CN111513077B - 一种RNAi纳米制剂及其制备方法和在TMV防治中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术及其应用领域，为了解决目前缺乏抗TMV的高效RNAi纳米制剂，且药剂制备过程繁杂，dsRNA的稳定性及递送效率差等问题，提供了一种RNAi纳米制剂及其制备方法和在TMV防治中的应用，该RNAi纳米制剂由dsRNA和壳聚糖纳米材料制备而成，其中：dsRNA为筛选所得长度为313bp的高抗TMV的RdRP3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述壳聚糖和1μg/μl的dsRNA的体积比是10：(1～6)。本发明的RNAi纳米制剂能够使dsRNA的稳定性更强，持久性更好，同时具有生物相容性好、生物可降解性好、对作物无药害、环境友好型等优点，在TMV病毒防治领域具有良好的应用前景。

Description

一种RNAi纳米制剂及其制备方法和在TMV防治中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术及其应用领域，具体涉及一种RNAi纳米制剂及其制备方法和在TMV防治中的应用，尤其涉及一种高效靶向的基因筛选、RNAi 纳米制剂的简易制备方法及其在TMV防治中的新应用。
背景技术
壳聚糖(chitosan)是由自然界中广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，因其具有良好的安全性、生物相容性和微生物降解性等特性而被广泛研究并应用于植物保护、生物治疗、基因工程、食品和医药等领域。
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)广泛分布于我国各烟区，是目前烟草上分布最广、发生最为普遍的病毒病害，对烟草的危害极大。植物遭受病毒侵染后，生长发育会受到严重影响，减产严重，对烟区经济造成威胁。
近年来，通过纳米材料递送dsRNA或siRNA已成为大热的研究趋势，能够解决dsRNA或siRNA存在的自身稳定性差、易降解等问题，达到对某些植物病毒病有效防治的目的。该技术具有环境友好、持效时间长、对作物无害等多重优点，能有效防治植物病毒。
尽管RNAi纳米制剂在TMV病毒防治方面已有研究，但对于高效作用片段的筛选研究较少，所以筛选到高效作用的片段之后，有效利用现有技术的思路，制成高效的纳米制剂，并将该制剂运用到TMV的病毒防治中，对于该病毒的大规模防治具有十分重要的意义。
发明内容
本发明为了解决目前缺乏抗TMV的高效RNAi纳米制剂，且药剂制备过程繁杂，dsRNA的稳定性及递送效率差等问题，提供了一种RNAi纳米制剂及其制备方法和在TMV防治中的应用，筛选出一段高效抗TMV复制增殖移动的片段，提供了该RNAi纳米制剂的简便制备方法并将其应用到TMV防治的过程中。
为了达到上述目的，本发明采用的具体技术方案为：一种RNAi纳米制剂，所述RNAi纳米制剂由dsRNA和壳聚糖纳米材料制备而成，其中：dsRNA为筛选所得长度为313bp的高抗TMV的RdRP3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述壳聚糖和1μg/μl的dsRNA的体积比是10：1-6。
所述dsRNA的靶标基因为TMV基因中RNA依赖的RNA聚合酶蛋白基因即 RdRP3基因。
制备所述RNAi纳米制剂的方法，将dsRNA溶液按照比例滴加到壳聚糖纳米材料溶液中混匀，将含有dsRNA的壳聚糖冰乙酸溶液按比例加入到1％SDS溶液中，震荡10min，dsRNA包裹在壳聚糖内部，形成直径为100-200nm的类球体；其中：所述dsRNA溶液的浓度为1μg/μl；所述壳聚糖纳米材料溶液为将壳聚糖溶解于冰乙酸中，壳聚糖纳米材料溶液的终浓度为2μg/μl。
dsRNA溶液的制备方法具体步骤如下：
(1)提取经TMV侵染的烟叶总RNA，以提取的总RNA为模板进行逆转录，获得cDNA；
(2)选择与TMV在植物体内复制增殖移动相关蛋白的基因，以TMV CP蛋白的表达量为指标进行real-time RT-PCR和Western Blot验证，筛选得到高抗性的长度为313bp的RdRP3基因；
(3)以cDNA为模板，设计RdRP3序列的特异性扩增引物，用其特异性引物扩增目的基因片段；
(4)以特异性扩增所得目的基因片段为模板，体外合成dsRNA。
提取经TMV侵染的烟叶总RNA的方法为Trizol抽提法。
所述RdRP3序列的特异性扩增引物，其上下游引物序列如SEQ ID NO.2-3 所示的DNA序列。
