μmol/l)和脯氨酸(250mg/l)培养过的发根农杆菌(R1601)介导，进行转化。其外植体于1/2MS(蔗糖20mg/l)+GA3(0.5mg/l)+Cef(500mg/l)光照培养3-5天，弱光培养诱导发根。10天以后有毛状根出现的材料接入筛选培养基：1/2MS(20mg/l)+Cef(500mg/l)+Km(100mg/l)+IAA(0.5-1.0mg/l)+NAA(0.5mg/l)+GA(0.5mg/l)保持弱光培养。两周以后，切下2-5毫米的根尖接入筛选平板：1/2MS(20mg/l)+Cef(300mg/l)+KM(80mg/l)一周以后，切取抗Km根系根尖1-2cm用于进行液体扩大培养。
2.雪莲高产黄酮毛状根系悬浮液体培养生产黄酮类化合物：
选择抗Km且甘露碱检测显阳性的发根根系，切下长2.0--4.0cm根尖部分。
培养基：液体N6培养基(“朱自清等，1975中国科学，5，484-490”，)如果有菌再生则加入Cef200-500mg/L。
培养条件：40ml培养基分装于100ml三角瓶，弱光或暗培养条件下，于摇床上以50-80rpm/min震荡培养，25天继代一次。
培养优化：蔗糖30mg/L，GA3 0.5mg/L，AgNO3 0.5-1.0mg/L，有利于发状根的生长和黄酮积累，一个周期的生长量(鲜重)为接种量的10-15倍。
3.本发明的目的还在于提供一种雪莲毛状根培养物黄酮类化合物的分离、提取、制备工艺。
取雪莲毛状根培养物于空气循环干燥器60℃烘干后，以粉碎机粉碎成20目的粗粉，用有机溶剂能够得到总黄酮类化合物的分离、提取、制备，优选70％乙醇提取，或直接用新鲜的毛状根培养物浸泡于70％酒精中，进行总黄酮类的提取。本方法由毛状根培养物中得到的总黄酮类化合物的含量为毛状根干重的10-15％，总黄酮生产率为2～3g/升。
我们通过发根农杆菌R1601诱导水母雪莲得到的毛状根，在25天左右能够增殖10-25倍，干燥毛根中所测的总黄酮含量最高达毛状根干重的12％，比野生生药的0.5％有显著的提高。
因此，通过毛状根诱导及培养技术解决雪莲资源问题是一种有效的途径，可是目前尚未见到有关用毛状根培养生产雪莲黄酮类化合物这方面的报道。雪莲为国家保护植物，利用植物毛状根大量培养生产雪莲黄酮类化合物，走工业化生产的途径，可保护有限的野生资源，保护生态环境。
本发明与已有技术相比具有如下优点及积极效果：
(1)应用雪莲毛状根大量培养生产雪莲黄酮类化合物与栽培和野生的植物相比，可获得稳定的质量和产量，不受自然条件的限制的影响。
(2)不占用耕地面积，只需要占用有限的厂房和培养室。
(3)通过人工调节与控制毛状根的生长和次生产物的合成；可极大地提高黄酮类化合物的产量
(4)该项技术，不使用光照，在暗中进行毛状根培养，故可节省电力，减少成本价格。产量与含量稳定，污染率极低。
附图说明
图1水母雪莲的再生苗
图2R1601第二次活化生长曲线注：第2次活化接种按2％加入4℃下的保存菌液
图3发根农杆菌R1601感染16天后形成的发根
图4水母雪莲发根中甘露碱纸层析检测
图5液体培养的水母雪莲发状根
具体实施方案
为了更好理解本发明，通过如下实施例予以进一步说明，但并非是对本发明的限定。
实施例中涉及的缩写术语、培养基：
1外植体-水母雪莲的无菌试管苗新展开叶片，切开成1.0cm2片段
2发根农杆菌菌种-R1000，R1601，LBA9402(发根农杆菌LBA9402为野生型，由清华大学郭志钢教授惠赠；R1000为野生型，R1601是R1000的人工改造菌株，涉及的改造为：第一、农杆碱型pRiA4质粒的TL--DNA上插入新霉素磷酸转移霉基因(nptII)，转基因细胞可以用卡那霉素筛选；第二引入高毒力Ti质粒pTiBo542的vir区域，提高了R1601的感染效率。北京大学林忠平教授赠送R1601，R1000.)。
3发根农杆菌培养基：YEB、YMB、LB
