CN102057868A - 一种金铁锁毛状根系的诱导与培养方法 - Google Patents
一种金铁锁毛状根系的诱导与培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102057868A CN102057868A CN2009102375792A CN200910237579A CN102057868A CN 102057868 A CN102057868 A CN 102057868A CN 2009102375792 A CN2009102375792 A CN 2009102375792A CN 200910237579 A CN200910237579 A CN 200910237579A CN 102057868 A CN102057868 A CN 102057868A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- root
- culture medium
- tuniclike psammosilene
- medium
- callus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241001534096 Psammosilene tunicoides Species 0.000 title abstract description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 title abstract description 5
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title abstract 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 89
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 72
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 62
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims abstract description 47
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 28
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 claims abstract description 25
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 241001533947 Psammosilene Species 0.000 claims description 74
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 42
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 39
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 35
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 27
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 22
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 22
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 21
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 claims description 17
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 13
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 12
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 12
- 229960002727 cefotaxime sodium Drugs 0.000 claims description 11
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 claims description 11
- 229960002523 mercuric chloride Drugs 0.000 claims description 9
- LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L mercury dichloride Chemical compound Cl[Hg]Cl LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 229920006284 nylon film Polymers 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150013395 ROLC gene Proteins 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- BDKZHNJTLHOSDW-UHFFFAOYSA-N [Na].CC(O)=O Chemical compound [Na].CC(O)=O BDKZHNJTLHOSDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- 239000009306 yunnan baiyao Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RKUNBYITZUJHSG-FXUDXRNXSA-N (S)-atropine Chemical compound C1([C@@H](CO)C(=O)O[C@H]2C[C@H]3CC[C@@H](C2)N3C)=CC=CC=C1 RKUNBYITZUJHSG-FXUDXRNXSA-N 0.000 description 1
- OQUFOZNPBIIJTN-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;sodium Chemical compound [Na].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O OQUFOZNPBIIJTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001405 Artemisia annua Nutrition 0.000 description 1
- 240000000011 Artemisia annua Species 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 241000219321 Caryophyllaceae Species 0.000 description 1
- 241000063328 Cyanotis arachnoidea Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241001518935 Eragrostis Species 0.000 description 1