所述的RNAi纳米制剂在TMV防治中的应用，所述RNAi纳米制剂的使用方法为：将成品溶液均匀涂抹或喷施在植物叶片上。
本发明所制备的RNAi纳米制剂具有稳定性强、递送效率高、不易被降解的特点，能够通过促进dsRNA在植物体内的穿梭和转运效率来增加药效，从而有效防治TMV。
本发明聚焦创制烟草专用的非转基因RNAi干扰体系，通过配位聚合技术，用纳米材料包覆抗病毒的dsRNAs，研发新型纳米药物，使其在烟株表面稳定存在，且持续释放至体内发挥抗病毒活性，重构烟草特异抗病毒免疫系统。
本发明对新型植物病毒剂开发和应用具有重要的理论意义和重大的实践价值，而且显示了该领域防治TMV的巨大潜力，将促进基于RNAi的烟草病害管理的实践和发展。
本发明通过多方面比较，筛选出抗TMV效果最好的一段基因序列，使用优良的纳米材料壳聚糖，同时简化了复合纳米制剂的制备方法，使得该方法更加简便易行，且防治效果更加高效明显。
为开发新型植物抗病毒纳米药物，初步选定六段候选基因，体外合成相应的dsRNA，以抗烟草花叶病毒活性为指标，用生物学方法评估其抗病毒能力，在此基础上筛选能够高效降解TMV靶向核酸的dsRNA，并对筛选到的抗病毒高效片段进行了壳聚糖包被，实现更加高效的递送与靶向沉默。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
(1)本发明结合real-time RT-PCR和Western Blot分析结果筛选出稳定显著差异表达的基因片段RdRP3，能够高效与靶基因结合，降低染病植株烟草花叶病毒的表达量，实现对植株的靶向RNAi保护。
(2)本发明提供了RNAi纳米制剂在TMV防治中的应用，以TMV的RNA依赖的RNA聚合酶RdRP基因为模板体外合成相应的dsRNA，通过与壳聚糖纳米材料的结合提高dsRNA的稳定性，使其能更稳定地进入植物体进而引起植物体内的RNAi。
(3)本发明提供的制剂，以壳聚糖作为载体，除了能增加dsRNA的稳定性，还能提高dsRNA纳米粒的转染效率。
(4)本发明提供的RNAi纳米制剂可采用喷洒或施肥的方式，应用于TMV 的防治。
(5)本发明提供的RNAi纳米制剂可作为纳米生物农药，应用于农业方面的相关生产中。
附图说明
图1为本发明实施例1所提供的含T7启动子的目的基因cDNA的琼脂糖凝胶电泳结果图，图中：从左到右的泳道分别为Marker、CP、MP、P126、RdRP2、RdRP3、RdRP4基因的cDNA，大小分别约为480bp、333bp、641bp、388bp、 313bp和746bp，与目的基因大小相符；
图2为本发明实施例1所提供的体外转录合成dsRNA的琼脂糖凝胶电泳结果图，图中：从左到右的泳道分别为Marker、CP dsRNA、MP dsRNA、P126 dsRNA、 RdRP2 dsRNA、RdRP3dsRNA和RdRP4 dsRNA；
图3为不同dsRNA处理对野生型TMV表达量的影响结果图；
图4为各组dsRNA处理后的烟草叶片Western Blot结果；
图5为烟叶片接毒后3d、5d后的实时荧光定量检测照片；
图6为不同dsRNA处理5天对TMV-30b表达量的影响；
图7为本发明所提供的dsRNA与不同比例壳聚糖融合的琼脂糖凝胶电泳图，图中：从左到右的泳道分别为Marker，RdRP3 dsRNA：壳聚糖1:2，1:5，1:10， 1:20，1:30，1:40，RdRP3 dsRNA；
图8为本发明所提供纳米制剂放置10d后的琼脂糖凝胶电泳图，图中：从左到右的泳道分别为Marker，RdRP3 dsRNA：壳聚糖1:2，1:5，1:10，1:20， 1:30，1:40；
图9为本发明所提供纳米制剂喷施三生烟后接毒3d的枯斑照片；
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：本实施例提供了一种筛选高效作用片段的方法及其应用。选定六组候选的基因片段并在体外合成dsRNA后，用生物学方法评估其抗病毒能力，在此基础上筛选高效降解TMV靶向核酸的dsRNA。
TMV六组候选的基因片段即CP、MP、P126、RdRP2、RdRP3、RdRP4，其基因序列依次为如序列表：SEQ ID NO.4、5、6、7、1、8所示的序列。
用于高效防治TMV的dsRNA的筛选方法，具体包括以下步骤：
S1：提取经TMV侵染的烟叶总RNA。以提取的总RNA为模板进行逆转录，获得TMV的cDNA；
S2：以cDNA为模板，设计CP、MP、P126、RdRP2、RdRP3、RdRP4六段序列的特异性扩增引物，用其特异性引物扩增目的基因片段；
S3：以特异性扩增产物为模板，体外合成dsRNA。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的筛选高效作用片段的方法，下面将具体进行描述。
