CN103451229A - 一种抗玉米矮花叶病RNAi载体的构建及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，发明人在分析我国甘蔗花叶病毒（SCMV）基因组群体变异的基础上，将CI、NIb和CP3个基因的部分片段克隆到载体pCambia3301,构建了RNAi载体p3301-SCMVCINIb1CPRi。该载体转化大肠埃希氏菌后在中国普通微生物保藏管理中心（CGMCC）保藏，其保藏编号为CGMCC NO.4356。利用该载体转化玉米可以培育对高抗矮花叶病的转基因玉米植株。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种RNA干扰（RNAi）载体，特别涉及一种抗玉米矮花叶病的RNAi载体。
背景技术
玉米矮花叶病（Maize dwarf mosaic，MDM）在我国玉米上发生普遍，是玉米生产中面临的一个重要问题。引起我国玉米矮花叶病的毒原主要是甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaicvirus，SCMV）。SCMV属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus），在自然界中主要通过蚜虫和种子传播，侵染甘蔗和玉米等禾本科作物。SCMV的基因组由一条正单链RNA分子组成，有一个大的开放阅读框（ORF），可表达产生一个多聚蛋白，然后经翻译切割成10个成熟蛋白。我国玉米上发生的SCMV大多属于MDB株系。但近年在山东、河北等地还出现了一个国内外未见报道的新株系，可以侵染我国大多数主栽玉米品种。
种植抗病品种是防治玉米矮花叶病最有效的措施。但在培育抗病品种时面临选育周期长、抗病基因匮乏及病毒变异会导致寄主抗病性丧失等问题。利用RNAi技术，通过基因工程手段可以在较短时间内获得抗病毒材料。
RNAi是真核生物体内发生的、基于核酸序列同源性的一种基因表达调控机制。双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）是RNAi起始的关键因子。它首先被Dicer酶降解为3′-端具有2nt突出的21-26nt的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），后者整合入RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），并指导RISC对同源RNA进行识别和切割，最终导致RISC降解靶标mRNA。
形成dsRNA的有效途径之一是将体外构建的反向重复结构（inverted repeats，IR）转入植株。转入植物的反向重复序列在植物体内转录形成dsRNA后，启动RNAi，可有效控制与转基因有同源性的入侵病毒。反向重复结构由一段间隔序列（spacer）连接两段反向互补序列构成，转录后会形成发夹状RNA（hairpin RNA，hpRNA）。hpRNA由茎（stem，是反向互补序列转录的RNA配对形成的双链）和环（loop，是由spacer转录的RNA单链结构）组成。hpRNA中的茎是诱发序列特异性基因沉默的关键部份，茎的长短影响RNA沉默的效率和稳定性，植物中50-1000bp的dsRNA同源片段均能高效诱发转录后基因沉默。转化IR获得的抗病植株比例和抗病程度高于转正义或反义基因。
RNAi的效率还取决于IR的茎与入侵病毒核酸一致率的高低。转基因与入侵病毒基因组核苷酸一致率越高，则抗病效果越好。植物RNA病毒在自然界中是以准种形式存在，同一种病毒的基因组可能有一定程度的变异。在构建RNAi载体时，需要针对不同病毒找到最保守的基因，筛选最有效的片断作为靶标。
应用RNAi技术培育抗甘蔗花叶病毒的玉米植株，可为有效控制玉米矮花叶病提供帮助。
发明内容
基于上述原因，发明人在分析引起我国玉米矮花叶病的SCMV基因组群体结构的基础上，从其CI、NIb和CP等基因中筛选到诱导RNAi最有效的3个片段，其序列分别如Seq ID No.2、Seq ID No.3和Seq ID No.4所示，其中CI位于SCMV BD8全序列中的4878-5430bp，NIb位于全序列的7652-7892bp，CP位于全序列的9008-9303bp，具体如下表：
根据上述的三个片段，发明人通过融合PCR构建反向重复序列，通过NcoI/BstEII双酶切将反向重复序列插入双元表达载体pCAMBIA3301，从而获得了针对甘蔗花叶病毒的RNAi载体p3301-SCMVCINIb1CPRi。将该载体转化玉米，获得了对矮花叶病有良好抗性的转基因玉米植株。