- 206010017553 Furuncle Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- RKUNBYITZUJHSG-UHFFFAOYSA-N Hyosciamin-hydrochlorid Natural products CN1C(C2)CCC1CC2OC(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 RKUNBYITZUJHSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208278 Hyoscyamus Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- STECJAGHUSJQJN-USLFZFAMSA-N LSM-4015 Chemical compound C1([C@@H](CO)C(=O)OC2C[C@@H]3N([C@H](C2)[C@@H]2[C@H]3O2)C)=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-USLFZFAMSA-N 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LOUPRKONTZGTKE-WZBLMQSHSA-N Quinine Chemical compound C([C@H]([C@H](C1)C=C)C2)C[N@@]1[C@@H]2[C@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-WZBLMQSHSA-N 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 206010053476 Traumatic haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 235000009818 Trichosanthes kirilowii Nutrition 0.000 description 1
- 240000006023 Trichosanthes kirilowii Species 0.000 description 1
- 108010021119 Trichosanthin Proteins 0.000 description 1
- ICMGLRUYEQNHPF-UHFFFAOYSA-N Uraprene Chemical compound COC1=CC=CC=C1N1CCN(CCCNC=2N(C(=O)N(C)C(=O)C=2)C)CC1 ICMGLRUYEQNHPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005071 geotropism Effects 0.000 description 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 1
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229930005342 hyoscyamine Natural products 0.000 description 1
- 229960003210 hyoscyamine Drugs 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229930002341 quinoline alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 1
- 238000007665 sagging Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229930004668 tropane alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 229960001130 urapidil Drugs 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开一种金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，该诱导与培养方法为：取金铁锁幼嫩茎为外植体进行脱分化处理，获得新鲜金铁锁愈伤组织，将愈伤组织与含有Ri质粒的发根农杆菌(ACCC10060，保藏单位缩写和菌种编号)共培养，以无菌纸吸取多余菌液后转入到诱导培养基中诱导培养，在金铁锁愈伤组织处生长出金铁锁毛状根；抑菌培养后将具有毛状根的外植体放入扩增培养基中进行毛状根的扩大培养。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用生物技术诱导与培养毛状根系的方法，特别设计一种金铁锁状根系的诱导与培养方法。
背景技术
金铁锁是石竹科金铁锁属单种属植物(Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu)，为西南地区特有植物、民间常用草药。其根入药，常用于跌扑损伤、风湿痹痛、胃寒痛、疮疖、创伤出血。是我国中成药保密品种“云南白药”的重要成分之一，也是多种知名中成药的主要成份，如云南白药系列、云南红药胶囊、贵州金骨莲胶囊、福建痛血康胶囊等。近年来随其药用需求量的不断增加，加上自然环境因素和人为作用，使金铁锁资源数量急剧下降，目前已作为珍稀濒危物种列入《中国植物红皮书》中，属于国家二级重点保护植物。
随着生物工程技术的发展，利用发根农杆菌诱导药用植物产生毛状根，并对毛状根进行离体扩增培养，可以快速大量的提取植物体中有效化学成分，也是进行药用植物资源可持续发展的有效途径之一。由于毛状根具有生长速度快、分枝多、弱向地性，处于器官化水平，激素自养，生理生化、遗传特征稳定，有稳定的次生代谢物质合成能力，并且毛状根培养不受环境、生态、气候等条件的限制。因此，利用毛状根培养技术标准化生产金铁锁替代野生资源，不但可以缓解日益增长的市场需求，而且有利于保护、抢救和挖掘民族药，解决日益严重的生态环保问题，也将会大大促进金铁锁等民族药的现代化发展。因此，建立金铁锁毛状根培养系统大量生产金铁锁替代原材料具有重要意义
目前，用发根农杆菌诱导形成的植物毛状根涉及到31科100余种双子叶植物，而露水草(Cyanotis arachnoidea C.B.Clarke)是迄今单子叶植物中毛状根诱导成功的唯一例子。毛状根培养与传统栽培获得中草药原材料相比具有如下优点：(1)毛状根中染色体和次生代谢产物的生物合成相对稳定；(2)毛状根不仅生长速度快，而且次生代谢产物含量高，(3)不受病虫害、地理和季节等各种环境因素的影响；(4)所获得的产物可从培养体系内直接提取，并快速、高效的回收与利用，简化了分离与纯化的步骤；(5)有利于细胞筛选、生物转化，合成新的有效成分；(6)有利于研究植物的代谢途径，还可以利用某些基因工程手段探索与创造新的合成路线，得到价值更高的产品；(7)节省大量用于种植原料的农田。正是由于毛状根的上述优点，为其工业化、规模化生产优质中草药原材料提供了基础，成为继组织培养、细胞培养之后当代生物技术领域重要的研究和开发热点。
利用植物毛状根进行天然产物的生产进入了一个崭新的发展阶段，植物细胞培养技术生产的次生代谢产物被人类广泛应用。通过毛状根培养可以生产的次生代谢产物有生物碱类(如莨菪烷生物碱、喹啉生物碱)、甙类、黄酮类、醌类和一些重要的酶(如超氧化物歧化酶)等。人参毛状根的生长速度是常规激素诱导根生长速度的2倍(Yochikawa，1987)；莨菪毛状根无性系合成莨菪碱的效率是原植物的2倍以上(Mano 1986)；刘春超和刘本叶等对青蒿毛状根的培养条件和代谢组学进行了研究；研究发现栝楼毛状根生产天花粉蛋白克鲜重含量到8.16毫克。这些研究充分表明，毛状根培养体系正在成为生产次生代谢产物的重要生物技术之一。
发明内容
本发明的目的是公开一种金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法.
