CN109906941B - 一种金铁锁不定根悬浮培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金铁锁不定根悬浮培养的方法，该方法包括如下步骤：(1)金铁锁无菌苗的诱导；(2)金铁锁的不定根诱导培养；(3)金铁锁的不定根悬浮培养。与现有技术相比较，本发明仅选用少量激素简单配比且取得较好效果，简化了培养基成分，以嫩茎直接诱导生成不定根；简化中间诱导愈伤组织的步骤，过程更简单，操作更简便，效率更高；通过组织培养手段，建立了简便、安全、高效的金铁锁不定根培养技术体系，为不定根由摇瓶放大到生物反应器的培养提供技术参数，也为将来通过组织培养技术规模化生产金铁锁皂苷建立新的途径。适用于珍稀药物资源金铁锁的培养。

Description

一种金铁锁不定根悬浮培养的方法

技术领域

本发明涉及通过组织培养技术繁殖植物的方法，具体而言，涉及珍稀植物资源金铁锁不定根悬浮培养的方法。

技术背景

金铁锁(拉丁学名：Psammosilene tunicoides)别名：昆明沙参、独钉子、土人参、金丝矮坨坨、独定子、金丝矮陀陀、对叶七、白马分鬃、独鹿角姜、百步穿杨、穿石甲、蜈蚣七，石竹科金铁锁属稀有物种。为中国特有的单种属植物，分布于四川、贵州及云南、西藏等地。它是研究石竹科系统分类和进化极宝贵的材料、珍稀植物，又是常用中药材。

当前，采用“毛状根”、“不定根”等生物技术定向培养植物细胞或器官来获取次生代谢产物，是珍稀濒危药用植物资源可持续开发利用研究的热点和有效途径。如王颖芳等发现发根农杆菌诱导南方红豆杉产生的毛状根中可产生紫杉醇，可作为紫杉醇的主要来源；刘峻等研究人参毛状根时发现，人参总皂苷含量是原药材的1.7倍；步怀宇等研究发现，滇黄芩毛状根中黄芩苷是原药材的7.18倍。金铁锁“毛状根”培养也有少量报道。李景滨等利用发根农杆菌成功诱导金铁锁产生毛状根，并发现金铁锁毛状根生物量增加了14.11倍，总皂苷是原植物的4倍。虽然通过毛状根培养技术能明显提高金铁锁总皂苷含量，但目前的研究还处于初级阶段，且存在转基因不明成分的风险。金铁锁不定根培养技术与毛状根不同，不定根不仅有生长速率快、遗传稳定、激素自养等特点，最重要的是它不需要发根农杆菌诱导，直接通过调节培养基激素种类或配比，通过组织培养就能诱导产生，不存在转基因问题。

中国专利数据库中，已有一些涉及通过组织培养金铁锁的方法，例如：CN102057868号《一种金铁锁毛状根系的诱导与培养方法》、 CN102771397号《一种金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法》、 CN104845929号《金铁锁悬浮细胞培养体系及其建立方法》、CN105432472 号《一种金铁锁不定根快速增殖培养的方法》等。这些技术方案还处于初级阶段，且存在转基因不明成分的风险。

发明内容

本发明旨在提供一种金铁锁不定根悬浮培养的方法，以解决金铁锁资源紧缺、市场供需矛盾突出的问题，同时为珍稀植物资源金铁锁的保护和可持续利用提供技术支撑。

发明人提供的金铁锁不定根悬浮培养的方法，包括以下步骤：

(1)金铁锁无菌苗的诱导

选取饱满、健壮的金铁锁种子，经自来水冲洗干净后用高锰酸钾溶液浸泡，然后用自来水冲洗干净，之后用升汞处理，无菌水冲洗，用无菌滤纸吸去表面水分后，接种于添加了赤霉素的1/2MS培养基培养，待子叶展开时，得到金铁锁无菌苗，备用；

(2)金铁锁的不定根诱导培养

在无菌条件下，将金铁锁无菌苗嫩茎切成1cm左右长度，接种于含有不同激素的培养基中，进行不定根诱导培养；

(3)金铁锁的不定根悬浮培养

在无菌条件下，将上一步的金铁锁不定根按块状方式切取不定根丛，在装有液体培养基的瓶中进行悬浮培养，即得到大量不定根，用于皂苷提取与检测。

上述第(1)步中，所述金铁锁种子的浸泡时间为30min；所述自来水洗净的金铁锁种子用升汞处理的时间为8～10min；所述无菌水冲洗的次数为3～5遍；所述添加赤霉素的1/2MS培养基培养条件是在25℃±1℃下，暗培养5～7天。

