CN102250942B

CN102250942B - 干扰Bx-cpl-2基因表达的dsRNA载体及其在松材线虫防治和研究中的应用

Info

Publication number: CN102250942B
Application number: CN 201110175384
Authority: CN
Inventors: 陈国华; 王殿东; 白婷; 成新跃; 梅眉; 谢丙炎
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-06-27
Filing date: 2011-06-27
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2031-06-27
Also published as: CN102250942A

Abstract

本发明“干扰Bx-cpl-2基因表达的dsRNA载体及其在松材线虫防治和研究中的应用”，属于植物病虫防治技术。所述dsRNA干扰载体，其特征在于，在骨架载体的多克隆位点上按顺序正向插入有Bx-cpl-2基因的完整或部分正义链和与所述正义链互补的反义链。可用于松材线虫的防治和研究。

Description

干扰Bx-cpl-2基因表达的dsRNA载体及其在松材线虫防治和研究中的应用

技术领域

本发明属于植物病虫防治技术领域，特别是涉及一种干扰Bx-cpl-1基因表达的dsRNA载体及其在松材线虫防治中的应用。

背景技术

松材线虫（Bursaphelenchus xylophilu）是一种对森林具有极大危害的寄生线虫，它主要危害松属树种为代表的针叶树木。二十世纪，日本的松树感染上松材线虫后，遭到了毁灭性的破坏。在我国，松材线虫病于1982年在南京首次被发现。之后，疫情迅速蔓延，对我国的松林资源照成了极大的破坏，其经济损失难以估量，松材线虫病甚至已经直接对我国的张家界等世界自然文化遗产景观造成了威胁。

松材线虫病素有“松树的癌症”之称，因为其蔓延异常迅速，一旦发病，树木会很快死亡，因而防治难度非常之大。由于该病疫的传播和人类的活动有密切的关系，因此不少国家将其列为A类植物检疫对象。为了避免松材线虫病对我国的森林资源照成危害，对于松材线虫病的防治迫在眉睫。

松材线虫病的传播异常迅速，一旦疫情发生就难以控制。该病到目前为止仍然没有得到有效的控制。因此，要始终坚持以预防为主的政策，对于已经受灾的地区要严格控制松材线虫的蔓延。

目前，主要可以通过两种方法治疗松材线虫病。由于松材线虫在树干内部，因此可以将杀虫剂注射到树干或浇灌到根部，另一种是用飞机喷撒化学药剂来防治天牛。这两种方法有一定疗效，但是其性价比较低。对于树干注射治疗，其成本高，因此不适合大面积推广；而用飞机喷撒化学药剂来防治天牛，成本也比较昂贵，并且具有一定负面效应。

由于化学防治具有较多缺陷，因此人们开始更多地关注松材线虫的生物防治。研究显示：许多真菌对线虫的生存有抑制作用，如总状共头霉和日本亮耳菌等，但是由于松材线虫的繁殖速度惊人，生物防治的作用远远赶不上其扩散速度。

因此，已有的防治措施都无法有效防治松材线虫。我们只能寄希望于致病机理研究上的突破。目前，最经济有效的途径是利用分子生物学技术，对松树的抗性基因进行筛选，然后再通过转基因技术使松树获得对松材线虫的抗性。

半胱氨酸蛋白酶的活性位点含有半胱氨酸残基。该酶广泛存在于自然界的各种生物当中，例如细菌、真菌、植物、哺乳动物和人类等。因此，关于该酶的研究比较多。研究表明，半胱氨酸蛋白酶在线虫入侵组织或细胞、提供胚胎发育所需的营养成分^[12]、蜕皮^[13]、消化宿主蛋白、调节免疫反应以及逃避宿主免疫反应的清除^[14]等过程中发挥着至关重要的作用。

半胱氨酸蛋白酶属于蛋白水解酶的一类。该酶在生物体内最开始合成时为一种前体物质，该物质包括两个区：前体区和催化区。半胱氨酸蛋白酶家族中有高度保守的典型的三联体催化活性中心Cys-His-Asn^[15]。线虫半胱氨酸蛋白酶为线虫的主要“消化酶”，通常表达在线虫的食道腺和肠细胞中，发挥着蛋白水解活性。线虫摄取食物、入侵宿主细胞以及免疫等方面的功能均与半胱氨酸蛋白酶有密切关系，因此，近年来对该酶的研究愈加广泛深入。

研究发现，半胱氨酸蛋白酶存在于多种线虫体内，不同的线虫，分泌这种酶的部位不同，而且酶的分布部位也有所差异。有些线虫的卵母细胞中包含L型半胱氨酸蛋白酶,如秀丽隐杆线虫；在很多线虫的不同发育期，虫体肠腔内中都发现了B型和L型半胱氨酸蛋白酶，如捻转血矛线虫（Haemonchus controtus）和南方根结线虫（Meloidyne incognita）。

吕春花（吕春花．相似穿孔线虫S型半胱氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析[J]．植物保护，2008，34(5)：17-22．）等从松材线虫中分离到半胱氨酸蛋白酶家族的两个基因（Bx-cpl-1、Bx-cpl-2）并在大肠杆菌中初步表达，但并未揭示并证明这两个基因在线虫生活史中的功能。

RNA干扰（RNAi），是指由双链RNA引发的转录后基因沉默的机制。随着技术的发展，RNA干扰技术越来越受研究人员的关注。目前，RNA干扰技术已经广泛应用于线虫基因分析。Ford[33]等通过RNA干扰分析组织蛋白类半胱氨酸蛋白酶基因在马来丝虫成虫中的作用。用丝虫CPL基因家族的Bm-cpl-1和Bm-cpl-5处理马来丝虫雌雄成虫，或者用Bm-cpz-1dsRNA处理，均导致了微丝蚴数量下降。通过Bm-cpl-5或Bm-cpl的dsRNA和siRNA处理雌虫子宫，结果显示胚胎发育受到明显影响，导致晶胚畸形和不同的胚胎阶段。通过对秀丽杆线虫L型组织蛋白酶(Ce-cpl-1)和Z型组织蛋白酶(Ce-cpz-1)进行功能分析，确定了控制它们的两种基因在早期的胚胎发育中都是必要的，Ce-cpl-1在卵黄蛋白分解期间起调控作用，Ce-cpz-1在蜕皮中起重要作用。