(S1)：使用总RNA提取试剂盒进行植物叶片植物总RNA的提取，具体步骤如下：
S1-1：采集感染TMV的新鲜烟草叶片，立即置于液氮中。
S1-2：液氮预冷研钵至不能手持，将烟草叶片至于研钵，直至研磨成粉末状，其间不断加入液氮。
S1-3：取100mg粉末至于1.5ml离心管，立即加入1ml RNAiso Plus (Takara)，振荡混匀至无肉眼可见颗粒，室温静置5min。
S1-4：12 000g 4℃离心10min。小心吸取上清(切勿吸取沉淀)，转入新的1.5mL离心管中。
S1-5：加入200μL氯仿，盖紧离心管盖，振荡混匀至乳白色。室温静置5 min。
S1-6：12 000g 4℃离心15min。此时匀浆液为三层：无色的上清液(含 RNA)、中间的白色蛋白层(大部分为DNA)及带有颜色的下层有机相。
S1-7：小心吸取上清液(切勿吸取中间白色蛋白层)转移至另一新的1.5mL 离心管中。
S1-8：加入500μL异丙醇，轻轻上下颠倒5次后，室温静置10min。
S1-9：12 000g 4℃离心10min。
S1-10：小心弃去上清，加入1mL 75％乙醇，轻轻上下颠倒离心管，7 500 g 4℃离心5min，弃去上清(切勿触及沉淀)。重复一次。
S1-11：打开离心管盖，室温干燥5min，加入100μL RNase-free H2O溶解沉淀。
最后，将提取的RNA经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所述，然后将提取的RNA置于-80℃中保存。
(S2)：TMV基因组cDNA的合成，该反应利用Vazyme的
Figure BDA0002506365860000051
ⅢRT SuperMix forqPCR(+gDNA wiper)试剂盒进行逆转录过程，具体操作如下：
S2-1：4×gDNA wiper Mix，5×HiScriptⅢqRT SuperMix，RNA Template， RNase-Free H2O放置在冰上解冻，之后的几步均在冰上完成；
S2-2：配制去除基因组DNA反应混合液体系，具体体系为：4×gDNA wiper Mix 4μl，RNA Template 1μl(1μg),RNase-Free H2O to 16μl；
S2-3：移液枪轻轻吹打，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底；
S2-4：42℃，孵育2min；
S2-5：反应结束后，得反应液I，短暂离心，置于冰上冷却；
S2-6：配置反转录体系混合液体系，具体体系为：上述反应液I 16μl， 5×HiScriptⅢqRT SuperMix 4μl；
S2-7：混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底；
S2-8：37℃孵育15min，85℃孵育5s；
S2-9：反应结束后，置于-20℃中保存。
(S3)：六种基因的扩增
S3-1：根据序列信息设计六种基因的引物，引物序列如表1所示：
表1：基因扩增引物及相应序列
Figure BDA0002506365860000061
Figure BDA0002506365860000071
S3-2：以cDNA为模板，利用表1所示特异性含T7启动子的引物对TMV基因组进行PCR扩增反应，得到含有T7启动子的TMV CP、MP、P126、RdRP2、RdRP3、 RdRP4基因的扩增产物；
该反应利用Vazyme的
Figure BDA0002506365860000072
ⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper) 试剂盒进行逆转录过程，具体操作如下：
PCR反应体系具体为：2×Phanta Max Master Mix 25μl；模板DNA 1μl； Primer F2μl；Primer R 2μl；H2O to 50μl；
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，Tm退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸5min，最后8℃保温。
(S4)：体外转录制备六种基因的dsRNA，参照TaKaRa的In vitro TranscriptionT7 Kit(for siRNA Synthesis)试剂盒的说明书进行体外转录制备，具体操作如下：