本发明金铁锁毛状根系诱导与培养方法为：
取金铁锁幼嫩茎为外植体进行脱分化处理，获得新鲜金铁锁愈伤组织，将愈伤组织与含有Ri质粒的发根农杆菌(ACCC10060，保藏单位缩写和菌种编号)共培养，以无菌纸吸取多余菌液后转入到诱导培养基中诱导培养，在金铁锁愈伤组织处生长出金铁锁毛状根；抑菌培养后将具有毛状根的外植体放入扩增培养基中进行毛状根的扩大培养。
所述金铁锁幼嫩茎脱分化处理时，是取1～2cm金铁锁幼嫩茎段置于MS+2，4-D0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，25℃±1下暗培养20d。获得新鲜金铁锁愈伤组织；所述发根农杆菌与金铁锁愈伤组织共培养前，先在固体YEB培养基中25℃±1下培养2～3d；然后选取单克隆到液体YEB培养基中振荡培养，菌液离心收集菌体；将菌体置于MS液体培养基中混匀；所述共培养培养基为100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基。共培养时间为1d；所述诱导培养基为含有500mg/L头孢噻肟钠的MS固体培养基；所述介导转化的外植体放入抑菌培养基中于25℃±1暗黑培养，每3～6d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净；所述将抑菌处理后具有毛状根的外植体放入毛状根扩增培养是在25℃±1暗黑振荡培养；所述扩增培养基为无激素1/2MS液体基本培养基；所述振荡培养箱摇床转速为110～120r·min-1。
本发明金铁锁毛状根系诱导与培养方法为：
(1)将金铁锁幼嫩茎剪成1～5cm的小段，无菌操作台中用升汞处理6～13分钟，酒精浸泡5～10秒，无菌水冲洗3～8遍后转入到MS+2，4-D0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，25℃±3下暗培养10～35d，获得金铁锁愈伤组织。
(2)将发根农杆菌ACCC10060菌株用1μL无菌水稀释后的菌液涂布在20mL YEB固体培养基上，25℃±3下暗培养1～6d长出克隆菌体。
(3)挑取1菌环单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25℃±3振荡培养，培养12小时，OD值为0.3～1.2.取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，培养8小时，OD值为0.3～0.9.收集菌液，3500rpm下离心5～15分钟收集菌体。
(4)将(3)收集的菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9％琼脂的MS固体培养基中并混匀。
(5)用(4)混匀后得到的菌液浸染金铁锁愈伤组织10～30分钟，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的金铁锁愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9％琼脂的MS固体培养基中1～3天。
(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；每2～9d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。
(7)用无激素1/2MS液体培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后1g的诱导出来的毛状根放入30mL的扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min-1。
本发明金铁锁毛状根系高效诱导与培养优选方法为：
(1)将金铁锁幼嫩茎剪成2cm的小段，无菌操作台中用升汞处理7分钟，酒精浸泡6秒，无菌水冲洗4遍后转入到MS+2，4-D0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，25℃±2下暗培养12d，获得金铁锁愈伤组织。
(2)将发根农杆菌A4菌液涂于YEB固体培养基中，25℃±3下暗培养4d长出单克隆。
(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25℃±2振荡培养，OD值为0.5.取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0.5.收集菌液，3500rpm下离心7分钟收集菌体。
(4)将(3)收集的菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9％琼脂的MS固体培养基中并混匀。
(5)用(4)混匀后得到的菌液浸染金铁锁愈伤组织12分钟，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的金铁锁愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9％琼脂的MS固体培养基中2天。
(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；每7d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。
(7)把无激素1/2MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的毛状根外植体放入该扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min-1。
本发明金铁锁毛状根系高效诱导与培养优选方法为：
(1)将金铁锁幼嫩茎剪成4cm的小段，无菌操作台中用升汞处理11分钟，酒精浸泡8秒，无菌水冲洗7遍后转入到MS+2，4-D0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，25℃±2下暗培养33d，获得金铁锁愈伤组织。
(2)将发根农杆菌A4菌液涂于YEB固体培养基中，25℃±3下暗培养5d长出单克隆。
(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25℃±2振荡培养，OD值为1.取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0.7.收集菌液，3500rpm下离心12分钟收集菌体。