4植物基本培养基：MS(Murashige and Skoog，1962)
5抗生素：卡那霉素Km(kanamycin)、头胞霉素Cef(cephamycin)
6激素：2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid)、BA(benzyladenine)、GA3(gibberellic acid)IAA(Indoleacetic acid)，NAA(Naphthaleneacetic acid)
7其他试剂：乙酰丁香酮AS(3，5-methoxy-4-hydroxyacetophenone)、水解酪蛋白(CH)、脯氨酸Pro(proline)、甘氨酸Gly(glycin)
8标准品：甘露碱Man(mannopine)、精氨酸Arg(Arginine)
实施例1
1.建立水母雪莲高频再生体系
1.1种子消毒处理
种子来源：2001年于祁连山采摘的水母雪莲(S.medusa Maxim)干品，从花序中剥得种子
清洗：挑选健康饱满，无霉变的种子，自来水冲洗4遍，室温浸泡过夜，流水冲洗1h。
消毒：70％乙醇浸泡30s，0.01％升汞作用10---14min，无菌水清洗4-6次。
无菌种子培养：用无激素MS培养基，0.6％琼脂。25℃，光强2000lux，连续光照，3天后种子陆续萌发。
1.2诱导子叶出丛生苗
外植体处理：挑选发芽3天后子叶展开，色绿的幼苗，于子叶柄处切开，子叶上留2mm左右的子叶柄。
诱导丛生苗培养基：MS+BA(2.0mg/l)+NAA(0.1mg/l)
培养：25℃，光强2000lux，16h光照，3-7天后有子叶柄上有数个直径1mm左右的深绿色突起出现，两周后于突起上长出丛生苗(图1水母雪莲的再生苗)。
1.3试管苗的继代培养和诱导生根
苗的挑选：把健壮、高1cm左右的丛生苗分成单株，苗下端带少量愈伤组织。
苗的培养：培养基为MS+BA(1.0mg/l)+IAA(0.5mg/l)，培养条件为25℃，光强2000lux，16h光照，20天继代一次。
壮苗培养：培养基为MS+BA(1.0mg/l)+IAA(0.2mg/l)+水解酪蛋白(200mg/l)+KCI(60mg/l)，培养条件同上。
抑制玻璃化：提高琼脂浓度到0.9-1.1％；添加活性碳0.2-0.4％；延长光照到19h。
诱根培养：培养基用1/2MS+IAA(0.5mg/l)+NAA(0.5mg/l)+KCl(30mg/l)，16h光照，10天后插入培养基的苗下端出现4-7条直径为0.5-1.5mm、长0.5-2.0cm的实生根。
实施例2：建立水母雪莲转化体系
2.1转化准备实验1-确定发根农杆菌菌种：
农杆菌菌种的确定：用烟草测试发根农杆菌LBA9402，R1601，R1000的感染效果，发现R1601的毒性最强，被其感染的烟草叶片出发根所用时间最短，所诱导的发根有典型的发根形态特征(抗卡那霉素50mg/l，纤细，多根毛、向地性弱，沿瓶壁生长，斜向次生根)，而且已有同科植物青蒿被R1601以90％的频率诱导得到发根，因此我们确定使用发根农杆菌R1601感染水母雪莲。
2..3转化准备实验2--确定Km筛选压
丛生苗在附加有一定浓度(20，40，60，80，100mg/l)Km的保持培养基中培养，4周后所有的苗都表现出黄化和生长受抑制现象，其中卡那霉素60mg/l可以在30天1内完全杀死水母雪莲幼苗。所以，确定50mg/l为Km筛选压浓度。
2.4R1601工程菌液的制备
R1601工程菌液的制备：在YEB(Km100mg/l)的保持平板上挑单菌落接种于5ml液体YEB(Km100mg/l)，于恒温摇床上29℃，180r/min培养24h，4℃保存菌液。感染前取100μl保存菌液加入5ml新鲜液体YEB(Km100mg/l)中，培养条件同上，在600nm波长下测定培养一定时间菌液的OD值，做该条件下R1601的生长曲线(图2)，确定第二次活化的R1601菌液达到生长对数期所需的培养时间为9h左右。达对数生长期的R1601二次活化菌液用液体无激素MS(PH5.2)稀释数倍，添加乙酰丁香酮AS(50μmol/l)和脯氨酸Pro(250mg/l)，室温诱导0.5-1h，作为工程菌液备用。