对于RNA干扰的介导，目前，细菌介导的RNAi技术在模式线虫基因功能的研究中起到了重要的作用，成为模式线虫基因功能研究的主要方法。目前RNAi的手段也成为松材线虫基因功能的一种重要方法，但是目前所采用的都是浸泡法，体外转录合成dsRNA浸泡松材线虫来分析基因的功能，该方法存在着极大地不足，主要表现在不能持续干扰，而且极其不稳定，如何实现RNA的稳定干扰也是本发明进一步需要实现的目的。

发明内容

本发明根据上述领域存在的空白和松材线虫防治的需要，提供一种干扰松材线虫Bx-cpl-2基因表达的dsRNA载体及该载体用于防治松材线虫的方法。

干扰松材线虫Bx-cpl-2基因表达的dsRNA干扰载体，其特征在于，在骨架载体的多克隆位点上按顺序正向插入有Bx-cpl-2基因的完整或部分正义链和与所述正义链互补的反义链。

所述骨架载体为农杆菌介导的表达载体。

所述正义链的核苷酸序列如Seq ID No.4所示，所述正义链的核苷酸序列如所示Seq IDNo.5所示，所述农杆菌介导的载体为PHDT-RH，所述正义链插入在PHDT-RH的LB和RB之间的5’端多克隆位点，所述反义链插入在PHDT-RH的LB和RB之间的3’端多克隆位点，得到的dsRNA干扰载体为PHD-RH-CPL1。

转入有上述dsRNA干扰载体的菌株。

所述菌株指转入有PHD-RH-CPL2的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

上述dsRNA干扰载体在松材线虫防治中的应用。

一种研究Bx-cpl-2基因功能的新方法,其特征在于，将权利要求1～3任一所述dsRNA干扰载体转化到丝状真菌中，然后通过丝状真菌转化子的菌丝体饲喂松材线虫，观察松材线虫的表型。

所述丝状真菌指灰葡萄孢菌。

本发明的发明人对前人获得的半胱氨酸蛋白酶基因Bx-cpl-2在线虫生活史中的作用进行研究，采用该基因的部分片段构建成RNA干扰载体，并通过农杆菌介导转入灰葡萄孢菌中，然后将该转基因灰霉菌丝饲养松材线虫对松材线虫的CPL进行干扰试验，采用荧光定量PCR检测被干扰的松材线虫的半胱氨酸蛋白酶基因Bx-cpl-2的转录后表达量，结果显示，随着干扰时间的增加，半胱氨酸蛋白酶基因的转录水平逐渐降低，与对照相比，感染效果具有显著差异。半胱氨酸蛋白酶的活性测定显示，Bx-cpl-2基因的表达连续被干扰10代的松材线虫，其半胱氨酸蛋白酶的活性降低8.6%，其5天内的繁殖量降低37%，线虫体长也有明显缩短。这些实验数据说明，Bx-cpl-2基因的表达在松材线虫的胚胎发育过程中起着关键作用，因而干扰该基因的表达可以达到生物防治松材线虫的目的。

基于这些实验结果，本发明提供一种干扰松材线虫Bx-cpl-2基因表达的dsRNA干扰载体，其特点就是在骨架载体中插入有Bx-cpl-2基因的完整的或部分片段的正义链和与该正义链完全互补的反义链，关于骨架载体，本领域技术人员可能选出很多用于RNA干扰载体构建的常规骨架载体，构建方法也是顺序构建入目的干扰基因片段的正义链和反义链。可以是完整的Bx-cpl-2基因，也可以是其中的部分片段，选取Bx-cpl-2基因的完整片段还是其中的哪一部分片段与所选用的骨架载体所具备的酶切位点有关，这种选取工作是本领域技术人员所具备的常规技能。

本发明优选骨架载体为农杆菌介导的表达载体，农杆菌能够携带目的基因转移到多种生物体内，除了自然界的植物之外，还包括酵母、丝状真菌以及人的细胞等。与传统的转化方法相比，AMT技术转化效率高且遗传稳定性好的优点，因此，构建成农杆菌介导的RNA干扰载体有利于使干扰片段转入到较多种类的宿主中使其表达dsRNA，用于干扰松材线虫。

本发明的优选实施方式中，以PHDT-RH为骨架载体，以Bx-cpl-2基因中的如Seq ID No.4所示的片段及其反义链为dsRNA干扰载体的核心片段构建了dsRNA干扰载体PHD-RH-CPL2。

将本发明要求保护的dsRNA干扰载体转入到真菌、植物甚至动物细胞中，用这些转化的真菌、植物或动物细胞饲喂松材线虫，其表达dsRNA与松材线虫的Bx-cpl-2相互作用使Bx-cpl-2基因的表达受到干扰从而影响松材线虫的生长发育，达到防止的目的。

本发明的实施例中，将构建的dsRNA干扰载体PHD-RH-CPL1转入到灰葡萄孢菌（灰霉）中，获得了可用于干扰松材线虫Bx-cpl-2基因表达的灰霉转化子。

本发明的了一个贡献还在于，提供了一种研究Bx-cpl-2在松材线虫生长发育过程中的功能的研究方法，即将上述dsRNA干扰载体转入到松材线虫喜好的丝状真菌中，然后用丝状真菌转化子的菌丝体饲喂各阶段的松材线虫，观察松材线虫的生长发育情况。

附图说明

图1.农杆菌介导丝状真菌转化载体pDHt/hph结构示意图；

图2.原生质体转化丝状真菌RNAi载体Psilent-1结构示意图；

图3.载体PHD-RH结构示意图；

图4.松材线虫CPL基因部分片段的克隆产物电泳图,

M：DNA Marker2000；2：Bx-cpl-1基因正义链扩增结果；4：Bx-cpl-1基因反义链扩增结果；6：Bx-cpl-2基因正义链扩增结果；8：Bx-cpl-2基因反义链扩增结果；其余为对照。

图5.菌液PCR电泳图：

M：DNA Marker2000；2–6，Bx-cpl-1基因正义链扩增结果；8–12：Bx-cpl-1基因反义链扩增结果；14–18：Bx-cpl-2基因正义链扩增结果；其余为对照。

图6.Hind Ⅲ和Xba Ⅰ双酶切目的片段

M：DNA Marker2000；1–6：含有插入片断的载体pGM–T的酶切产物。

图7.HindⅢ和BglⅡ双酶切检测正义链

图8.HindⅢ和BglⅡ双酶切检测反义链

图9.潮霉素PCR电泳图

M：DNA Marker2000；1–3：潮霉素引物PCR；4：对照。

图10.目的片段PCR电泳图

M：DNA Marker2000；1–2：目的片段引物PCR；3：对照。

图11.干扰2代后Bx-cpl-1基因的转录水平（Bar值为标准误）

图12.干扰30代后Bx-cpl-1基因的转录水平（Bar值为标准误）

图13.干扰2代后Bx-cpl-2基因的转录水平（Bar值为标准误）

图14.干扰30代后Bx-cpl-2基因的转录水平（Bar值为标准误）

图15.干扰10代后以GLUpNA为底物的酶活性测定

◆：对照；■：干扰CPL1；△：干扰CPL2

图16.干扰35代后以GLUpNA为底物的酶活性测定

◆：对照；■：干扰CPL1；△：干扰CPL2

图17.RNA干扰影响松材线虫成虫的繁殖能力（Bar值为标准误）

图18.干扰后的松材线虫体长变化（Bar值为标准误）。

具体实施方式

以下通过试验及数据具体说明本发明的实施和其取得的有益效果。

生物材料：

松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）（US1）来自美国，本实验室已进行多年的传代培养。

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），由中国科学院微生物研究所提供。

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105，商购。

农杆菌介导丝状真菌转化载体pDHt/hph（见图1），已知载体，由中国科学院微生物研究所刘杏忠研究员惠赠。

Psilent-1，为现有已知载体，由中国科学院微生物研究所刘杏忠研究员惠赠。

申请人声明，以上生物材料均在申请人实验室有保存，可向公众发放用于验证试验。

主要仪器和试剂

仪器：Olympus实体显微镜、美国Polyscience冷冻离心机（9500）、恒温培养箱、冰箱、电子天平、高压灭菌锅、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、水浴锅、移液器、匀浆器、离心管、枪头、烧杯和pH计等。

试剂：

提RNA用的Trizol Reagent，RT-PCR反转录试剂盒购自Invitrogen公司；

SanPrep柱式DNA小量抽提试剂盒和SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒均购自生工生物工程有限公司；

TA克隆试剂盒、Tag DNA聚合酶、DNA Marker2000和克隆所用的大肠杆菌感受态细胞均购自天根生物公司；

限制性内切酶HindⅢ、BglⅡ、XbaⅠ和SpeⅠ等均购自Takara生物公司。

TAE缓冲液（50×）：Tris碱242g，冰醋酸57.1ml，0.5mol/L EDTA（pH8.0）100ml。

土豆培养基（PDA），用于培养灰葡萄孢菌：称取100g去皮马铃薯，切碎，加500ml蒸馏水，煮沸30min。用纱布滤去马铃薯，补足500ml装入三角瓶，调整pH值为6.0。再称取10g葡萄糖，7.5g琼脂粉，加入三角瓶后摇匀。121℃，20min高压蒸汽灭菌后倒入平板。

LB培养基，用于大肠杆菌蓝白斑筛选。酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。

YEM培养基，分为固体和液体两种，用于农杆菌菌体的活化：酵母粉0.2g，甘露醇5g，MgSO4·7H2O 0.1g，K2HPO4 0.25g，NaCl 0.05g，琼脂6g，溶于水，定容至500ml（液体培养基不加琼脂）。

MM培养基，为扩大培养根癌农杆菌时所用的基本培养基，500ml的配方如下：5mlK-buffer（pH7.0）：KH2PO4 145g/L，K2HPO4 200g/L；10ml M-N：NaCl 7.5g/L，MgSO4.7H2O15g/L；5ml葡萄糖20g/L（过滤灭菌后置于4℃冰箱储存）；5ml FeSO4 0.01g/L（过滤灭菌后置于4℃冰箱储存）；0.5ml CaCl2.2H2O 1g/L；2.5ml Spore Elements（CuSO4.5H2O0.1g/L，ZnSO4.7H2O0.1g/L，Na2MoO4.2H2O0.1g/L，MnSO4.H2O0.1g/L，H3BO30.1g/L）；1.25ml，NH4NO3 20g/L；470.75ml无菌水。

IM培养基，用于诱导培养根癌农杆菌，1L的配方：0.8ml 1.25M K-buffer,（将pH调至4.9）；20ml M-N：NaCl 15g/L，MgSO4.7H2O 30g/L；1ml CaCl₂.2H₂O2g/L；10ml 50%甘油；2.5ml NH₄NO₃20g/L；5ml Spore Elements；40ml MES 1M（将pH调至5.5），用NaOH调节pH值（过滤灭菌，4℃储藏）；10ml FeSO4 0.01g/L（过滤灭菌，4℃储藏）；10ml葡萄糖20g/L（过滤灭菌）；2ml AS100mM（用无水乙醇溶解，放置于-20℃）；898.7ml水。

共培养培养基（Co-IM），用于灰葡萄孢菌和根癌农杆菌进行共培养。配制时将诱导培养基IM中的葡萄糖用量减半。

卡那霉素：溶于水中，配制浓度为10mg/ml，储存于-20℃，使用时稀释为10μg/ml；

利福平：溶于甲醇中，配制浓度为10mg/ml，储存于-20℃，使用时稀释为34μg/ml；

潮霉素：50mg/ml，避光储存于4℃，使用时稀释为200μg/ml；

头孢霉素：溶于水中，200mg/ml，储存于-20℃，使用时稀释为400μg/ml。

MES缓冲液（pH5.5）：MES 0.15M，DTT 4Mm,EDTA 4mM

底物GLUpNA（0.5mg/mL）：1.5mg底物溶于1mlDMSO，用MES缓冲液稀释为0.5mg/ml。

SYBR Premix Ex Taq购自TaKaRa公司。

SYBR Mix与染料混匀：Mix 1ml，DyeⅡ200μl。

实施例1：构建农杆菌介导丝状真菌表达dsRNA的载体—PHD-RH

农杆菌介导丝状真菌转化载体PHD-T，原生质体转化丝状真菌RNAi载体Psilent-1（图2）为已知载体，由中国科学院微生物研究所刘杏忠研究员惠赠。

载体PHD-RH的构建主要以农杆菌介导丝状真菌转化载体pDHt/hph为骨架，对其T-DNA区加以改造，由上海生物工程公司合成了一段DNA序列（Seq ID No.1），其结构为KpnⅠ酶切位点、构巢曲霉色氨酸启动子、5’多克隆位点、内含子、3’多克隆位点、构巢曲霉色氨酸终止子、BstxⅠ酶切位点（5’------3’）。将该合成的序列插入载体pDHt/hph的KpnⅠ和BstxⅠ位点之间，经过阳性克隆鉴定后测序验证，得到的载体命名为PHD-R。其5’多克隆位点依次含有XhoⅠ,SnabⅠ,HindⅢ,XbaⅠ酶切位点，3’多克隆位点含有StuⅠ,SpeⅠ,BglⅡ,ApaⅠ酶切位点。在载体PHD-R上添加潮霉素抗性基因作为选择标记。设计引物HYG-F和HYG-R（两端添加KPNⅠ酶切位点）以载体pDHt/hph为模板扩增得到潮霉素抗性基因HPH。扩增产物连接于载体PHD-R，测序确认后插入到载体PHD-R的KpnⅠ酶切位点，即获得载体PHD-RH（图3），酶切鉴定阳性克隆后测序确认。

HYG-F：5’-TGGTACCTAGACGTTAACTGATATTGAA-3’

HYG-R：5’-TGGTACCTAAACCCAGGGCTGGTGACGGA-3’

实施例2松材线虫的培养和分离

1.松材线虫的培养

松材线虫用生长在PDA培养基上的灰葡萄孢菌培养。

将PDA培养基在121℃高压蒸汽灭菌20min，60℃左右时倒入培养皿；培养基冷却后，在超净台中接入灰葡萄孢菌，置于25℃恒温培养箱中培养；3到4天后，用双氧水将松材线虫消毒后接入培养皿，置于25℃恒温培养箱中培养；6到7天后，从温箱中取出培养皿置于4℃保存。

2.松材线虫的分离

将养有松材线虫的培养基用四层纱布包裹后，悬浮在盛有灭菌蒸馏水的烧杯中；将烧杯置于25℃恒温培养箱中静置24h；移走纱布和培养基，倒去上清；

将剩余液体倒入灭菌的培养皿中，用移液器在显微镜下挑取松材线虫，即可进行后续实验。

3.总RNA的提取

采用Trizol Reagent（购自Invitrogen）提取，操作参照说明书。

4.cDNA第一链的合成

合成cDNA时使用RT–PCR试剂盒(购自Invitrogen),操作参照说明书，合成的cDNA保存备用。

5.引物设计

Bx-cpl-1的cDNA全长为1220bp，GenBank ID为EU651860。

Bx-cpl-2的cDNA全长为1161bp，GenBank ID为EU659123。

这两个基因均由2个内含子和3个外显子组成。

利用DNAMAN软件分析目的片段与载体PHDT-RH上的酶切位点，筛选出目的基因中没有而载体上有的酶切位点。

在481bp处设计Bx-cpl-1正义链引物和Bx-cpl-1反义链引物，正义链引物插入HindⅢ和XbaⅠ酶切位点，反义链引物插入SpeⅠ和BglⅡ酶切位点。

在830bp处设计Bx-cpl-2正义链引物和Bx-cpl-2反义链引物，正义链引物插入HindⅢ和XbaⅠ酶切位点，反义链引物插入SpeⅠ和BglⅡ酶切位点。

表1.为Bx-cpl-1和Bx-cpl-2基因引入酶切位点的引物

实施例2.半胱氨酸蛋白酶基因部分片段的克隆

2.1.扩增目的片段

以实施例1表1中引物扩增松材线虫cDNA以获得引入四个带酶切位点的用于构建RNA干扰载体的目的片段如Seq ID No.3、4及Seq ID No.5、18：

PCR反应体系如下：

松材线虫cDNA	1μl
		10×Buffer（+Mg²⁺）	2μl
dNTPs（10mM）	1.6μl
		上游引物（10mM）	0.5μl
下游引物（10mM）	0.5μl
		Taq酶（5U/μl）	0.3μl
dd H₂O	14.1μl
		终V	20μl

PCR反应程序：94°C 4min；94°C 30sec，Tm 30sec，72°C 1min，35个循环；72°C 10min。

1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。分别得到大约350bp的四个特异性片段（图4）。

2.2回收目的片段

采用50μl体系回收目的片段，采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，回收片段放于-20℃保存。

2.3.目的片段与pGM-T载体连接

将目的片段与pGM-T载体进行连接，16℃连接12h。反应体系如下：

目的片段	7.5μl
		pGM-T载体	0.5μl
DNA连接酶（3U/μl）	1μl
		10×Ligase Buffer	1μl
终V	10μl

连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，然后采用蓝白斑筛选阳性克隆，阳性克隆在含氨苄青霉素的LB液体培基，37℃水浴中，摇床220rpm振荡培养3h。

2.4菌液PCR

将以上各管菌液进行菌液PCR，体系如下：

大肠杆菌菌液	1μl
		10×Buffer（Mg²⁺）	2μl
dNTP(10mM)	1.6μl
		上游引物(10mM)	0.5μl
下游引物(10mM)	0.5μl

Taq酶(5U/μl)	0.3μl
		dd H₂O	14.1μl
终V	20μl

菌液PCR扩增程序同2.1中的程序，引物为表1中所列。

用1%琼脂糖凝胶电泳检测菌液PCR的结果。正义链或反义链与pGM-T载体连接后转化大肠杆菌，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆进行菌液PCR，PCR结果如图5，化效率非常高，接近于100%。

