CN101186629A

CN101186629A - 一种利用RNAi培育抗CMV和TMV植物的方法及其专用双链RNA

Info

Publication number: CN101186629A
Application number: CNA2007101879139A
Authority: CN
Inventors: 颜培强; 郭兆奎; 万秀清; 储成才
Original assignee: HEILONGJIANG PROV INST OF TOBACCO SCIENCES
Current assignee: HEILONGJIANG PROV INST OF TOBACCO SCIENCES
Priority date: 2007-11-15
Filing date: 2007-11-15
Publication date: 2008-05-28
Anticipated expiration: 2027-11-15
Also published as: CN101186629B

Abstract

本发明公开了一种利用RNAi培育抗CMV和TMV植物的方法及其专用双链RNA。该双链RNA，是由正义链和反义链组成的双链RNA；所述正义链的序列是序列表中序列3，或在严格条件下可与序列表中序列3限定的RNA序列杂交的核苷酸序列；所述反义链的核苷酸序列是序列表中序列4，或在严格条件下可与序列表中序列4限定的RNA序列杂交的核苷酸序列。该培育抗CMV和TMV植物的方法，是将含有上述双链RNA编码基因的重组表达载体导入植物中，得到抗CMV和TMV的植物。该双链RNA可降解目的RNA，提高植物抗CMV和TMV的能力。通过RNA干扰来增强植物的抗病性，避免了其mRNA的翻译，不产生病毒蛋白，避免了安全性方面的问题。

Description

一种利用RNAi培育抗CMV和TMV植物的方法及其专用双链RNA

技术领域

本发明涉及一种利用RNAi培育抗CMV和TMV植物的方法及其专用双链RNA。

背景技术

烟草花叶病包括烟草普通花叶病[Tobacco mosaic virus(TMV)]和黄瓜花叶病[Cucumber mosaic virus(CMV)]，是我国烟区的主要病毒病害，影响烟叶产量和品质，造成严重经济损失。由于对植物病毒病害还缺乏有效的防治药剂，而且TMV病毒存活期长、汁液传毒易于病害的传播；而CMV侵染寄主来源广泛，有翅蚜虫传播利于病害的快速流行，加之烟草对两种病害的抗原狭窄，且与劣质基因连锁，常规育种手段很难育成优质、多抗的烟草品种。目前烟叶生产中所应用的主栽品种大多为中抗或感病品种，更没有能够兼抗两种病毒的品种，所以应用现代生物技术手段挖掘新的抗病毒方法具有重要意义。

利用双链RNA(dsRNA)介导的干扰机制可以将任何目的基因序列插入RNA干涉载体，并获得基因沉默效应。当dsRNA进入细胞后，被一种dsRNA特异的核酶内切酶Dicer识别，切割成21～23bp的小片段，siRNA与RNA诱导的沉默复合体结合，并且作为模板识别目的mRNA；然后mRNA与dsRNA的正义链发生链互换，原先dsRNA中的正义链被mRNA代替，从dsRNA复合体中释放出来，而mRNA则处于原先的正义链的位置；Dicer在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21～23bp的dsRNA小片段，与特异的核酶内切酶RISC结合，再次对目标RNA进行切割，从而使目的基因沉默。从作用机制上也是细胞抵御外来基因的一种手段。

Powell等(Powell ABEL P，Nelson R S，De B，et al.Delay of disease development intransgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene.Science，1986，232：738～743)首次将TMV外壳蛋白(Coatprotein，CP)基因转入烟草，培育出能稳定遗传的抗病毒植株，但后来研究发现外壳蛋白基因介导的抗病性主要在病毒侵染早期起作用，推迟发病，在侵染基数较高、有反复再侵染的情况下不能有效地控制病害的危害。