上述第(2)步中，所述基本培养基是用1/2MS培养基附加30g/L蔗糖，12g/L琼脂，1g/L活性炭，1g/L PVP(聚乙烯吡咯烷酮)组成的；所述不定根诱导培养是在24℃和12h/d光照周期下进行的；所述瓶中培养时，每瓶接种嫩茎为4个。

上述第(3)步中，所述金铁锁不定根按每块约0.05g的块状切取；所述液体培养基的组成为：2/1MS+蔗糖30g·L^-1+IBA(吲哚丁酸)1.0 mg·L^-1+NAA(α-萘乙酸)0.12mg·L^-1；所述每瓶中液体培养基体积为40mL；所述培养时间为5～8周。

本发明的创新点：

当前金铁锁资源利用多以野生资源为主，人工栽培利用采用种子繁殖。本发明仅选用少量激素简单配比且取得较好效果，简化了培养基成分，以嫩茎直接诱导生成不定根，相比较现有技术，本发明简化中间诱导愈伤组织的步骤，过程更简单，操作更简便，效率更高；本发明通过组织培养手段，建立了简便、安全、高效的金铁锁不定根培养技术体系，为不定根由摇瓶放大到生物反应器的培养提供技术参数，也为将来通过组织培养技术规模化生产金铁锁皂苷建立新的途径。

附图说明

图1为金铁锁不定根悬浮培养生长曲线。

具体实施方式

为筛选出激素配比、培养条件等关键技术参数，建立简便、安全、高效的金铁锁不定根悬浮培养技术方案，同时为不定根由摇瓶放大到生物反应器的培养提供基本参数，发明人进行了以下试验：

实施例1基本参数的筛选试验

1.1无菌苗诱导

将饱满、健壮的金铁锁种子经自来水冲洗干净后用高锰酸钾溶液浸泡30min左右，然后用自来水冲洗干净，在超净工作台上用升汞处理8～ 10min，无菌水冲洗3～5遍，用无菌滤纸吸去表面水分后，接种于添加了不同浓度赤霉素的1/2MS培养基培养，以不添加任何激素的1/2MS培养基作为对照，在25℃±1℃下，暗培养5～7天，待子叶展开时备用，并计算种子萌发率，筛选出种子萌发的最佳培养基。

1.2不定根诱导培养基筛选

在无菌条件下，将金铁锁无菌苗嫩茎切成1cm左右长度，选用1/2MS 培养基附加30g/L蔗糖，12g/L琼脂，1g/L活性炭，1g/L PVP(聚乙烯吡咯烷酮)为基本培养基，考察不同浓度水平的NAA(α-萘乙酸)和IBA(吲哚丁酸)对不定根诱导效果的影响。每瓶接种4个嫩茎，每个处理10瓶，在24℃和12h/d光照周期下进行不定根诱导培养，以不添加任何激素的 1/2MS培养基作为对照。

1.3不定根悬浮培养基筛选

以金铁锁不定根最佳固体培养培养基配比、激素配比、培养条件为基本参数，选用1/2MS培养基为基本培养基，考察不同浓度蔗糖、NAA(α -萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)及其组合对不定根悬浮培养效果的影响。在无菌条件下，按块状方式切取金铁锁不定根丛进行培养，每块约0.05g，每瓶中液体培养基体积为40mL，每个处理10瓶，以不添加任何激素的 1/2MS液体培养基作为对照，遮光摇床振荡培养，同时设立不遮光对照， 30天后滤干培养液后用分析天平称量鲜重。试验因素水平见表1。

表1 不定根悬浮培养基筛选的试验因素水平

1.4不定根生长曲线测定

在上述筛选得到的最适培养基上按同样方法接种不定根，每隔1周测定一次平均瓶根重，共统计7周，测定不定根生长曲线。

1.5不定根皂苷含量检测

最新药理学研究表明，皂皮酸具有镇痛和抗炎作用，与金铁锁现代研究的药理活性相似。金铁锁苷类成分结构复杂，分离难度大，对照品尚未能商品化获得，因此，本实验皂苷含量测定以水解后的皂皮酸苷元作为金铁锁皂苷含量的评价指标。检测如下：