本发明所提供的RNAi载体p3301-SCMVCINIb1CPRi转化大肠埃希氏菌(EC3301-SCMVCINIb1CPRi)后保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
保藏信息
保藏时间：2010年11月22日
保藏单位名称：中国普通微生物保藏管理中心CGMCC
保藏编号：CGMCC NO.4356
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 中科院微生物研究所
分类命名:大肠埃希氏菌（Escherichia coli）
附图说明
图1、本发明构建的反向重复片段及所用引物示意图
图2、单片段的扩增，泳道1-3分别为CI、NIb和CP片段
图3、正向片段的融合扩增，泳道1为CINIb1CP
图4、反向片段的扩增，泳道1分别为R-CINIb1CP
图5、RNAi载体p3301-SCMVCINIb1CPRi的双酶切鉴定的电泳图
泳道1为p3301-SCMVCINIb1CPRi质粒，泳道2为p3301-SCMVCINIb1CPRi用NcoI/BstEII双酶切产物，其中箭头指示的是本发明构建的反向重复片段。
图6、RNAi载体p3301-SCMVCINIb1CPRi的PCR鉴定的电泳图
泳道1、2同为p3301-SCMVCINIb1CPRi质粒PCR扩增产物，泳道3为以pCAMBIA3301为对照进行PCR扩增。
图7、转化p3301-SCMVCINIb1CPRi并诱导生根后的转基因玉米苗
图8、抗病性鉴定
左为非转基因植株，接种后表现明显的矮花叶症状；右为转基因植株，接种后无症状。
具体实施方式
本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如下表：
| 引物编号 | 序列（5'-3'） | Seq ID No |
| 1 | CATGCCATGGGCGGTACCTTCACAATTGGTTAACGG | Seq ID No.5 |
| 2 | CTAAGTTCCATTCTTCCATTTCCAGCGCCCTTGCAGTC | Seq ID No.6 |
| 3 | GACTGCAAGGGCGCTGGAAATGGAAGAATGGAACTTAG | Seq ID No.7 |
| 4 | CACTAAAATGATGCATTATCACCATTGGCGAACATTC | Seq ID No.8 |
| 5 | GAATGTTCGCCAATGGTGATAATGCATCATTTTAGTG | Seq ID No.9 |
| 6 | CCAAGCTTGGGTGACCTTGCGACTAACGTCGCCA | Seq ID No.10 |
| 7 | GGGTACCCTGCGCACTGATCCTTGTTC | Seq ID No.11 |
| 8 | CATGCCATGGTTGCGACTAACGTCGCCA | Seq ID No.12 |
| 9 | TTGTATTGGACTGCAAGGGCGCT | Seq ID No.13 |
| 10 | GCTTCAGCTGCATCACTAAAATGAT | Seq ID No.14 |
引物1-6应用于单片断扩增及融合，引物7和8应用于反向片段的扩增，引物9和10应用于检测。
实施例1：单片段的扩增
1.总RNA提取及RT-PCR反应
从田间采集明显表现矮花叶症状，且经鉴定确认为感染甘蔗花叶病毒的玉米植株，按照TransZol试剂盒（Beijing TransGen Biotech Co.,Ltd）提供的方法，从玉米叶片中提取总RNA。
以植物总RNA为模板，分别以引物2、4、6为反转录引物进行反转录。反应体系如下：
混匀后42℃孵育50min，70℃孵育15min停止反应。
以所得反转录产物为模板，使用不加尾的KOD聚合酶（TOYOBO，Japan）进行单片段的PCR扩增。
CI段PCR反应体系如下：
NIb段PCR反应体系如下：
CP段PCR反应体系如下：
PCR程序如下：
2、PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
3、切胶，使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit（TransGen Biotech，China）分别回收大小为550bp（CI段）、240bp（NIb段）和300bp（CP段）的片段。使用超微量分光光度计ScanDrop250（Analytikjena，Germany）测定回收产物的核酸浓度。
实施例2：正向片段的扩增
1、采用实施例1中所获得的CI段回收产物、NIb段回收产物和CP段回收产物，并使其加入量相等（50-125ng/50μL体系），进行不加引物的后延伸。PCR体系如下：
延伸程序如下：
2、上步延伸产物取15μL为模板，使用加尾的Taq聚合酶（TaKaRa，Japan），加入引物1、6进行融合PCR扩增。PCR体系如下：
扩增程序如下：
3、琼脂糖凝胶电泳回收，将融合好的约1100bp正向片段命名为CINIb1CP。
4、取回收的融合片段CINIb1CP，连接pMD19-T simple载体（4℃，8h）。
连接体系如下：
5、连接产物通过热激法转化DH5α感受态细胞。
6、挑取单斑摇菌，碱裂解法抽提质粒。
7、NcoI/BstEII（NEB）双酶切2小时进行筛选，正确的克隆（命名为pMD19-T simple-CINIb1CP）可切出一条1100bp左右的带。
酶切体系如下：
实施例3：反向片段的扩增
以实施例2所获得的CINIb1CP：约1100bp正向片段为模板，扩增反向片段R-CINIb1CP（约900bp；比CINIb1CP少loop部分）。
PCR体系如下：
PCR程序如下：
2、琼脂糖凝胶电泳，切胶回收约900bp的片段（R-CINIb1CP）。
实施例4：反向重复片段的构建
1、实施例2中获得的pMD19-T simple-CINIb1CP质粒与实施例3中R-CINIb1CP片段用NcoI/KpnI双酶切。
酶切体系如下：
2、2小时后，从pMD19-T simple-CINIb1CP的酶切体系中回收约为4100bp的带，从R-CINIb1CP的的酶切体系中回收约为900bp的带，测定两者的浓度。
3、回收产物进行连接（使pMD19-T simple-CINIb1CP与R-CINIb1CP量的比例在1:3-1:10之间）。连接体系如下：
4、热激法转化DH5α，挑单斑摇菌。
5、碱裂解法提取质粒，NcoI/BstEII双酶切筛选，正确的克隆应切出有一条2000bp的带，质粒命名为pMD19-T simple-CINIb1CPRi。
酶切体系如下：
实施例5：反向重复载体的构建
1、将上述获得的pMD19-T simple-CINIb1CPRi与市场上直接购得的pCAMBIA3301用NcoI/BstEII双酶切。酶切体系如下：
2、电泳回收，pMD19-T simple-CINIb1CPRi回收2000bp左右的带，pCAMBIA3301回收10kb左右的带。测定回收产物的核酸浓度。
3、将pCAMBIA3301与CINIb1CPRi连接（1:3-1:10）。
连接体系如下：
4、转化DH5α，挑单斑摇菌，抽提质粒。
5、NcoI/BstEII双酶切鉴定筛选，酶切体系如下：
正确的克隆可切到有一条1980bp的带，也就是目标载体，其序列如Seq ID No.1所示。将此最终构建好的载体命名为p3301-SCMVCINIb1CPRi。
6、可以通过设计的检测引物9、10对p3301-SCMVCINIb1CPRi进行PCR检测，应扩增出250bp的片段。PCR体系如下：
PCR程序如下：
实施例6：载体转化玉米外植体及抗病性鉴定
1、分期播种玉米自交系郑58和9801等，花期时自交授粉。授粉后12-16d，取幼雌穗，逐层剥去苞叶并用75%的酒精杀菌，然后在超净工作台中削去果穗籽粒顶部约1/3，挑取1.5-2mm大小一致的幼胚接种于诱导培养基上，25°暗培养。
2、培养3-4周得到II型胚性愈伤组织，在N6培养基上继代培养，每20d继代一次。取继代5-7次培养15-18天的颗粒性良好的胚性愈伤组织，捏成3-4mm小颗粒，于轰击前4-6小时紧凑的摆放于含有0.4mol/L甘露醇高渗培养基的培养皿中心进行预处理，摆放直径为3cm左右。
3、大量提取p3301-SCMVCINIb1CPRi质粒，稀释到1000ng/μl，用GJ-1000基因枪轰击愈伤组织。轰击后的愈伤的在高渗培养基上培养16-20小时后转入恢复培养基培养4-7天。
4、恢复培养后的愈伤组织转入到含有PPT的筛选培养基中避光筛选，每代15天，连续筛选2代（浓度分别为5mg/L和10mg/L），将得到的抗性愈伤组织转入分化培养基，产生的抗性苗在生根壮苗培养基上培养，待有1～3条主根并有次生根生长时移入营养土中，弱光培养至长出新叶后移入大田，隔离种植。发育正常的植株自交结实。
5、摩擦接种发接种SCMV，放在22-25℃的温室中培养，15-21天后调查发病率。ELISA检测病毒浓度。
结果表明，非转基因植株发病率100％，转基因植株发病率33％。利用ELISA方法不能从无症转基因植株中检测到病毒。
Claims (2)
1.一种保藏编号为CGMCC NO.4356的RNAi载体p3301-SCMVCINIb1CPRi，其特征在于基因序列如Seq ID No.1所示。
2.如权利要求1所述的抗玉米矮花叶病RNAi载体在培育抗矮花叶病玉米植株中的应用。
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