S4-1：dsRNA的制备：取15μl PCR扩增产物配置40μl反应体系，反应体系如下：10×Transcription Buffer 4μl，ATP Solution 4μl，GTP Solution 4μl，CTP Solution 4μl，UTP Solution 4μl，RNase Inhibitor 1μl，T7 RNA Polymerase 4μl，linear templateDNA 15μl；
S4-2：将上述溶液均匀混合后轻微离心，将转录反应液收集于反应管底部， 42℃反应2h；
S4-3：转录反应后，向其中加入6μl RNase free DNase I，混匀；
S4-4：37℃反应30min。
S4-5：纯化dsRNA：反应液体积为40μl时，加入60μl RNase free H2O 补足至100μl。
(1)加入等体积的苯酚(pH4.5)/氯仿/异戊醇(25：24：1)，搅拌均匀， 12,000rpm室温离心2min。
(2)上层(水层)移至新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)，搅拌，12,000rpm室温离心2min。
(3)上层(水层)移至新离心管中，加入1/10体积的3M冰乙酸钠、等体积的异丙醇，充分混合均匀。
(4)室温放置5min后，15,000rpm室温离心5min。
(5)除去上清，80％乙醇洗净沉淀。
(6)干燥后加入40μl RNase free H2O溶解沉淀，保存于-20℃。
S4-6：dsRNA的检测：取2μl dsRNA产物混合6×loading buffer通过琼脂糖凝胶电泳检测，观察条带是否单一且明亮，电泳检测结果见图2；并使用微量分光光度计测定dsRNA的浓度。
(S5)高效抗病特异性dsRNA的筛选。
S5-1：实验室烟草的种植和移栽：盘中撒本氏烟种盖膜，待一周左右种子发芽并长至适合移栽的大小，将烟苗移至一次性塑料杯中，培养一个月左右，烟株长至适合做处理的大小。
S5-2：dsRNA的注射与TMV的接种：本实验采用先注射dsRNA，24h后接种TMV病毒的方法。提前选好大小均一的本氏烟叶片，做好标记。取200μg dsRNA 溶于0.7ml H2O中，注射入叶片中，对照组叶片仅注射0.7ml H2O。24h后接毒，称取少量TMV毒源叶片于研钵中研磨成汁，加入100倍体积的PBS缓冲液 (pH 6.8)并混匀，于大小均一的本氏烟叶片上撒上一层100目石英砂，用棉签蘸取毒源汁液轻轻涂抹在叶片上，造成微伤口，使病毒侵染，尽量保证病毒接种量一致、力度均一。接毒后24h、48h、72h，分别剪取接种叶并速冻至液氮中，每天取3个生物学重复，于-80℃中保存，用于real-time RT-PCR和 Western Blot。
S5-3：提取样本叶片的RNA，用于real-time RT-PCR。
以Actin-F/R检测Actin的mRNA相对表达水平，以TMV-F/R检测TMV CP 的mRNA的相对表达水平，引物序列见表1。参照Vazyme的ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒的说明书进行real-time RT-PCR，具体操作如下：
(1)cDNA的获得：步骤参照实施例1的S1、S2，获得H2O、CP、MP、P126、 RdRP2、RdRP3、RdRP4的dsRNA处理过的感病叶片的cDNA。
(2)取96孔反应板MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate withBarcode(ABI)，配置real-time RT-PCR体系，具体体系为：2×ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix 10μl，Primer F 0.4μl；Primer R 0.4μl；cDNA 1 μl，H2O 8.2μl。
(3)轻弹管壁混合均匀，并用96孔反应板离心机瞬离，避免气泡产生。
(4)置于Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System中完成real-time RT-PCR反应。反应程序为95℃30s；95℃10s，60℃30s， 40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s，反应完成，分析得到结果。结果如图3所示，从图中可知：第三天MP、RdRP3、RdRP4处理过的植株病毒相对表达量更低，抗病毒效果更加明显。
S5-4：提取样本叶片的全蛋白质。利用康为世纪的Plant Protein ExtractionKit试剂对样本叶片进行蛋白质的提取，具体操作如下：
(1)在蛋白抽提前取出实验所需Plant Protein Extraction Reagent进行预冷。