Agilent 1260型高效液相色谱仪。参考文献并经反复试验确定色谱分析条件为:色谱柱ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；柱温30℃；流动相为乙腈-水；(B)系统，梯度洗脱(0～30min，50％A→95％A，30～ 45min，95％A→50％A)，流速1mL·min^-1；进样量为10μL；紫外检测波长 210nm。精密称取皂皮酸对照品适量，加甲醇稀释成1mL含皂皮酸1.049mg 的对照品溶液，备用。精密吸取对照品溶液1，4，5，10，15，20μL进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积(Y)对进样量进行线性回归，得回归方程为Y＝68027.4794X-5.2969938，r＝0.99976，进样量在 1.049～20.98μg呈良好的线性关系。

取5个不同处理悬浮培养7周的不定根和金铁锁药材，烘干，研碎，粉末过60目筛。精密称取不同处理样品粉末2.5g，加80％乙醇回流提取 2次，每次50mL，每次回流2h，合并滤液，挥干溶剂，残渣加100ml蒸馏水溶解，并用水饱和正丁醇溶液振摇提取3次，每次100mL，合并正丁醇溶液振摇3次，合并正丁醇溶液后用旋转蒸发仪减压浓缩至干膏，残渣加入2mol·L^-1硫酸甲醇溶液30mL使溶解，60℃水浴中水解1h。密塞立即冷却至室温，精密吸取水解溶液10mL，置于50mL量瓶中，加蒸馏水溶解至刻度，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次50mL，合并乙酸乙酯，因乙酸乙酯层会有少量的酸，挥去溶剂时若温度高会发生碳化，因此常温下挥去溶剂，最后用2mL色谱甲醇溶解，取续滤液过0.45μm微孔滤膜得样品溶液，待测。按上述色谱条件进样，测定峰面积，再按回归方程即可计算不定根中皂皮酸含量。

实施例2结果与分析

2.1种子萌发培养基筛选

将消毒处理后的金铁锁种子接种到含不同浓度赤霉素的1/2MS培养基培养，每天观察记录种子发芽情况，以种子胚根伸长与种子等长记作发芽，30d统计发芽率，3次重复，发芽率(％)＝(发芽种子数/供试种子数)×100％。由表2可以看出，在0.01～0.08mg/mL的赤霉素浓度范围内，金铁锁种子发芽率都在80％以上，但随着赤霉素浓度升高，萌发率不断提高，在赤霉素浓度为0.08mg/mL时萌发率达到最大。此外，金铁锁种子在含有赤霉素的培养基中培养第5天就开始萌发，而对照要到接种后的第10天才开始发芽，说明赤霉素能促进金铁锁种子提前发芽。

表2 NAA对无菌苗诱导不定根的影响

2.2不定根诱导培养基的筛选

以无菌苗为试验材料，取其幼嫩茎段切成1cm左右作为外植体，分别考察不同浓度的NAA和IBA对不定根诱导的影响。NAA和IBA分别设 0.05，0.1，0.3，0.5mg/L 4个浓度，结果见表3、表4。结果表明，IBA 对诱导不定根的分化和生长起着关键作用。当IBA浓度为0.1mg/L时，不定芽14d后就形成不定根并快速生长，而在平衡浓度也会产生愈伤组织，说明高浓度IBA有利于愈伤组织的形成。可见，金铁锁组培苗不定根诱导的最佳培养基为1/2MS+IBA0.1mg/L。

表3 NAA对无菌苗诱导不定根的影响

表4 IBA对无菌苗诱导不定根的影响

2.3不定根悬浮培养体系筛选

以金铁锁不定根最佳固体培养基配比、激素配比、培养条件为基本参数，选择蔗糖、α-萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)三个因素设计试验，考察其对不定根悬浮培养效果的影响。以30天后测定不同处理的平均根鲜重为考察指标，结果见表5，6。