(4)将(3)收集的菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9％琼脂的MS固体培养基中并混匀。
(5)用(4)混匀后得到的菌液浸染金铁锁愈伤组织25分钟，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的金铁锁愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9％琼脂的MS固体培养基中2天。
(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；每4d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。
(7)把无激素1/2MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的毛状根外植体放入该扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min-1。
附图说明
图1发根农杆菌介导Ri质粒转化金铁锁愈伤组织产生发根的照片
图2金铁锁毛状根扩增后悬浮培养的照片
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1毛状根系PCR检测
1、基因组DNA微量提取
1.1取1.0g经过筛选的毛状根在液氮下研磨，放入50ml离心管，加入20ml提取缓冲液(100mM Tris-HCl，PH 8.0；0.35mMSorbitol；5mMEDTA，pH 8.0；1％2-Mercaptoethanol)，置于冰上。
2.24℃，10000g离心10分钟，去上清液，用20ml提取缓冲液溶解沉淀两次并离心。
3.3去上清液并用5ml提取缓冲液悬浮沉淀，加入3.5ml高盐CTAB缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0；4M NaCl；1.8％CTAB；25mM EDTA，pH 8.0)和0.3ml Sarkosyl(浓度为30％的水溶液)，55℃孵育70分钟。
4.4加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，10000g离心10分钟。去上清液加入2/3体积预冷的混合有1/10体积乙酸钠的异丙醇。4℃，10000g离心20分钟。去上清液，用冷的75％的乙醇洗涤沉淀。去乙醇，在空气中干燥DNA，并用200μL TE缓冲液(10mM Tris，pH 8.0；1mM EDTA，pH 8.0)溶解。
5.5加入10μL Rnase(1mg/ml)在37℃下孵育40分钟，加入等体积的酚氯仿，抽提去除蛋白质。室温下，15000g离心10分钟。
5.6取上清液加入等体积预冷的100％的氯仿，沉淀去除蛋白质。室温下高速离心10分钟。
5.7取上清加入两倍体积的冷的无水乙醇(混合1/10体积的乙酸钠)，沉淀DNA然后将其放于-20℃下30分钟。
5.818000rpm下离心沉淀DNA 15分钟。用75％的冷的乙醇洗涤DNA沉淀，并在空气中干燥。用50-100μL TE缓冲液溶解DNA。
2、毛状根的PCR检测
取经过筛选的毛状根100ng的基因组DNA为模板，以试管苗正常根作为阴性对照，Ri质粒为阳性对照。rolC基因的引物序列(宝生物合成)：引物I序列5`-GATATATGCCAAATTTACACTAG-3`引物II序列5`-GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3`。
PCR反应总体系为50ul
在PCR仪(UNOII，Biometra)中进行反应，反应程序为94℃，45s；45℃，30s；72℃，45s共30个循环，72℃延长10min。
证明了T-DNA整合到金铁锁基因组诱导形成毛状根。
3、PCR-Southern分子杂交检测目的基因
3.1转膜
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。将电泳胶在变性液中浸泡1小时，中途换一次液。用去离子水漂洗一次，然后转入中和液中浸泡1小时。取一块洁净玻璃板，其上方铺一块whatman3MM滤纸，盘内倒入适量转移液20×SSC(5M NaCl；0.3M Na3Citrate，pH 8.0)，并使滤纸两端下垂完全浸入转移液。用转移液湿润滤纸，排除它与玻璃板之间的气泡。剪取一块与凝胶大小相同的尼龙膜，漂浮于去离子水中使其完全湿润，然后置于20×SSC中5分钟。将中和后的凝胶上下倒置后置于已浸润的whatman3MM滤纸上方。将浸湿的尼龙膜覆盖到凝胶上。以2×SSC浸湿两张与凝胶大小等同的whatman3MM滤纸，并覆盖于已经湿润的尼龙膜上方。剪裁一叠与凝胶大小相同的吸水纸，高5-8厘米，置于whatman3MM滤纸上，吸水纸上方置一块玻璃板。利用虹吸作用使DNA从凝胶转移到尼龙膜上。
3.2用Alkphos DIRECT试剂盒制备探针
用80μL Alkphos DIRECT试剂盒提供的水稀释20μL交联剂溶液，制成交联剂工作液。将含有rolC基因片段的质粒进行PCR反应，以扩增出大量的rolC基因片段。将PCR反应的产物进行电泳，用UNIQ-10柱式DNA回收试剂盒回收并纯化扩增出来的rolC基因片段。将该DNA片段稀释到10ng/μl，置于沸水浴中加热15分钟使其变性，然后迅速置于冰上5分钟。依次向其中加入10μlL反应液和2μL标记试剂，轻轻混匀。最后加入10μL交联剂工作液，轻混后在37℃反应30分钟。
3.3预杂交与杂交
转膜后将膜放于杂交缓冲液(把NaCl加入杂交缓冲液中，使其终浓度为0.5M，再加入阻断剂至终浓度为4％(w/v)，立即混合成阻断液悬液，继续室温混合1-2小时，55℃下在杂交炉中进行10分钟的预杂交，然后向以上杂交缓冲液中加入制备好的探针，55℃杂交过夜。
3.4洗膜
取出杂交后的膜，分别用初次洗液(2M尿素，0.1％SDS，50mM磷酸二氢钠，150mM NaCl，1mM MgCl2，0.2％阻断剂)和二次洗液(1M Tris base，0.3M柠檬酸钠液，pH 7.0)洗去膜上与DNA非特异性结合的探针。
3.5显影
将洗好的尼龙膜用保鲜膜包好，上压一张X光胶片，置于黑暗处曝光2-3个小时。用显影液和定影液冲洗X光胶片，以得到清晰的X光显影胶片。
下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。
具体实施方式
实施例1：