(2)称量试验植物组织的重量。按照1g组织加入5ml Plant Protein ExtractionReagent(在蛋白抽提前接按照1：99比例加入Protease Inhibitor Cocktail)
(3)匀浆后冰上孵育30min。
(4)4℃13,400×g，离心20min。
(5)收集上清中的可溶性蛋白，于-80℃保存，准备进行下一步分析。
S5-5：蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测。
(1)取上清蛋白溶液8μl混合加入等体积8μl 2×SDS上样缓冲液于PCR管中，沸水中煮5min，CP、MP、P126、RdRP2、RdRP3、RdRP4共六种处理蛋白分别上样15μL至样品孔中，Blue PlusⅡ蛋白maker加8μL至上样孔，180V电泳35min，至上样缓冲液染料移至凝胶底部。
(2)取下玻璃板并用刮片撬开，取下凝胶，去掉积层胶，将分离胶浸泡于转膜缓冲液。
(3)用转膜缓冲液浸泡海绵垫和厚滤纸，剪取适当大小的PVDF膜于甲醇中浸泡10s，按序安装海绵垫、厚滤纸、分离胶及PVDF膜，赶走分离胶与PVDF 膜之间的气泡。在转移缓冲液中加入冰盒，100V转膜90min。
(4)转膜结束后，将分离胶用考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液染色、脱色，利用化学发光成像仪取照。
(5)将PVDF膜用TBST缓冲液清洗三次，每次10min。
(6)PVDF膜于封闭液(取0.5g BSA溶于10mL TBST)中室温45rpm 封闭1h。
(7)取出PVDF膜，放入含有一抗(稀释2000倍，Abcam)的TBST中，4℃过夜。
(8)PVDF膜用TBST清洗三次，每次10min。
(9)放入含有二抗(稀释5000倍，Abcam)的TBST中，45rpm摇1h。
(10)PVDF膜放入TBST中清洗三次，每次10min。
(11)使用eECL Western Blot Kit配制发光液，涂抹在膜上，利用化学发光成像仪取照。各组dsRNA处理后的烟草叶片Western Blot结果见图4。 Western Blot结果表明，注射dsRNA后，TMV病毒CP蛋白的表达量皆有不同程度的下降，说明dsRNA对TMV的复制侵染有较为明显的抑制作用。
实施例2：实施例1进一步筛选的高效dsRNA在TMV病毒预防中的应用，具体应用方法如下：
S1：实验室烟草的种植和移栽：步骤参照实施例1的S5-1，栽培烟株长至适当的大小。
S2：dsRNA的注射与TMV-30b的接种：本实验采用先注射dsRNA，24h后接种TMV-30b病毒的方法。提前选好大小均一的本氏烟叶片，做好标记。分别取200μg MP、RdRP3的dsRNA溶于0.7ml H2O中，注射入叶片中，对照组叶片仅注射0.7ml H2O。24h后接毒，称取少量TMV-30b毒源叶片于研钵中研磨成汁，加入40倍体积的PBS缓冲液(pH 6.8)并混匀，于大小均一的本氏烟叶片上撒上一层100目石英砂，用棉签蘸取毒源汁液轻轻涂抹在叶片上，造成微伤口，使病毒侵染，尽量保证病毒接种量一致、力度均一。接毒后3d、5d，紫外下观察荧光并拍照，分别剪取接种叶并速冻至液氮中，每天取3个生物学重复，于-80℃中保存，用于real-time RT-PCR。
S3：real-time RT-PCR步骤参考实施例1的S5-3，进行实时荧光定量检测。荧光照片如图5所示，从图中可知，RdRP3 dsRNA处理过的本氏烟叶片荧光更少，且能够明显延长叶片枯萎的时间。不同dsRNA处理5天对TMV-30b表达量的影响实验结果如图6所示，从图中可知，第五天RdRP3的病毒表达量更低，抗病毒效果相对更加明显。结合以上实验结果，最终选定RdRP3为目标dsRNA。
为了更清楚详细地介绍本发明所提供的用于防治TMV的RNAi纳米制剂及其制备方法，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例3：用于防治TMV的纳米化RNAi制剂的制备方法，包括以下步骤：
(S1)壳聚糖纳米材料与dsRNA的结合，具体操作步骤如下所示：
S1-1：将壳聚糖溶解于冰乙酸中，制得终浓度为2μg/μl的壳聚糖溶液A；
S1-2：将浓度为1μg/μl的TMV dsRNA溶液缓慢加入壳聚糖溶液A中，壳聚糖和dsRNA的体积比是10：(1～6)。若质量比过低，会使许多的dsRNA未与壳聚糖结合，最终影响TMV病毒防治的效果，若比例过高，会使许多壳聚糖纳米材料未附着dsRNA，造成不必要的浪费。
RdRP3基因的dsRNA分别设置6个混合比例，壳聚糖冰乙酸溶液:dsRNA体积比分别为10:1、10:2、10:3、10:4、10:5、10:6装管，并标记；
S1-3：dsRNA的壳聚糖溶液和1％的SDS溶液以2:1的体积比混合，涡旋震荡5min；
S1-4：取5μl混合溶液加入1μl 6×DNA loading buffer，琼脂糖凝胶电泳观察结果。若无条带出现，且点样孔周围出现明亮条带，证明壳聚糖dsRNA 稳定性强，结合成功，dsRNA与不同壳聚糖融合的结果见图7。
S1-5：以上dsRNA与不同比例壳聚糖融合的纳米制剂常温下放置10d，取5μl混合溶液加入1μl 6×DNA loading buffer，琼脂糖凝胶电泳观察结果见图8，检验制剂的稳定性。如图，电泳结果与S1-4的结果类似，说明该纳米制剂稳定性较强，不易被降解。
其中：dsRNA的浓度为1～2μg/μl；dsRNA的浓度优选：1、1.5、2μg/μl 等数值。
该RNAi纳米制剂由dsRNA和壳聚糖纳米材料制成的，dsRNA是由RNA依赖的RNA聚合酶即RdRP3基因制成，该基因对TMV在植物体内的复制起到关键作用。通过RNAi技术特异性地沉默该功能基因，对于TMV病毒的防治意义重大。
实施例4：所制备的RNAi纳米制剂的应用，使用方法为将成品溶液均匀涂抹或喷施在植物叶片上。具体应用方法如下：
S1：实验室烟草的种植和移栽：盘中撒三生烟种盖膜，待一周左右种子发芽并长至适合移栽的大小，将烟苗移至一次性塑料杯中，培养一个月左右，烟株长至适合做处理的大小。
S2：纳米药物的喷施与野生型TMV的接种：本实验采用先喷施药物，12h 后接种野生型TMV病毒的方法。提前选好大小均一的三生烟叶片，做好标记。纳米药物均匀喷洒至叶片上，对照组叶片仅喷洒H2O。12h后接毒，称取少量野生型TMV毒源叶片于研钵中研磨成汁，加入100倍体积的PBS缓冲液(pH 6.8) 并混匀，于大小均一的三生烟叶片上撒上一层100目石英砂，用棉签蘸取毒源汁液轻轻涂抹在叶片上，造成微伤口，使病毒侵染，尽量保证病毒接种量一致、力度均一。接毒后3d观察枯斑数量并拍照，结果如图9所示，纳米药物处理过的烟株叶片上仅有少量枯斑，而对照组水处理的烟株叶片上出现大量枯斑且已经出现萎蔫的症状，说明该纳米药物的药效较为明显。
序列表
<110> 中国农业科学院烟草研究所；中国烟草总公司四川省公司；四川省烟草公司凉山州公司
<120> 一种RNAi纳米制剂及其制备方法和在TMV防治中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 313
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atttcgctgg cgtttgggaa cgcatttccc tccgtgaaag agaggctctt gaacaggaaa 60
cttatcagag tggcaggcga cgcattagag atcagggtgc ctgatctata tgtgaccttc 120
cacgacagat tagtgactga gtacaaggcc tctgtggaca tgcctgcgct tgacattagg 180
aagaagatgg aagaaacgga agtgatgtac aatgcacttt cagagttatc ggtgttaagg 240
gagtctgaca aatttgatgt tgatgttttt tcccagatgt gccaatcttt ggaagttgac 300
ccaatgacgg cag 313
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attctctaga agcttaatac gactcactat agggatttcg ctggcgtttg 50
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attctctaga agcttaatac gactcactat agggctgccg tcattgggtc 50
<210> 4
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtcttaca gtatcactac tccatctcag ttcgtgttct tgtcatcagc gtgggccgac 60
ccaatagagt taattaattt atgtactaat gctttaggaa atcagtttca aacacaacaa 120
gctcgaactg tcgttcaaag acaattcagt gaggtgtgga aaccttcacc acaagtaact 180
gttaggttcc ctgacagtga ctttaaggtg tacaggtaca atgcggtatt agacccgcta 240
gtcacagcac tgttaggtgc attcgacact agaaatagaa taatagaagt tgaaaatcag 300
gcgaacccca cgactgccga aacgttagat gctactcgta gagtagacga cgcaacggtg 360
gccataagga gcgcgataaa taatttaata gtagaattga tcagaggaac cggatcttat 420
aatcggagct ctttcgagag ctcttctggt ttggtttgga cctctggtcc tgcaact 477
<210> 5
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggaaagagcc gacgaggcca ctctcggatc ttactacaca gcagctgcaa agaaaagatt 60
tcagttcaag gtcgttccca attatgctat aaccacccag gacgcgatga aaaacgtctg 120
gcaagtttta gttaatatta gaaatgtgaa gatgtcagcg ggtttctgtc cgctttctct 180
ggagtttgtg tcggtgtgta ttgtttatag aaataatata aaattaggtt tgagagagaa 240
gattacaaac gtgagagacg gagggcccat ggaacttaca gaagaagtcg ttgatgagtt 300
catggaagat gtccctatgt caatcaggct tgc 333
<210> 6
<211> 641
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcttaccgtc gatgtttacc cctgtaaaga gtgttatgtg ttccaaagtt gataaaataa 60
tggttcatga gaatgagtca ttgtcagagg tgaaccttct taaaggagtt aagcttattg 120
atagtggata cgtctgttta gccggtttgg tcgtcacggg cgaatggaac ttgcctgaca 180
attgcagagg aggtgtgagc gtgtgtctgg tggacaaaag gatggaaaga gccgacgagg 240
ccactctcgg atcttactac acagcagctg caaagaaaag atttcagttc aaggtcgttc 300
ccaattatgc tataaccacc caggacgcga tgaaaaacgt ctggcaagtt ttagttaata 360
ttagaaatgt gaagatgtca gcgggtttct gtccgctttc tctggagttt gtgtcggtgt 420
gtattgttta tagaaataat ataaaattag gtttgagaga gaagattaca aacgtgagag 480
acggagggcc catggaactt acagaagaag tcgttgatga gttcatggaa gatgtcccta 540
tgtcaatcag gcttgcaaag tttcgatctc ggaccggaaa aaagagtgat gtccgtaaag 600
ggaaaaatag tagtagtgat cggtcagtgc cgaacaagaa c 641
<210> 7
<211> 388
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cttacttccc ggcctctaat agagaggttt acatgaagga gtttttagtc accagagtta 60
atacctggtt ttgtaagttt tctagaatag atacttttct tttgtacaaa ggtgtggccc 120
ataaaagtgt agatagtgag cagttttata ctgcaatgga agacgcgtgg cattacaaaa 180
agactcttgc aatgtgcaac agcgagagaa tcctccttga ggattcatca tcagtcaatt 240
actggtttcc caaaatgagg gatatggtca tcgtaccatt attcgacatt tctttggaga 300
ctagtaagag gacgcgcaag gaagtcttag tgtccaagga tttcgtgttt acagtgctta 360
accacattcg aacataccag gcgaaagc 388
<210> 8
<211> 757
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgaccttcca cgacagatta gtgactgagt acaaggcctc tgtggacatg cctgcgcttg 60
acattaggaa gaagatggaa gaaacggaag tgatgtacaa tgcactttca gagttatcgg 120
tgttaaggga gtctgacaaa tttgatgttg atgttttttc ccagatgtgc caatctttgg 180
aagttgaccc aatgacggca gcgaaggtta tagtcgcggt catgagcaat gagagcggtc 240
tgactctcac ttttgaacga cctactgagg cgaatgttgc gctagcttta caggatcaag 300
agaaggcttc agaaggtgct ttggtagtta cctcaagaga agttgaagaa ccgtccatga 360
agggttcgat ggccagagga gagttacaat tagctggtct tgctggagat catccggagt 420
cgtcctattc taagaacgag gagatagagt ctttagagca gtttcatatg gcaacggcag 480
attcgttaat tcgtaagcag atgagctcga ttgtgtacac gggtccgatt aaagttcagc 540
aaatgaaaaa ctttatcgat agcctggtag catcactatc tgctgcggtg tcgaatctcg 600
tcaagatcct caaagataca gctgctattg accttgaaac ccgtcaaaag tttggagtct 660
tggatgttgc atctaggaag tggttaatca aaccaacggc caagagtcat gcatggggtg 720
ttgttgaaac ccacgcgagg aagtatcatg tggcgct 757

Claims (7)

1.一种RNAi纳米制剂，其特征在于：所述RNAi纳米制剂由dsRNA和壳聚糖纳米材料制备而成，其中：dsRNA为筛选所得长度为313bp的高抗TMV的RdRP3基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述壳聚糖和1μg/μl的dsRNA的体积比是10：1-6。
2.根据权利要求1所述的一种RNAi纳米制剂，其特征在于：所述dsRNA的靶标基因为TMV基因中RNA依赖的RNA聚合酶蛋白基因即RdRP3基因。
3.制备权利要求1或2所述RNAi纳米制剂的方法，其特征在于：将dsRNA溶液按照比例滴加到壳聚糖纳米材料溶液中混匀，将含有dsRNA的壳聚糖溶液按2:1比例缓慢加入到1％SDS溶液中，震荡10min，dsRNA包裹在壳聚糖内部，形成直径为100-200nm的类球体；其中：所述dsRNA溶液的浓度为1μg/μl；所述壳聚糖纳米材料溶液为将壳聚糖溶解于冰乙酸中，壳聚糖纳米材料溶液的终浓度为2μg/μl。
4.根据权利要求3所述的制备RNAi纳米制剂的方法，其特征在于：dsRNA溶液的制备方法具体步骤如下：
(1)提取经TMV侵染的烟叶总RNA，以提取的总RNA为模板进行逆转录，获得cDNA；
(2)选择与TMV在植物体内复制增殖移动相关蛋白的基因，以TMV CP蛋白的表达量为指标进行real-time RT-PCR和Western Blot验证，筛选得到高抗性的长度为313bp的RdRP3基因；
(3)以cDNA为模板，设计RdRP3序列的特异性扩增引物，用其特异性引物扩增目的基因片段；
(4)以特异性扩增所得目的基因片段为模板，体外合成dsRNA。
5.根据权利要求4所述的制备RNAi纳米制剂的方法，其特征在于：提取经TMV侵染的烟叶总RNA的方法为Trizol抽提法。
6.根据权利要求4所述的制备RNAi纳米制剂的方法，其特征在于：所述RdRP3序列的特异性扩增引物，其上下游引物序列如SEQ ID NO.2-3所示的DNA序列。
7.权利要求1所述的RNAi纳米制剂在TMV防治中的应用，其特征在于：所述RNAi纳米制剂的使用方法为：将成品溶液均匀涂抹或喷施在植物叶片上。
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