发明内容

本发明的目的是提供一种双链RNA。

本发明所提供的双链RNA，名称为TMV-CMV-RNAi，是由正义链和反义链组成的双链RNA；所述正义链为下述1)或2)的RNA片段：

1)其核苷酸序列是序列表中序列3；

2)在严格条件下可与序列表中序列3限定的RNA序列杂交的核苷酸序列；

所述反义链为下述3)或4)的RNA片段：

3)其核苷酸序列是序列表中序列4；

4)在严格条件下可与序列表中序列4限定的RNA序列杂交的核苷酸序列。

上述双链RNA的编码基因也属于本发明的保护范围。

上述双链RNA的编码基因，其特征在于：所述正义链的编码序列为如下a)或b)的DAN片段：

a)其核苷酸序列是序列表中序列5；

b)在严格条件下可与序列表中序列5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

所述反义链的编码序列为如下c)或d)的DNA片段：

c)其核苷酸序列是序列表中序列6；

d)在严格条件下可与序列表中序列6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

含有上述双链RNA编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗CMV和TMV植物的方法。

本发明所提供的培育抗CMV和TMV植物的方法，是将含有上述双链RNA编码基因的重组表达载体导入植物中，得到抗CMV和TMV的植物。

本发明的培育抗CMV和TMV植物的方法，适合于CMV或TMV能侵染的各种植物，包括单子叶或双子叶植物、草本、灌木或木本植物等，如烟草。

本发明将CMV和TMV各株系外壳蛋白基因的保守区作为靶序列设计了双链RNA，实验证明该双链RNA可降解目的RNA，提高植物抗CMV和TMV的能力。通过RNA干扰来增强植物的抗病性，避免了其mRNA的翻译，不产生病毒蛋白，避免了安全性方面的问题。

附图说明

图1为重组表达载体pUCCRNAi-2TC的物理图谱

图2为重组表达载体pUCCRNAi-2TC经Pst I酶切后的酶切鉴定结果

图3为转基因植株的实时PCR扩增CMV CP片段曲线图及标准曲线图

图4为转基因植株的实时PCR扩增TMV CP片段曲线图及标准曲线图

图5为导入本发明的双链RNA编码基因的重组表达载体pUCCRNAi-2TC的转化材料(S3，S4，S5)与对照材料(S2)攻毒后抗病性表型比较

图6为表达载体pUCC2300-35S-OCS的物理图谱

图7为获得的TMV和CMV外壳蛋白干涉靶序列片段的PCR产物

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、用于培育抗CMV和TMV烟草的双链RNA(TMV-CMV-RNAi)及其编码DNA的合成

1、针对RNA干涉靶序列DNA的合成

采集烟草的烟草普通花叶病病叶(TMV)和黄瓜花叶病病叶(CMV)，分别提取其总RNA。用Promega公司的反转录试剂盒(Reverse Transcription system)反转录合成cDNA第一链。根据已报道的TMV-cp和CMV-cp序列设计阅读框引物，分别进行PCR。其中，用于扩增TMV-cp的引物：TMV1：5’GTCTTACAGTATCACTACTC 3’和TMV2：

5’ACGTGCCTGCGGATGTATAT 3’，得到的序列如序列表中序列1；用于扩增CMV-cp的引物：CMV1：5’ATCAACCAGTGCTGGTCGTA 3’和CMV2：5’GATGGCGGCAACGGATAA3’，得到的序列如序列表中序列2。将得到的TMV-cp序列和CMV-cp序列输入NCBI进行不同株系序列比对，找出保守序列区域，确定RNA干涉的靶序列，其中，TMV干涉的靶序列如序列表中序列7，CMV干涉的靶序列如序列表中序列8，设计其PCR扩增引物。其中，扩增TMV RNA干涉靶序列的引物为TMV-F：5’-TAGTCGACGTGTTCTTGTCATCAGCGTG-3’和TMV-R：5’ATGGATCCGTAGCATCTAACGTTTCGGC-3’，上下游引物的5′端各引入Sal I和BamH I；扩增CMV RNA干涉靶序列的引物为CMV-F：