(1)将金铁锁幼嫩茎剪成2cm的小段，无菌操作台中用升汞处理7分钟，酒精浸泡6秒，无菌水冲洗4遍后转入到MS+2，4-D0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，25℃±2下暗培养12d，获得金铁锁愈伤组织。
(2)将发根农杆菌A4菌液涂于YEB固体培养基中，25℃±3下暗培养4d长出单克隆。
(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25℃±2振荡培养，OD值为0.5.取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0.5.收集菌液，3500rpm下离心7分钟收集菌体。
(4)菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基中并混匀。
(5)将金铁锁愈伤组织浸染于上述菌液中12分钟，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，接入到共培养基中2天。
(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养。每7d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。
(7)把无激素1/2MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的毛状根外植体放入该扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min-1。
实施例2：
(1)将金铁锁幼嫩茎剪成4cm的小段，无菌操作台中用升汞处理11分钟，酒精浸泡8秒，无菌水冲洗7遍后转入到MS+2，4-D0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，25℃±2下暗培养33d，获得金铁锁愈伤组织。
(2)将发根农杆菌A4菌液涂于YEB固体培养基中，25℃±3下暗培养5d长出单克隆。
(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25℃±2振荡培养，OD值为1.取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0.7.收集菌液，3500rpm下离心12分钟收集菌体。
(4)菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基中并混匀。
(5)将金铁锁愈伤组织浸染于上述菌液中25分钟，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，接入到共培养基中2天。
(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养。每4d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。
(7)把无激素1/2MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的毛状根外植体放入该扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min-1。
实施例3：
(1)将金铁锁幼嫩茎剪成1～2cm的小段，无菌操作台中用升汞处理8～10分钟，酒精浸泡8秒，无菌水冲洗5遍后转入到MS+2，4-D0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，25℃±1下暗培养20d，获得金铁锁愈伤组织。
(2)将发根农杆菌A4菌液涂于YEB固体培养基中，25℃±1下暗培养2～3d长出单克隆。
(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25℃±1振荡培养，OD值为0.6～0.8.取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0.6.收集菌液，3500rpm下离心10分钟收集菌体。
(4)菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基中并混匀。
(5)将金铁锁愈伤组织浸染于上述菌液中20分钟，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，接入到共培养基中1天。
(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养。每3～6d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。
(7)把无激素1/2MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的毛状根外植体放入该扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min-1。
Claims (9)
1.一种金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法为：
取金铁锁幼嫩茎为外植体进行脱分化处理，获得新鲜金铁锁愈伤组织，将愈伤组织与含有Ri质粒的发根农杆菌共培养，以无菌纸吸取多余菌液后转入到诱导培养基中诱导培养，在金铁锁愈伤组织处生长出金铁锁毛状根；抑菌培养后将具有毛状根的外植体放入扩增培养基中进行毛状根的扩大培养。
2.如权利要求1所述的金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法中所述金铁锁幼嫩茎脱分化处理时，是取1～2cm金铁锁幼嫩茎段置于MS+2，4-D0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，25℃±1下暗培养20d；获得新鲜金铁锁愈伤组织。
3.如权利要求1所述的金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法中所述发根农杆菌与金铁锁愈伤组织共培养，是先在固体YEB培养基中25℃±1下培养2～3d；然后选取单克隆到液体YEB培养基中振荡培养，菌液离心收集菌体；将菌体置于MS液体培养基中混匀。
4.如权利要求1所述的金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法中所述共培养培养基为100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基，共培养时间为1d；所述诱导培养基为含有500mg/L头孢噻肟钠的MS固体培养基。