表5 金铁锁不定根悬浮培养诱导结果

组别	蔗糖	IBA	NAA	根重
					1	20	0.1	0.1	1.12
2	20	0.5	0.5	1.35
					3	20	1.0	1.0	1.44
4	30	0.1	0.5	1.56
					5	30	0.5	1.0	1.87
6	30	1.0	0.1	2.06
					7	40	0.1	1.0	1.25
8	40	0.5	0.5	1.43
					9	40	1.0	0.1	1.61

正交试验分析结果表明，3个因素在试验浓度范围内对不定根生长的影响次序为蔗糖＞IBA＞NAA。方差分析结果表明，蔗糖对培养效果影响显著(F 96.977)；IBA对不定根生长也有显著影响(F44.537)；而NAA对不定根生长影响较小(F 1.319)，见表3-6。蔗糖从20g·L^-1L ^－1增加到30g·L^-1能够大幅度提高根重。但蔗糖含量进一步提高到40 g·L^-1，发现对培养存在一定的抑制作用，根生长量反而减少。因此，悬浮培养中蔗糖浓度选择30g·L^-1较为合理。在本试验中，高浓度的 IBA(1.0mg·L^-1)显著促进不定根的生长和分枝形成。悬浮培养效果最好的因素组合为2/1MS+蔗糖30g·L^-1+IBA 1.0mg·L^-1+NAA 0.12mg·L^-1。同时，通过对照试验发现，在光照条件下，虽然不定根也能生长，但是生长缓慢，并且没有形成分枝，继续培养后逐渐褐化死亡。因此，不定根的悬浮培养应该选择暗培养。

表6 金铁锁不定根悬浮培养的方差分析

2.4不定根生长曲线测定

金铁锁不定根的悬浮培养呈S型生长曲线。除第1周外，金铁锁不定根在最初3周形成分枝不多，但能够不断快速伸长，随后便进入快速生长期，大量侧枝形成，第6周后由于养分大量消耗而生长逐渐变慢，到第8周时培养物开始褐化，到第9周开始死亡。

2.5不定根皂苷含量检测

按已确定的色谱条件进样，测得不同处理悬浮培养基培养根样品中的皂皮酸质量分数为分别为0.25％、0.21％、0.23％、0.18％、0.16％、0.09％，保留时间为12.36min。金铁锁药材不同处理的皂皮酸含量差异不大，平均值为0.206％，大约是金铁锁原药材的2倍多。

试验结果表明，金铁锁种子在赤霉素浓度为0.08mg/mL时萌发率达到最大，且幼苗长势好，健壮质量高；取生长健壮的组培苗移1/2MS +IBA0.1mg/L培养基中诱导不定根，生根率高达95％，长势良好。

Claims (1)

1.一种金铁锁不定根悬浮培养的方法，其特征包括以下步骤：

(1) 金铁锁无菌苗的诱导

选取饱满、健壮的金铁锁种子，经自来水冲洗干净后用高锰酸钾溶液浸泡，然后用自来水冲洗干净，之后用升汞处理，无菌水冲洗；用无菌滤纸吸去表面水分后，接种于添加了赤霉素的1/2 MS培养基培养，待子叶展开时，得到金铁锁无菌苗，备用；

(2) 金铁锁的不定根诱导培养

在无菌条件下，将金铁锁无菌苗嫩茎切成1cm左右长度，在装有培养基的瓶中接种嫩茎，进行不定根诱导培养；

(3) 金铁锁的不定根悬浮培养

在无菌条件下，将上一步的金铁锁不定根按块状方式切取不定根丛，在装有液体培养基的瓶中进行悬浮培养，即得到大量不定根，用于皂苷提取检测；

第(1)步中，所述金铁锁种子的浸泡时间为30min；所述自来水洗净的金铁锁种子用升汞处理的时间为8～10min；所述无菌水冲洗的次数为3～5遍；所述培养的培养条件是在25℃±1℃下，暗培养5～7天；

第(2)步中，所述培养基是用1/2MS培养基附加30g/L蔗糖，12g/L琼脂，1g/L活性炭，1g/L PVP、0.1mg/L 的IBA组成的；所述不定根诱导培养是在24℃和12h/d光照周期下进行的；所述瓶中培养时，每瓶接种嫩茎为4个；

第(3)步中，所述金铁锁不定根按每块约0.05 g的块状切取；所述液体培养基的组成为：1/2MS +蔗糖 30 g/L+ IBA 1.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L；每瓶中液体培养基体积为40mL；所述培养时间为5～8周。

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