5’GGAGATCTAACTTTAGAGTCCTGTCGC3’和CMV-R：

5’GTGGATCCTTATCGAACTCAGTGACTG3’，上下游引物的5′端各引入Bgl II和Bam HI位点。以上述第一链cDNA为模板，分别以TMV-F和TMV-R、CMV-F和CMV-R为引物进行PCR，扩增得到的核苷酸序列命名为TMV-cpi(核苷酸序列如序列7所示)和CMV-cpi(核苷酸序列如序列8所示)。扩增条件为：94℃变性1min，65℃退火40S，72℃延伸1min，共35个循环。72℃后延伸10min。4℃保温。其中，TMV-cpi和CMV-cpi的PCR扩增结果如图7所示，表明得到302bp的TMV-cpi和213bp的CMV-cpi。图7中，1-6为TMV-cpi凝胶电泳结果，7-12为CMV-cpi的凝胶电泳结果，M为DNA分子量标准。

2、TMV-CMV-RNAi干涉表达载体pUCCRNAi-2TC的构建

(1)TMV-cpi和CMV-cpi片段的连接

将TMV-cpi和CMV-cpi的PCR产物分别插入到pMD18-T(购自大连TaKaRa公司)中得到重组载体pMD18-TMV-cpi和pMD18-CMV-cpi。然后用BglII和Eco RI酶切pMD18-CMV-cpi，回收213bp的CMV-cpi片段；用Bam HI及Eco RI酶切pMD18-TMV-cpi，回收含有302bp的TMV-cpi片段的载体片段，与上述CMV-cpi片段连接，得到重组载体pMD18-TMV-cpi-CMV-cpi。用SalI和Bam HI酶切pMD18-TMV-cpi-CMV-cpi，回收含有TMV-cpi-CMV-cpi的大小为515bp的片段。

(2)构建RNA-TMV-cpi-CMV-cpi干涉载体

pUCCRNA干涉载体用XhoI和BglII酶切，回收载体，将上述515bp片段正向连接至酶切后的pUCCRNA干涉载体的XhoI和BglII位点间，得到重组载体pUCC-TMV-CMV。用SalI和Bam HI酶切pUCC-TMV-CMV，得到515bp的TMV-cpi-CMV-cpi片段。

TMV-cpi-CMV-cpi片段的核苷酸序列如序列表中的序列5。

(3)将反向序列连接至RNA干涉载体

用Sal I和Bam HI酶切pMD18-TMV-cpi-CMV-cpi，回收含有TMV-cpi-CMV-cpi的515bp左右的片段，用SalI和BamHI酶切pUCC-TMV-CMV，回收酶切后的载体，将TMV-cpi-CMV-cpi反向连接至回收后的载体的SalI和Bam HI位点，得到重组载体pUCC-TMVcpi-CMVcpi。用Pst I酶切该载体，酶切结果表明切出1.4kb左右的片段(含有TMV-cpi-CMV-cpi反向重复序列)。即为阳性克隆。

(4)构建TMV-cpi-CMV-cpiRNA干涉表达载体

回收上述用PstI酶切pUCC-TMVcpi-CMVcpi得到的1.4kb的反向重复序列片段，将其插入用Pst I酶切的表达载体pUCC2300-35S-ocs(物理图谱如图6所示)的Pst I位点，得到重组质粒pUCCRNAi-2TC，如图1所示。对pUCCRNAi-2TC用Pst I进行酶切验证，结果如图2所示，表明得到1.4kb的目的片段。图2中M：2000bp ladder分子量标记；1：重组质粒pUCCRNAi-2TC经PstI酶切后的条带。

pUCCRNAi-2TC的测序结果表明，插入的目的片段中含有TMV-cpi-CMV-cpi片段的正向序列和反向序列，该目的片段可编码TMV-CMV-RNAi的正义链(核苷酸序列如序列3所示)和TMV-CMV-RNAi的反义链(核苷酸序列如序列4所示)。

实施例2、培育抗CMV和TMV的转基因烟草

1、转基因烟草的获得

pUCCRNAi-2TC经热击转化法转入根癌农杆菌LBA4404中，并在含有100mg/L Kan(卡那霉素)和50mg/L利福平(Rif)的YEB培养基上筛选阳性菌株。

利用与携带有重组质粒的农杆菌共培养方法进行烤烟(Nicotiana tabacum L.)品种K326(购自中国烟草北方育种中心)转化。具体方法如下：

(1)无菌苗准备：将烟草种子在37℃浸泡过夜，再用30％的次氯酸钠消毒15min，无菌水洗3-5次，转移到装有MS固体培养基的玻璃高瓶中，光照培养。

(2)预培养：将无菌苗叶片切除边缘和中脉后切成0.5cm×0.5cm的小块，置于MS+BAP(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)培养基上预培养两天。

(3)农杆菌的准备：从平板上挑取新鲜单菌落或冻存的液体菌种，接种到2ml附加相应抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rpm，振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8。

(4)侵染：将农杆菌菌液于室温条件下，4000rpm，离心10min，沉淀悬浮于10ml MS液体培养基中，将预培养的叶片放入菌液中浸泡15min，期间轻轻摇动。

(5)共培养：取出叶片，置于无菌滤纸上吸去附着的菌液；放回MS+BAP(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)培养基上，暗处共培养两天。

(6)选择培养：将经过共培养的叶片转移到MS+BAP(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)+Kan(卡那霉素)(200mg/L)+Cef(羧苄霉素)(500mg/L)的分化培养基上，光照培养3-4周左右。

(7)继代培养：当叶盘分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织时，将这些抗性材料转移到新的分化培养基中上进行继代培养。

(8)生根培养：待不定芽长到1cm左右时，将其切下并转到MS+Kan(卡那霉素)(200mg/L)+Cef(羧苄霉素)(500mg/L)生根培养基上，2周左右长出不定根，当不定根长到2-3cm时，取出植株，彻底清除根部培养基，移入土壤中培养。

提取12株卡那霉素抗性苗的基因组DNA，利用PCR方法进行扩增。其中，利用引物TMV-F和TMV-R PCR扩增得到302bp TMV干涉靶序列，并且利用引物CMV-F和CMV-R PCR扩增得到213bp CMV干涉靶序列的植株为阳性植株。结果共得到3株阳性材料，分别命名为S3、S4、S5。

同时，按照上述方法将pUCC2300-35S-ocs转入烤烟(Nicotiana tabacum L.)品种K326，获得3株转入pUCC2300-35S-ocs的烟草，作为转空载体对照。

2、TMV和CMV抗病鉴定

将获得的PCR阳性植株移栽至温室管理。烟株团棵期称取各50g的实施例1步骤1中的经鉴定由TMV感染所致的烟草普通花叶病病叶和经鉴定由CMV感染所致黄瓜花叶病病叶，加适量石英砂一起研磨后用磷酸缓冲液(pH7.0)稀释制成汁液，在转pUCCRNAi-2TC烟草S3、S4、S5和未转基因烟草S2的新叶上进行摩擦接种，调查各植株TMV和CMV的发病情况。

1)应用RT-PCR和荧光定量PCR方法进行干涉效果定量分析

在本实验中，对TMV-cp和CMV-cp基因的表达采用荧光定量RT-PCR来进行分析。荧光定量PCR技术具有很高的灵敏度，可以检测低于100个拷贝的mRNA的表达。而且操作简便，快速，有利于对样本建立动态观测。由于mRNA采用RT-PCR进行定量分析，还应该考虑反转录效率和mRNA的降解等问题。该实验通过避免样品间操作方法的差异和模板间的差异而减少试验结果的误差。通过稀释目的基因的PCR产物，建立了稳定的，相关性好的标准曲线。这样，可以保证检测的准确度。

用RNeasy Plant Mini提取试剂盒，分别提取接种TMV和CMV病毒的转pUCCRNAi-2TC烟草(S3、S4、S5)、接种TMV和CMV病毒的转pUCC2300-35S-ocs烟草(S2)和未转基因未感染TMV和CMV烟草(S1)的总RNA，反转录合成cDNA第一链。利用TaKaRa RNA PCRKit试剂盒，以cDNA第一链为模板，分别以TMV-F、TMV-R和CMV-F、CMV-R为引物PCR扩增TMV-cpi和CMV-cpi序列。利用Opticon TM 2荧光定量PCR检测系统进行TMV-cp和CMV-cp的mRNA含量分析。以起始拷贝数分别为10⁵(T5)、10⁴(T4)、10³(T3)、10²(T2)和10¹(T1)个TMV-cpi和CMV-cpi为标准品，分别作标准曲线。

通过测定PCR产物的OD值计算产物的拷贝数，具体计算方法如下：

拷贝数计算公式：

(6.02×10²³拷贝数/摩尔)×(DNA浓度g/ml)/(MWg/mol)＝拷贝数/ml.

DNA浓度mg/ml＝(OD₂₆₀)×50mg/ml

MW g/mol(平均分子量)＝片段碱基数×660道尔顿/bp

荧光定量PCR扩增中以SYBRGreen I为荧光染料，PCR体系(25μl)：引物(10pmol/μl)各0.5μl，dNTPS(10mM)1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，模板DNA 1μl，SYBGREENI(10X)0.15μl。PCR反应条件为：先94℃预变性5min；再94℃变性1min，64℃退火1min，72℃延伸1.5min，32个循环；最后72℃延伸10min。

对TMV-cpi(图3)和CMV-cpi(图4)的实时PCR扩增曲线图、标准曲线及拷贝数(表1)进行分析。TMV-cpi的标准曲线方程为y＝-0.22x+3.44，偏相关系数为r²＝0.990；CMV-cpi的标准曲线方程y＝-0.24x+8.70，偏相关系数为r²＝0.995。两个标准曲线具有很好的线性关系，所以，实验结果能够反映出不同样品之间的差异。从结果上看，接种TMV和CMV病毒的对照材料S2的TMV和CMV的病毒RNA在烟株体内迅速积累，S2的TMV和CMV的拷贝数都明显高于转化材料S3，S4，S5。说明TMV-CMV-RNAi编码基因已经在烟草植株内表达出本发明的双链RNA，侵入的病毒RNA靶序列大部分被烟株体内的RNA小片段降解。

表1.各样品的Ct值及起始拷贝数(TMV和CMV)

样品	Ct值		起始拷贝数
样品	Ct值		起始拷贝数		TMV	CMV	TMV	CMV
S1S2S3S4S5T1T2T3T4T5	34.5020.924.1924.8426.0416.0220.2123.4928.3433.18	013.8924.0925.2325.0215.1719.4522.5627.6333.04	36059102171937510⁵10⁴10³10²10¹	0167514259241942110⁵10⁴10³10²10¹	TMV	CMV	TMV	CMV

2)发病情况

接种病毒15天后S2出现轻微的花叶症状，20天时出现明显的叶片卷曲、黄化症状；转化材料S3在15天时未见发病。一个月后对照烟株S2出现全株花叶、叶片呈蕨叶、植株严重矮化。而转化植株则只有一株S5出现花叶，其余S3、S4均未发病，对CMV和TMV表现免疫(图5)。说明CMV和TMV外壳蛋白的RNA干涉序列已经在T₀代转化材料中得到很好的表达，其CMV和TMV干涉序列已经转移到了烟草的基因组。

序列表

<160>8

<210>1

<211>633

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gtcttacagt atcactactc catctcagtt cgtgttcttg tcatcagcgt gggccgaccc 60

aatagagtta attaatttat gtattaatgc cttaggaaat cagtttcaaa cacaacaagc 120

tcgaactgtc gttcaaagac aattcagtga ggtgtggaaa ccttcaccac aagtaactgt 180

taggtttcct gacagtgact ttaaggtgta caggtacaat gcggtattag actcgctagt 240

cacagcactg ttaggtgcat tcgacactaa aatagaataa tagatgttga aaatcaggcg 300

aaccccacga ctgccgaaac gttagatgct acccgtagag tagatgacgc aacggtggcc 360

ataaggagcg ctataaataa tttaatagta gaattgatca gaggaaccag atcttataat 420

cggagctctt tcgagagctc ttatggtttg gtttggacct ctggtcctgc aacttgaggt 480

attcaagatg cataataaat aacggattgt gtccgtaatc acacgtgatg cgtacgataa 540

cgcatagtgt ttttccctcc acttaaatcg aagggttgtg tcttggatcg cgcgggtcaa 600

atgtatatgg ttcatataca tccgcaggca cgt 633

<210>2

<211>403

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atcaaccagt gctggtcgta accgtcgacg tcgtccgcgt cgtggttccc gctccgcccc 60

ctcctccgcg gatgctaact ttagagtctt gtcgcagcag ctttcgcgac ttaataagac 120

gttagcagct ggtcgtccaa ctattaacca cccaaccttt gtagggagtg aacgctgtag 180

acctgggtac acgttcacat ctattaccct aaagccacca aaaatagacc gtgggtctta 240

ttacggtaaa aggttgttac tacctgattc agtcacggaa tatgataaga agcttgtttc 300

gcgcattcaa attcgagtta atcctttgcc gaaatttgat tctaccgtgt gggtgacagt 360

ccgtaaagtt cctgcctcct cggacttatc cgttgccgcc atc 403

<210>3

<211>515

<212>RNA

<213>人工序列

<400>3

uaacuuuaga guccugucgc aacagcuuuc gcgacuuaau aagacguuag cagcuggucg 60

uccaacuauu aaccacccaa ccuuuguggg uagugaacgc uguagaccug gguacacguu 120

cacaucuaua acccuuaagc cuccgaaaau agaccguggg ucuuauuaug guaaaagguu 180

gcugcuuccu gauucaguca cugaguucga uaacguguuc uugucaucag cgugggccga 240

cccaauagag uuaauuaauu uauguauuaa ugccuuagga aaucaguuuc aaacacaaca 300

agcucgaacu gucguucaaa gacaauucag ugaggugugg aaaccuucac cacaaguaac 360

uguuagguuu ccugacagug acuuuaaggu guacagguac aaugcgguau uagacucgcu 420

agucacagca cuguuaggug cauucgacac uaaaauagaa uaauagaugu ugaaaaucag 480

gcgaacccca cgacugccga aacguuagau gcuac 515

<210>4

<211>515

<212>RNA

<213>人工序列

<400>4

guagcaucua acguuucggc agucgugggg uucgccugau uuucaacauc uauuauucua 60

uuuuaguguc gaaugcaccu aacagugcug ugacuagcga gucuaauacc gcauuguacc 120

uguacaccuu aaagucacug ucaggaaacc uaacaguuac uuguggugaa gguuuccaca 180

ccucacugaa uugucuuuga acgacaguuc gagcuuguug uguuugaaac ugauuuccua 240

aggcauuaau acauaaauua auuaacucua uugggucggc ccacgcugau gacaagaaca 300

cguuaucgaa cucagugacu gaaucaggaa gcagcaaccu uuuaccauaa uaagacccac 360

ggucuauuuu cggaggcuua aggguuauag augugaacgu guacccaggu cuacagcguu 420

cacuacccac aaagguuggg ugguuaauag uuggacgacc agcugcuaac gucuuauuaa 480

gucgcgaaag cuguugcgac aggacucuaa aguua 515

<210>5

<211>515

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gtagcatcta acgtttcggc agtcgtgggg ttcgcctgat tttcaacatc tattattcta 60