5.如权利要求1所述的金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法中所述介导转化的外植体放入抑菌培养基中于25℃±1暗黑培养，每3～6d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。
6.如权利要求1所述的金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法中所述将抑菌处理后具有毛状根的外植体放入毛状根扩增培养是在25℃±1暗黑振荡培养；所述扩增培养基为无激素1/2MS液体基本培养基，所述振荡培养箱摇床转速为110～120r·min-1。
7.一种金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法为：
(1)将金铁锁幼嫩茎剪成1～5cm的小段，无菌操作台中用升汞处理6～13分钟，酒精浸泡5～10秒，无菌水冲洗3～8遍后转入到MS+2，4-D0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，25℃±3下暗培养10～35d，获得金铁锁愈伤组织；
(2)将发根农杆菌ACCC10060菌株用1μL无菌水稀释后的菌液涂布在20mL YEB固体培养基上，25℃±3下暗培养1～6d长出克隆菌体；
(3)挑取1菌环单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25℃±3振荡培养，培养12小时，OD值为0.3～1.2.取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，培养8小时，OD值为0.3～0.9.收集菌液，3500rpm下离心5～15分钟收集菌体；
(4)将(3)收集的菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9％琼脂的MS固体培养基中并混匀；
(5)用(4)混匀后得到的菌液浸染金铁锁愈伤组织10～30分钟，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的金铁锁愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9％琼脂的MS固体培养基中1～3天；
(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；每2～9d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净；
(7)用无激素1/2MS液体培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后1g的诱导出来的毛状根放入30mL的扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min-1。
8.如权利要求7所述的金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法为：
(1)将金铁锁幼嫩茎剪成2cm的小段，无菌操作台中用升汞处理7分钟，酒精浸泡6秒，无菌水冲洗4遍后转入到MS+2，4-D0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，25℃±2下暗培养12d，获得金铁锁愈伤组织；
(2)将发根农杆菌A4菌液涂于YEB固体培养基中，25℃±3下暗培养4d长出单克隆；
(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25℃±2振荡培养，OD值为0.5.取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0.5.收集菌液，3500rpm下离心7分钟收集菌体；
(4)将(3)收集的菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9％琼脂的MS固体培养基中并混匀；
(5)用(4)混匀后得到的菌液浸染金铁锁愈伤组织12分钟，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的金铁锁愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9％琼脂的MS固体培养基中2天；
(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；每7d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净；
(7)把无激素1/2MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的毛状根外植体放入该扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min-1。
9.如权利要求7所述的金铁锁毛状根系高效诱导与培养方法，其特征在于该方法为：
(1)将金铁锁幼嫩茎剪成4cm的小段，无菌操作台中用升汞处理11分钟，酒精浸泡8秒，无菌水冲洗7遍后转入到MS+2，4-D0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，25℃±2下暗培养33d，获得金铁锁愈伤组织；
(2)将发根农杆菌A4菌液涂于YEB固体培养基中，25℃±3下暗培养5d长出单克隆；
(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25℃±2振荡培养，OD值为1.取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0.7.收集菌液，3500rpm下离心12分钟收集菌体；
(4)将(3)收集的菌体置于100ml含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9％琼脂的MS固体培养基中并混匀；
(5)用(4)混匀后得到的菌液浸染金铁锁愈伤组织25分钟，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的金铁锁愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9％琼脂的MS固体培养基中2天；