2.5外植体预培养
叶片切段培养于MS+2，4-D(1.0mg/l)+BA(0.2mg/l)+AgNO3(0.5mg/l)，暗培养2-4天。
2.6感染：
预培养后叶片切段浸泡于备用的工程菌液3-10min。
2.7共培养：
取出感染后的叶片用无菌吸水纸吸去多余的菌液，放回原培养基，暗培养1-2天。
2.8除菌：
当共培养的叶片周围出现明显菌斑时取出叶片用无菌水清洗4-6次，然后用液体无激素MS+Cef(500mg/l)培养基浸泡20-45min，其间轻微摇动。
2.9诱导发根：
除菌后叶片培养于1/2MS(蔗糖20mg/l)+GA3(0.5mg/l)+Cef(500mg/l)，光照培养3-5天，然后进行弱光培养诱导发根，5-7天更换一次培养基。7-15天后有发根于叶片切口处出现(图3发根农杆菌R1601感染16天后形成的发根)。
实施例3毛状根的筛选
延迟筛选：把长出发根的叶片接入延迟筛选培养基1/2MS(20mg/)+Cef(500mg/l)++IAA(0.5-1.0mg/l)+NAA(0.5mg/l)+GA3(0.5mg/l)，保持弱光培养5-8天，以促进发根的诱导和生长。
Km筛选：切下所有根的1.0---2.5cm长的根尖接入筛选培养基1/2MS(20mg/l)+Cef(300mg/l)+Km(50mg/l)，弱光培养，10天以后切取抗Km根系的1.0-2.5cm根尖进行液体培养。
实施例4毛状根的检测
4.1甘露碱的纸层析检测
一、材料
样品：新诱导出的水母雪莲发根(NTR)；经过继代培养的发根(TR)；水母雪莲的器官根(NR)、叶片或愈伤细胞(L/C)；R1601菌液(AR)
二、试剂
1.提取液：0.1M HCl
2.标准品：精氨酸Arg水溶液(1mg/ml)；甘露碱Man水溶液(1mg/ml)
3.展展层系统：正丁醇∶乙酸∶水＝9∶2∶5
4.显色液：
1)0.2％AgNO3丙酮液1％NaOH甲醇液5％硫代硫酸钠(Na2S2O3.5H2O)水溶液操作
1、农杆碱的提取：取1g样品加1ml0.1N HCl研磨，12,000rpm 5min，取上清液10μl点样
2、层析
1)层析滤纸的制备：将层析滤纸裁成8×8(cm×cm)规格，浸泡于0.4M HCl溶液中24h，然后用蒸馏水淋洗，再依次用乙醇、乙醚洗涤后，平放在托盘上，30℃下凉干，备用。
2)样品点样：距边1-1.5cm处划一直线，铅笔标记出等距离的点样点。以微量进样器点上5μl样品，边滴加边吹干。
3)层析展开：干燥滤纸垂直置入密闭的已饱和层析罐，待液体上限距上边缘2-4cm时取出。
3、显色：
将滤纸吹干后，浸入0.2％AgNO3丙酮液1min，取出风干；然后浸入1％NaOH甲醇液，2～3min；最后5％硫代硫酸钠液固定；观察并摄影(图4)。
实施例5水母雪莲毛状根的培养
材料：选择抗Km且甘露碱检测显阳性的发根根系，切下长2.0--4.0cm根尖部分。
培养基：液体N6培养基，如果有菌再生则加入Cef200-500mg/L。
培养条件：40ml培养基分装于100ml三角瓶，弱光或暗培养条件下，于摇床上以50-80rpm/min震荡培养，25天继代一次。
培养优化：蔗糖30mg/L，GA3 0.5mg/L，AgNO3 0.5-1.0mg/L，有利于发状根的生长和黄酮积累，一个周期的发状根生长量(鲜重)为接种量时的10-15倍。液体培养的水母雪莲发状根如(图5)所示。
实施例6雪莲毛状根黄酮类化合物的分离提取工艺：