实施例3.RNA干扰载体的构建

将带有Bx-cpl-1、Bx-cpl-2基因的正义链的pGM–T载与PHDT-RH载体分别用HindⅢ和XbaⅠ酶进行双酶切，带有Bx-cpl-1、Bx-cpl-2基因的正义链pGM–T载体酶切后均得到350bp左右的片段，片段大小与预期相同。回收目的片段和酶切后的载体PHDT-RH进行连接、转化、筛选阳性转化子，阳子转化子中，目的基因正义链的下游已经引入了IT（Intron）序列。送北京生工进行测序。测序正确后的插入正义链的PHDT-RH载体和目的基因反义链的PHDT-RH载体用SpeⅠ和BglⅡ酶进行双酶切。回收目的片段和酶切后的载体，连接、转化、筛选，测序。构建好的载体含有目的基因的正义链和反义链。摇菌后用质粒提取试剂盒提取质粒。具体如下：

3.1目的片段与PHDT-RH质粒双酶切

分别用HindⅢ和XbaⅠ双酶切Bx-cpl-1基因和Bx-cpl-2基因的的正义链以及PHDT-RH载体，1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。

酶切体系如下：

酶1	2.5μl
		酶2	2.5μl
BSA	5μl
		10×Buffer（T）	5μl
DNA	35μl
		终V	50μl

回收正义链片段和PHDT-RH质粒。

3.2正义链与PHDT-RH质粒连接

将回收的正义链与PHDT-RH载体连接，16℃连接过夜。连接体系如下：

正义链	13μl
		PHDT-RH	3μl
DNA连接酶（3U/μl）	1μl
		10×Ligase Buffer	3μl
终V	20μl

重组质粒转化大肠杆菌，蓝白斑筛选阳性菌落。

3.3.阳性菌落摇菌，菌液PCR，测序，提取质粒获得连有正义链的PHDT-RH质粒。

正义链测序引物IT-F：AAATGGAAGGGACTGACAAG

反义链测序引物IT-R：GAGAGGCAAGAAGAAAGGCT

3.4酶切反义链与PHDT-RH质粒

分别用SpeⅠ和BglⅡ双酶切Bx-cpl-1基因和Bx-cpl-2基因的反义链以及连有正义链的PHDT-RH载体，1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。

将回收的反义链与含有正义链的PHDT-RH载体连接，16℃连接过夜。重组质粒转化大肠杆菌，蓝白斑筛选连接入正义链和反义链的PHDT-RH质粒。

阳性菌落摇菌，进行菌液PCR，测序、提取质粒。

酶切结果显示：Bx-cpl-1或Bx-cpl-2基因的正义链与PHDT-RH连接后的阳性重组质粒，用HindⅢ和BglⅡ双酶切检测，HindⅢ位于正义链的起始部位，正义链位于intro（148bp）的上游，BglⅡ位于intro的下游，因此切下来的片段应带有正义链和intro序列及中间的酶切位点。酶切后得到凝胶电泳图显示得到550bp左右的片段，与预期相符（图7）。因此，带有正义链重组质粒可以用于进一步实验。

反义链与连接有正义链的PHDT-RH连接后的阳性重组质粒，用HindⅢ和BglⅡ双酶切连接产物检测，BglⅡ位于反义链的下游，酶切后得到900bp左右的片段（图8）表明切下来的片段按顺序带有正义链、intro序列和反义链。即Bx-cpl-1或Bx-cpl-2的正义链和反义链都连接到了PHDT-RH质粒上，至此获得两个基因的RNA干扰载体，命名为PHD-RH-CPL1和PHD-RH-CPL2。

测序验证结果显示：

由Seq ID No.8可看出：

Bx-cpl-2基因正义链测序结果中可以找到酶切位点HindⅢ(AAGCTT)、XbaⅠ(TCTAGA)和intro引物（AGAGAGGCAAGAAGAAAGGCT）。说明Bx-cpl-2基因的正义链与PHDT-RH质粒成功连接。

由Seq ID No.9可看出：

Bx-cpl-2基因反义链测序结果中可以找到酶切位点SpeⅠ（ACTAGT）、BglⅡ（AGATCT）和intro引物（AAATGGAAGGGACTGACAAG）。说明Bx-cpl-2基因的反义链与PHDT-RH质粒成功连接。

实施例4.根癌农杆菌介导灰葡萄孢菌遗传转化体系的建立

本实验以根癌农杆菌为介导，把能表达双链dsRNA的T–DNA片段（带有潮霉素抗性）转化到灰葡萄孢菌中。通过优化转化条件，成功构建了灰霉转化子。

4.1根癌农杆菌的培养

1．将根癌农杆菌划线接种在YEB培养基上，28℃恒温培养2～3天；

2．挑取单个菌落接种于基本培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h；

3．在离心管中收集菌体，加入液体诱导培养基，使OD600调节至0.20左右，28℃，200rpm振荡培养6h，OD600升高到0.4左右时即可停止。

4.2农杆菌感受态制作：

（1）挑取农杆菌EHA105单菌落，接种于20ml液体YEB培养基中（含有50mg/L的利福平），28°C，200rpm培养48h；

（2）转接500μl摇培的EHA105至50ml液体YEB（含有50mg/L的利福平）培养基中，28°C，200rpm培养至OD600值为0.6左右；

（3）将菌液冰浴30min，4°C，5000rpm离心10min，弃上清；

（4）用50ml预冷的10%的甘油悬浮菌体，4°C，5000rpm，离心10min，弃上清，收集菌体；

（5）用25ml预冷的10%的甘油悬浮菌体，4°C，5000rpm，离心10min，弃上清，收集菌体；

（6）用10ml预冷的10%的甘油悬浮菌体，4°C，5000rpm，离心10min，弃上清，收集菌体；

（7）用1-2ml预冷的10%的甘油悬浮菌体，分装50μl/管，液氮中速冻后-80°C保存。

4.3电转法转化农杆菌：

1.将1μl PHD-RH-CPL1和PHD-RH-CPL2质粒分别加入到50μl农杆菌感受态细胞中，在离心管中混匀后转移到电击杯中，冰浴30sec；

2.将电击杯放在适当的位置，按住电击按钮进行电击；

3.加500μl不含任何抗生素的YEB液体培养基，28℃，220rpm，振荡培养3h，活化菌体；

4.用灭菌枪头将菌液混匀，吸取100μl均匀涂于YEB固体培养基（卡那50mg/L和利福平50mg/L）上，28℃培养2天。

5.提取农杆菌质粒进行酶切鉴定或通过菌液PCR进行检测。

4.4侵染菌液的制备：

1．取转化后的农杆菌划线接种于YEB固体培养基上，28℃培养40h，至单菌落出现；

2．挑取单菌落接种于YEB液体培养基中，28℃，220rpm，振荡培养，OD600达到0.6左右时终止；

3．5000rpm离心10min，弃上清，沉淀物即为收集的菌体；

4．加入0.5倍体积的MS液体，用枪头吹吸使菌体悬浮。

4.5用于农杆菌介导转化的灰葡萄孢菌菌丝的获得

用接种环挑取PDA固体培养基上的灰葡萄孢菌，接种于200mlPDA液体培养基中。25℃，220rpm振荡培养2天。用灭菌的纱布过滤收集菌丝。在灭菌的研钵中加入液氮和菌丝进行研磨，充分研碎后加入适量无菌水。

4.6共培养及筛选过程

1．对共培养培养基经进行高压蒸汽灭菌，接下来必须冷却到50℃左右时才能将MES，AS，glucose，FeSO₄加进去混匀，否则这四种成份容易在高温分解或被氧化。等到培养基凝固后，在超净台中将与培养皿同等大小的灭菌滤纸条铺上，赶走滤纸与培养基之间的气泡；

2．将灰葡萄孢菌菌丝碎片和诱导后的农杆菌按4:1混合，取400μl均匀涂到固体共培养培养基上；

3．避光，23℃培养3天；

4．把培养基上的滤纸条揭下来，将反面铺到PDA培养基（头孢霉素400μg/mL、潮霉素200μg/mL）上，置于18℃培养2天；

5．把滤纸条从培养基上揭下来，将培养皿放于18℃培养1～3天，长出的菌落即为能抗头孢霉素的菌落；

6．挑取长出的抗头孢霉素的单菌落，在PDA培养基（含头孢霉素）上进行进一步筛选。为保证头孢霉素的有效性，每板需要作阴性和阳性对照。

4.7灰霉转化子的鉴定

灰霉DNA的提取：

1．将液氮和灰霉菌丝加入研钵中，充分研磨；

2．取10ml研磨好的样品加入到50ml离心管中，然后向管中加入15ml Trizol，剧烈摇动混匀，65°C水浴40min，不时摇动；

3．加入15ml酚:氯仿(1:1)溶液，颠倒混匀；室温下10000rpm离心10min；

4．取上清液至新的50ml离心管，加入15ml酚:氯仿(1:1)溶液；室温下10000rpm离心10min；

5．取上清液至新的50ml离心管，加入15ml氯仿；室温下10000rpm离心10min；

6．弃上清，加入900μl70%乙醇漂洗，室温下12000rpm离心5min；

7．将DNA重溶解于20μlTE中，–20°C贮存；

8．1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的含量及质量。

4.8潮霉素引物PCR，目的基因引物PCR：

利用构建载体时所用的半胱氨酸蛋白酶基因的引物进行PCR验证，扩增出特异性条带的即可鉴定为阳性灰霉转化子。

潮霉素引物如下：HPH-F:ACTGGTACCTAGACGTTAACT,\

PH-RCAGGTACCTAAACCCAGGGCT.

目的基因引物如下：

引物名称	核酸序列（5’-3’）
		CPL-2uF	CCAGAAGCTTTTGACTGGAGAGAAA

		CPL-2uR	AGAGCTCTAGACTCATCTCTGGCAA
CPL-2dF	AGTCACTAGTCTCATCTCTGGCAAT

CPL-2dR	TCTTCAGATCTTTGACTGGAGAGAA

PCR反应体系如下：

DNA	1μl
		10×PCR Buffer	2μl
Mg²⁺(25mM)	2μl
		dNTP(10mM)	0.4μl
上游引物(10mM)	1μl
		下游引物(10mM)	1μl
Taq酶(5U/μl)	0.4μl
		ddH₂O	12.2μl
终V	20μl

PCR反应程序：94°C 4min94°C 30sec56°C 30sec72°C 1min,35cycles;72°C 10min

结果显示：用潮霉素引物检测灰霉转化子的DNA，得到大约2000bp左右的片段（图9），由于灰霉基因组中没有潮霉素基因，因此可以确定潮霉素基因来自整合到灰霉基因组上的PHD-RH-CPL1和PHD-RH-CPL2质粒。而质粒PHDT-RH的LB和RB之间都可以整合到宿主基因组，因此初步说明正义链、反义链及intro也整合到了灰霉基因组。

进一步用Bx-cpl-1基因和Bx-cpl-2基因的正义链和反义链的引物（如表1）对灰霉转化子的DNA进行PCR扩增，均得到约350bp左右的片段（见图10）。说明正义链和反义链伴随着PHDT-RH的LB和RB之间的区域一起成功整合到了灰霉基因组中。至此，成功构建了干扰Bx-cpl-1基因和Bx-cpl-2基因的灰霉转化子。

实施例5松材线虫CPL基因的RNA干扰效应分析

在实施例4获得的阳性转基因灰霉上接种线虫，饲养一段时间后，提取线虫的RNA，反转录，通过荧光定量PCR检测Bx-cpl-1、Bx-cpl-2基因的转录水平。同时，收集一定量的线虫，匀浆离心后加入底物，测量半胱氨酸蛋白酶的活性。最后，通过统计线虫长度及线虫繁殖量观察其表型方面的变化。具体如下：

5.1荧光定量PCR检测基因表达水平转基因灰霉接种线虫

从每个基因（Bx-cpl-1基因和Bx-cpl-2基因）的阳性转化子中挑选出3个转化子，每个转化子各接种4皿，25℃恒温培养3～4天，留出1皿保种。其余3皿每皿接种200条松材线虫，25℃恒温条件下培养7～8天。收集好备用。设计qPCR引物

5.2利用DNAMAN软件分析后，每个基因各设计并合成4对qPCR引物。

将设计好的引物进行普通PCR，1%琼脂糖凝胶电泳检测引物是否可用。每个基因各筛选出一对较好的引物，即形成二聚体较少的引物。同时，筛选出一对内参引物，所用内参基因为actin，内参基因引物扩增出的片段大小为151bp。

本发明筛选用的引物qPCR引物如表2

引物名称	核酸序列（5’-3’）
		CPL1-478F	GACTGGAGAGAAAAGGGCGTT
CPL1-573R	CCGTGAGCGATTGCGTAC
		CPL2-177F	CCGAGAAAGCCCAGCAGGAT
CPL2-293R	ATTGCCTCCAGAAATGCGAC
		actin-735F	ACCGCTGCCTCCTCTTCTTC
actin-867R	TAGGTGGTCTCGTGGATACC

5.3提取线虫RNA，cDNA第一链的合成

干扰Bx-cpl-1基因的灰霉、干扰Bx-cpl-2基因的灰霉及普通灰霉均接种在PDA培养基（含潮霉素200μg/ml）上，各接种三皿。

线虫在转基因灰霉上繁殖2代之后通过实施例2中所描述的方法收集线虫，离心后取50μl提取RNA，线虫RNA提取方法同实施里2。其余保留用于后续接种，持续被转基因灰霉干扰30代后提取RNA，比较干扰效果有无变化。

提取RNA后反转录，cDNA第一链的合成方法参考实施例2。

5.4荧光定量PCR

将cDNA稀释10倍、30倍及50倍，做预实验确定最佳稀释倍数，Ct值与cDNA浓度的对数呈线性关系，使Ct值在18～22之间最佳，该值过大或过小都会降低结果的可信度。

荧光定量PCR体系如下：

cDNA	1μl
		Mix（加染料）	10.4μl
FP(10mM)	0.4μl
		RP(10mM)	0.4μl
DPECH₂O	7.8μl
		终V	20μl

采用表2中的CPL1-478F/CPL1-573R检测被转Bx-cpl-1基因的灰霉干扰的松材线虫，CPL2-177F/CPL2-293R检测被转Bx-cpl-2基因的灰霉干扰的松材线虫。每个样品做4个平行管。

结果显示:：

松材线虫在转化灰霉上繁殖2代之后，通过qPCR检测干扰后基因的转录水平，进行SPSS统计分析。图11和图13显示，转基因灰霉饲养松材线虫使其Bx-cpl-1基因的转录降低了50.1%（F=0.314，t=12.454，df=9.957，P﹤0.001），使Bx-cpl-2基因的转录降低了23.9%（F=0.049，t=5.025，df=10，P=0.001）。这说明灰霉内合成的dsRNA影响了松材线虫的基因转录，干扰效果比较显著，且Bx-cpl-1的干扰效果比Bx-cpl-2明显。

连续干扰30代后，同样通过qPCR检测干扰后基因的转录水平，进行SPSS统计分析。图12和图14显示，干扰30代后Bx-cpl-1基因的转录水平降低了56.4%（F=0.072，t=20.777，df=10，P﹤0.001），Bx-cpl-2基因的转录水平降低了31.8%（F=8.979，t=5.153，df=5.751，P=0.002﹤0.001）。

对于Bx-cpl-1基因，干扰2代和干扰30代的对照组转录水平没有显著差异（F=5.240，t=1.582，df=7.655，P=0.154﹥0.05），而实验组的转录水平有显著性差异（F=0.699，t=2.503，df=10，P=0.031﹤0.05），说明随着干扰时间的增加，Bx-cpl-1基因的转录水平逐渐降低，有一定累积效应。

对于Bx-cpl-2基因，干扰2代和干扰30代的对照组转录水平没有显著差异（F=0.933，t=-2.225，df=10，P=0.05），而实验组的转录水平有显著性差异（F=3.293，t=0.286，df=10，P=0.781﹥0.05），说明随着干扰时间的增加，Bx-cpl-2基因的转录水平也逐渐降低。

实施例6.半胱氨酸蛋白酶活性测定

收集干扰及未干扰的松材线虫，制备匀浆液，利用荧光底物GLUpNA测定半胱氨酸蛋白酶的活性，该底物被半胱氨酸蛋白酶催化水解后可产生对硝基苯胺，通过分光光度计可以检测对硝基苯胺在405nm的吸光率。

结果显示：用显色底物GLUpNA测定松材线虫半胱氨酸蛋白酶的活性，计算吸光度的变化（每15min测量的OD405减去前一次的测量值，得出6个数值后取平均值）。

连续干扰10代之后的结果显示（表3）：干扰Bx-cpl-1基因后，与对照组相比，405nm的吸光度变化从0.081降低到0.064，半胱氨酸蛋白酶活性降低了20.9%；干扰Bx-cpl-2基因后，与对照组相比，405nm的吸光度变化从0.081降低到0.074，半胱氨酸蛋白酶活性降低了8.6%（图15）。连续干扰35代之后的结果显示（表4）：干扰Bx-cpl-1基因后，405nm的吸光度变化从0.084降低到0.064，半胱氨酸蛋白酶活性降低了23.8%；干扰Bx-cpl-2基因后，与对照组相比，405nm的吸光度变化从0.084降低到0.067，半胱氨酸蛋白酶活性降低了20.2%（图16）。

表3 干扰10代后以GLUpNA为底物的酶活性测定

表4 干扰35代后以GLUpNA为底物的酶活性测定

实施例7.RNA干扰对线虫繁殖量的影响

7.1准备灰霉菌块

1.干扰Bx-cpl-1基因的灰霉、干扰Bx-cpl-2基因的灰霉及普通灰霉均接种在PDA培养基（潮霉素200μg/ml）上，各接种三皿；

2．25℃恒温培养3到4天；

3．每皿灰霉用灭菌的牙签切下1块1cm×1cm的方块，放入24孔板中，在板的边缘做好标记。

7.2接种松材线虫

1．每块灰霉上接种5条幼年雌虫和5条雄虫，所有线虫在接种之前均通过饲喂法干扰过10代；

2．用封口膜将24孔板的边缘包好；

3．置于25℃恒温培养5天，即线虫繁殖一代的时间。

7.3统计后代数量

1．向24孔板的每个孔中加入1ml无菌水，将灰霉菌块浸泡60min，充分使线虫从培养基上转移到水中；

2.弃掉培养基，取50μl线虫置于凹面载玻片上计数，共取20次，将20次的数据求和即为每孔的线虫数；

3.更换枪头，每孔分别进行计数；

4.做3个平行，6个重复；

5.利用SPSS软件分析实验组与对照组之间的差异，选择t检验进行两组数据的统计分析。

结果显示：连续干扰10代后，对松材线虫成虫繁殖的后代数量进行统计。

由图17可知与对照相比，干扰成虫的Bx-cpl-1基因可使其5天内产生后代的数目从平均156条降低到平均91条，降低了41.7%（F=1.290，t=10.112，df=34，P﹤0.001）。

与对照相比，干扰成虫的Bx-cpl-2基因可使其5天内产生后代的数目从156条降低到98条，降低了37.2%（F=0.015，t=8.325，df=34，P﹤0.001）。

说明，干扰Bx-cpl-1基因或Bx-cpl-2基因均可显著降低松材线虫成虫的繁殖量。因此，通过RNAi能使松材线虫成虫的繁殖能力被极大减弱，Bx-cpl-1基因与Bx-cpl-2基因均与松材线虫的胚胎发育有关。

实施例8RNA干扰对线虫身体长度的影响

8.1培养松材线虫

1．干扰Bx-cpl-1基因的灰霉、干扰Bx-cpl-2基因的灰霉及普通灰霉均接种

在PDA培养基（潮霉素200μg/ml）上，各接种三皿，

2．灰霉长好后每皿接种200条松材线虫；

3．取一个灭菌的1.5ml离心管，通过2.2.1.2中所描述的方法收集松材线虫，每皿收集一管，每管离心后约50μl虫体；

4．加入无菌水使虫体悬浮，终体积为2ml；

5．50℃水浴5min，杀死松材线虫。

8.2测量线虫体长

1．用100μg枪头将松材线虫混合均匀，每管随机取10μl线虫置于载玻片上，盖上盖玻片；

2．在显微镜下拍照并用标尺测量长度，由于线虫热激后的死态不呈一条直线，因此需要按照如下测量规则进行测量：2龄幼虫一般分为3段，分别测量后求和，3龄幼虫、4龄幼虫和雌虫一般分为2段，分别测量后求和，雄虫一般分为4～5段，分别测量后求和；

3．干扰5代后的及未干扰的2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫、雌虫及雄虫各测量60条，记录数据；

8.3分析数据

1．通过SPSS软件分析对照组及实验组有无显著差异，由于需要检验两组不相关的样本是否来自具有相同均值的总体，因此对两组数据进行独立样本t检验，检验步骤为：Analyze->Compare Means->Independent Samples T test；

2．观察独立样本t检验的结果，记录F、t、df、P等值；

3．计算平均值及标准误，用excel作图，作柱状图时，在图上标出bar值，bar值为标准误；作散点图时，以列表的形式给出平均值和标准误；

4．计算对照组及实验组平均值变化的百分比。

结果显示（表5，图18）：干扰Bx-cpl-2基因后，松材线虫2龄幼虫的、3龄幼虫及4龄幼虫的体长缩短程度均小于5%，与对照组之间无显著差异，雄虫的体长平均值从923.5μm缩短到883.8μm，缩短了4.3%（F=1.990，t=3.337，df=118，P=0.001），雌虫的体长平均值从1008.2μm缩短到952.0μm，缩短了5.6%（F=3.782，t=4.580，df=118，P﹤0.001），与对照组之间存在显著差异。

总体来说，干扰和未干扰的线虫体长之间存在显著性差异，Bx-cpl-1基因和Bx-cpl-2基因可能通过影响蜕皮来参与线虫的发育过程。

表5 干扰后的松材线虫体长变化

Claims

1.干扰松材线虫Bx-cpl-2基因表达的dsRNA干扰载体，其特征在于，在骨架载体的多克隆位点上按顺序正向插入有Bx-cpl-2基因的部分正义链和与所述部分正义链互补的反义链,所述部分正义链的核苷酸序列如Seq ID No.4所示，与所述部分正义链互补的反义链的核苷酸序列如Seq ID No.5所示，所述骨架载体为PHD-RH,所述PHD-RH是在载体pDHt/hph的KpnⅠ和BstxⅠ位点之间插入Seq ID No.1所示的DNA片段，经过阳性克隆鉴定后测序验证，得到的载体命名为PHD-R,在载体PHD-R上添加潮霉素抗性基因作为选择标记获得载体PHD-RH。

2.根据权利要求1所述的dsRNA干扰载体，所述部分正义链插入在PHD-RH的LB和RB之间的HindⅢ和XbaⅠ酶切位点，所述反义链插入在PHD-RH的LB和RB之间的SpeⅠ和BglⅡ酶切位点，得到的dsRNA干扰载体为PHD-RH-CPL2。

3.转入有权利要求2所述dsRNA干扰载体的菌株。

4.根据权利要求3所述的菌株，指转入有PHD-RH-CPL2的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

5.权利要求1或2所述dsRNA干扰载体在松材线虫防治中的应用，其特征在于：将所述干扰载体转入到真菌、植物或动物细胞中，用这些转化的真菌、植物或动物细胞饲喂松材线虫。

6.一种干扰松材线虫Bx-cpl-2基因功能的方法,其特征在于，将权利要求1或2所述dsRNA干扰载体转化到丝状真菌中，然后通过丝状真菌转化子的菌丝体饲喂松材线虫，观察松材线虫的表型。

7.根据权利要求6所述的方法，所述丝状真菌指灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。