(6)把含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；每4d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净；
(7)把无激素1/2MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的毛状根外植体放入该扩增培养基中，暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min-1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009102375792A CN102057868B (zh) | 2009-11-18 | 2009-11-18 | 一种金铁锁毛状根系的诱导与培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009102375792A CN102057868B (zh) | 2009-11-18 | 2009-11-18 | 一种金铁锁毛状根系的诱导与培养方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102057868A true CN102057868A (zh) | 2011-05-18 |
| CN102057868B CN102057868B (zh) | 2012-07-18 |
Family
ID=43993544
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2009102375792A Expired - Fee Related CN102057868B (zh) | 2009-11-18 | 2009-11-18 | 一种金铁锁毛状根系的诱导与培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102057868B (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102296083A (zh) * | 2011-09-05 | 2011-12-28 | 杭州师范大学 | 三叶青转基因毛状根的诱导和繁殖方法 |
| CN104255489A (zh) * | 2014-09-16 | 2015-01-07 | 毕节市中药研究所 | 金铁锁带腋芽嫩茎无性快速繁殖技术方法 |
| CN104839022A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-08-19 | 大连工业大学 | 金铁锁毛状根系的诱导方法 |
| CN104845929A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-08-19 | 大连工业大学 | 金铁锁悬浮细胞培养体系及其建立方法 |
| CN108220326A (zh) * | 2016-12-09 | 2018-06-29 | 安徽红果春生物制药有限公司 | 一种三七发状根系制备方法 |
| CN108220325A (zh) * | 2016-12-09 | 2018-06-29 | 安徽红果春生物制药有限公司 | 一种发根农杆菌转化三七细胞的制备方法 |
| CN109906941A (zh) * | 2019-04-22 | 2019-06-21 | 贵州省生物研究所 | 一种金铁锁不定根悬浮培养的方法 |
| CN113796316A (zh) * | 2021-10-18 | 2021-12-17 | 大连工业大学 | 促进金铁锁毛状根愈伤组织产花青素的培养基及诱导方法 |
-
2009
- 2009-11-18 CN CN2009102375792A patent/CN102057868B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102296083B (zh) * | 2011-09-05 | 2013-04-24 | 杭州师范大学 | 三叶青转基因毛状根的诱导和繁殖方法 |
| CN102296083A (zh) * | 2011-09-05 | 2011-12-28 | 杭州师范大学 | 三叶青转基因毛状根的诱导和繁殖方法 |
| CN104255489B (zh) * | 2014-09-16 | 2016-05-18 | 毕节市中药研究所 | 金铁锁带腋芽嫩茎无性快速繁殖技术方法 |
| CN104255489A (zh) * | 2014-09-16 | 2015-01-07 | 毕节市中药研究所 | 金铁锁带腋芽嫩茎无性快速繁殖技术方法 |
| CN104839022B (zh) * | 2015-05-08 | 2018-11-13 | 大连工业大学 | 金铁锁毛状根系的诱导方法 |
| CN104845929A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-08-19 | 大连工业大学 | 金铁锁悬浮细胞培养体系及其建立方法 |
| CN104845929B (zh) * | 2015-05-08 | 2018-10-12 | 大连工业大学 | 金铁锁悬浮细胞培养体系及其建立方法 |
| CN104839022A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-08-19 | 大连工业大学 | 金铁锁毛状根系的诱导方法 |
| CN108220326A (zh) * | 2016-12-09 | 2018-06-29 | 安徽红果春生物制药有限公司 | 一种三七发状根系制备方法 |
| CN108220325A (zh) * | 2016-12-09 | 2018-06-29 | 安徽红果春生物制药有限公司 | 一种发根农杆菌转化三七细胞的制备方法 |
| CN109906941A (zh) * | 2019-04-22 | 2019-06-21 | 贵州省生物研究所 | 一种金铁锁不定根悬浮培养的方法 |
| CN109906941B (zh) * | 2019-04-22 | 2022-12-23 | 贵州省生物研究所 | 一种金铁锁不定根悬浮培养的方法 |
| CN113796316A (zh) * | 2021-10-18 | 2021-12-17 | 大连工业大学 | 促进金铁锁毛状根愈伤组织产花青素的培养基及诱导方法 |