取雪莲毛状根培养物于空气循环干燥器60℃烘干，干粉以粉碎机粉碎成20目的粗粉，用70％乙醇提取，或直接用70％酒精浸泡提取新鲜的毛状根培养物，得到总黄酮类的化合物，本方法由毛状根培养物中得到的总黄酮类化合物的含量为毛状根干重的10-15％，总黄酮生产率为2～3g/升。
Claims (7)
1.一种利用培育雪莲毛状根系及液体培养毛状根生产雪莲黄酮类化合物的方法，该方法具有如下步骤：
萌发水母雪莲的无菌种子，取其萌发3天苗龄的绿色子叶置于诱导丛生苗培养基上进行培养，诱导培养获得丛生苗；丛生苗置于苗生长和壮苗培养基，进行单株培养；单株移置于诱根培养基培养，获得下端长有实生根的苗；
有实生根苗的叶片切段为外植体，置于预培养培养基上暗培养，经发根农杆菌介导的进行转化，其外植体于弱光培养诱导发根，毛状根出现的叶片接入延迟筛选和筛选培养基上再培养，选择抗Km且甘露碱检测显阳性的发根根系，切取根尖1-2cm用于进行液体扩大培养，培养物用于分离、提取制备雪莲黄酮类化合物，
其中所述的诱导丛生苗培养基为：MS、2.0mg/l BA和0.1mg/l NAA；
所述的苗生长培养基为：MS、1.0mg/l BA和0.5mg/l IAA；
所述的壮苗培养基为：MS、1.0mg/l BA、0.2mg/l IAA、200mg/l水解酪蛋白和60mg/l KCl；
所述的诱根培养基培养为：1/2MS、1.0mg/l IAA、0.5mg/l NAA和60mg/l KCl；
所述的预培养培养基为：MS、1.0mg/l 2，4-D、0.2mg/l BA和0.5mg/lAgNO3；
所述的诱导发根的培养基为：蔗糖20mg/l的1/2MS、0.5mg/l的GA3和500mg/l Cef；
所述的延迟筛选培养基为：蔗糖20mg/l的1/2MS、500mg/l Cef、0.5-1.0mg/l IAA、0.5mg/l NAA和0.5mg/l GA3，筛选培养基为：蔗糖20mg/l的1/2MS、300mg/l Cef和50mg/l Km；
所述的毛状根液体扩大培养采用液体N6培养基，有菌再生则加入200-500mg/L Cef，培养优化采用：蔗糖30mg/L，GA30.5mg/L，AgNO30.5-1.0mg/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的诱导丛生苗培养基培养是在25℃，光强2000lux，16h光照下培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的苗生长培养基是在25℃，光强2000lux，16h光照下进行单株培养，20天继代一次。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的诱根培养基培养是用诱根培养基，经10天后即出现4-7条直径为0.5-1.5mm、长0.5-2.0cm的实生根。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的发根农杆菌介导的进行转化是指在预培养培养基中暗培养2-4天的叶片切段为外植体，经在50μmol/l乙酰丁香酮和250mg/l脯氨酸培养过的发根农杆菌介导，进行转化。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的培养诱导发根是指除菌后，叶片培养于诱导发根的培养基，光照培养3-5天，然后进行弱光培养诱导发根。
7.根据权利要求1所述的方法，将培养物用于干燥、粉碎、有机溶剂分离提取制备工艺如下：
取雪莲毛状根培养物于空气循环干燥器60℃烘干，干粉以粉碎机粉碎成20目的粗粉，用70％酒精分离、提取、制备总黄酮类化合物，本方法由毛状根培养物中得到的总黄酮类化合物的含量为毛状根干重的10-15％，总黄酮生产率为2～3g/l。
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