ttttagtgtc gaatgcacct aacagtgctg tgactagcga gtctaatacc gcattgtacc 120

tgtacacctt aaagtcactg tcaggaaacc taacagttac ttgtggtgaa ggtttccaca 180

cctcactgaa ttgtctttga acgacagttc gagcttgttg tgtttgaaac tgatttccta 240

aggcattaat acataaatta attaactcta ttgggtcggc ccacgctgat gacaagaaca 300

cgttatcgaa ctcagtgact gaatcaggaa gcagcaacct tttaccataa taagacccac 360

ggtctatttt cggaggctta agggttatag atgtgaacgt gtacccaggt ctacagcgtt 420

cactacccac aaaggttggg tggttaatag ttggacgacc agctgctaac gtcttattaa 480

gtcgcgaaag ctgttgcgac aggactctaa agtta 515

<210>6

<211>515

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

taactttaga gtcctgtcgc aacagctttc gcgacttaat aagacgttag cagctggtcg 60

tccaactatt aaccacccaa cctttgtggg tagtgaacgc tgtagacctg ggtacacgtt 120

cacatctata acccttaagc ctccgaaaat agaccgtggg tcttattatg gtaaaaggtt 180

gctgcttcct gattcagtca ctgagttcga taacgtgttc ttgtcatcag cgtgggccga 240

cccaatagag ttaattaatt tatgtattaa tgccttagga aatcagtttc aaacacaaca 300

agctcgaact gtcgttcaaa gacaattcag tgaggtgtgg aaaccttcac cacaagtaac 360

tgttaggttt cctgacagtg actttaaggt gtacaggtac aatgcggtat tagactcgct 420

agtcacagca ctgttaggtg cattcgacac taaaatagaa taatagatgt tgaaaatcag 480

gcgaacccca cgactgccga aacgttagat gctac 515

<210>7

<211>302

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cgtgttcttg tcatcagcgt gggccgaccc aatagagtta attaatttat gtattaatgc 60

cttaggaaat cagtttcaaa cacaacaagc tcgaactgtc gttcaaagac aattcagtga 120

ggtgtggaaa ccttcaccac aagtaactgt taggtttcct gacagtgact ttaaggtgta 180

caggtacaat gcggtattag actcgctagt cacagcactg ttaggtgcat tcgacactaa 240

aatagaataa tagatgttga aaatcaggcg aaccccacga ctgccgaaac gttagatgct 300

ac 302

<210>8

<211>213

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

taactttaga gtcctgtcgc aacagctttc gcgacttaat aagacgttag cagctggtcg 60

tccaactatt aaccacccaa cctttgtggg tagtgaacgc tgtagacctg ggtacacgtt 120

cacatctata acccttaagc ctccgaaaat agaccgtggg tcttattatg gtaaaaggtt 180

gctgcttcct gattcagtca ctgagttcga taa 213

Claims

1.一种双链RNA，是由正义链和反义链组成的双链RNA；所述正义链为下述1)或2)的RNA片段：

1)其核苷酸序列是序列表中序列3；

所述反义链为下述3)或4)的RNA片段：

3)其核苷酸序列是序列表中序列4；

2.权利要求1所述双链RNA的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述正义链的编码序列为如下a)或b)的DNA片段：

a)其核苷酸序列是序列表中序列5；

所述反义链的编码序列为如下c)或d)的DNA片段：

c)其核苷酸序列是序列表中序列6；

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.根据权利4所述的载体，其特征在于：所述重组表达载体为如图1所示的pUCCRNAi-2TC。

6.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

7.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

8.一种培育抗CMV和TMV植物的方法，是将权利要求4或5所述的含有所述双链RNA编码基因的重组表达载体导入植物中，得到抗CMV和TMV的植物。

9.根据权利8所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物。

10.根据权利9所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为烟草。