| CN115413580A (zh) * | 2021-10-18 | 2022-12-02 | 大连工业大学 | 促进金铁锁毛状根愈伤组织产生花青素的培养基及培养方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102057868B (zh) | 2012-07-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102057868B (zh) | 一种金铁锁毛状根系的诱导与培养方法 | |
| Maggs et al. | A MOLECULAR AND MORPHOLOGICAL ANALYSIS OF THE GYMNOGONGRUS DEVONIENSIS (RHODOPHYTA) COMPLEX IN THE NORTH ATLANTIC 1 | |
| CN107012174A (zh) | CRISPR/Cas9技术在获得家蚕锌指蛋白基因突变体中的应用 | |
| CN101121941B (zh) | 一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法 | |
| CN106222118B (zh) | 一株链霉菌属放线菌及其用途 | |
| CN111513077B (zh) | 一种RNAi纳米制剂及其制备方法和在TMV防治中的应用 | |
| CN104178490B (zh) | 用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体和应用 | |
| CN108192898B (zh) | 塞尼卡谷病毒svv/ch/zz/2016的全基因组序列及其扩增引物 | |
| CN102754595B (zh) | 一种千层塔发状根系的制备与培养方法 | |
| Xiang et al. | Phylogenetic placement of the enigmatic and critically endangered genus Saniculiphyllum (Saxifragaceae) inferred from combined analysis of plastid and nuclear DNA sequences | |
| CN109295080A (zh) | 珠子参β-香树脂醇合成酶基因Pjβ-AS的用途 | |
| CN110117320A (zh) | 棉花GhCAL-D07基因在促进植物开花中的应用 | |
| CN107236690A (zh) | 短小芽孢杆菌rp01及其应用 | |
| CN107916264A (zh) | 翅发育相关基因vestigial的dsRNA及其在防治橘小实蝇中的应用 | |
| CN102061297B (zh) | 转基因提高丹参中丹酚酸b含量的方法 | |
| CN110499278A (zh) | 一种银杏叶原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法 | |
| CN102690841A (zh) | 一种获得红豆杉转基因愈伤组织的遗传转化方法 | |
| CN108823242A (zh) | 一种转化玉米cDNA文库改良水稻品种的方法 | |
| Seo et al. | Morphology, basiphyte range, and plastid DNA phylogeny of Campylaephora borealis stat. nov.(Ceramiaceae, Rhodophyta) | |
| CN106613970B (zh) | 黄精叶钩吻的组培快速繁殖方法 | |
| CN102754594A (zh) | 一种东哥阿里发状根系的制备与培养方法 | |
| CN102296083B (zh) | 三叶青转基因毛状根的诱导和繁殖方法 | |
| CN100451113C (zh) | 一种提高大豆抗虫性的转基因方法 | |
| Graf et al. | Transcriptome analysis reveals the spatial and temporal differentiation of gene expression in the sporophyte of Undaria pinnatifida | |
| CN103993039A (zh) | 一种利用pmi筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SHANGHAI TAIHAO BIOTECHNOLOGY (ZHOUKOU) CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: LIU TONGXIANG Effective date: 20120514 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 100081 HAIDIAN, BEIJING TO: 466000 ZHOUKOU, HENAN PROVINCE |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20120514 Address after: 466000 middle section, South eight road, Zhoukou economic and Technological Development Zone, Henan Applicant after: Shanghai Taihao Biotechnology (Zhoukou) Co., Ltd. Address before: 100081 traditional Chinese Medicine Research Institute, Minzu University of China, 27 South Avenue, Beijing, Zhongguancun, Haidian District Applicant before: Liu Tongxiang |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120718 Termination date: 20151118 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |