CN103081928B

CN103081928B - 壳聚糖纳米粒、防治松材线虫的生物农药制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN103081928B
Application number: CN201310060948.1A
Authority: CN
Inventors: 张必良; 叶奕栋
Original assignee: GUANGZHOU RIBOBIO CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU RIBOBIO CO Ltd
Priority date: 2013-02-26
Filing date: 2013-02-26
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2033-02-26
Also published as: CN103081928A

Abstract

本发明公开了一种由以下重量百分比的原料组成的壳聚糖纳米粒：壳聚糖0.5-5％、助溶剂1-10％、防冻剂0-5％、表面活性剂0.1-1％、乳化剂0.1-0.5％、缓冲液40-60％、余量为水。还提供了一种防治松材线虫的生物农药制剂及其制备方法，其主要由以下重量百分比的成分组成：(A)0.05-15％的有效成分：针对松材线虫高效致死靶基因设计合成siRNA，所述siRNA为15-50nt的双链RNA、(B)19.95-55％溶剂、(C)30-80％所述的壳聚糖纳米粒。所述壳聚糖纳米粒使生物农药制剂的稳定性、防治松材线虫效果更好。

Description

壳聚糖纳米粒、防治松材线虫的生物农药制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于农用杀虫剂技术领域，具体涉及一种生物农药制剂及其制备方法，特别一种壳聚糖纳米粒、含有双链核糖核酸的防治松材线虫的生物农药制剂及其制备方法。

技术背景

松材线虫[Bursaphelenchusxylophilus(Steiner&Buhrer1934)Nikle1970，同物异名：AphelenchoidesxylophilusStriner&BuhrerBursaohelenchuslignicol-USMamiya&Kiyohara]引起松树萎蔫病(PineWiltDisease)是林业生产的一大重要病害，被誉为松树的癌症。可危害57种松属(Pinus)植物及雪松属(Cedrus)、冷杉属(Abies)、云杉属(Picea)、落叶松属(Larix)和黄杉属(Pseudotsuga)等14种非松属针叶树。树木感染松材线虫病后一般2-3个月内死亡。该害虫的传播介体昆虫主要是松墨天牛(Monochamusalternatus)。目前国内外对松材线虫的控制主要包括化学防治、物理熏蒸、机械防治、生物防治、林分改造、育种等，防治对象主要针对媒介松墨天牛和松材线虫病原本身。虽然有效控制了害虫的蔓延，减少了损失。但是，松材线虫病的防治仍面临许多问题。虽然多数人工药剂具有毒性强、见效快等优点，但都不可避免地会带来一些负面效应，如易残留，对环境造成破坏。长期重复使用容易使病虫产生抗性，从而出现再猖獗。熏蒸和机械防治耗费太多人力，成本较高(每亩人工费用高达4500元人民币)，加之远山深山交通极为不便等，所以熏蒸和机械防治不能大规模控制松材线虫病的发生和蔓延。释放和招引天敌、改造林区结构、育种等措施虽然环保、可持续、有效，但是周期太长，短期内很难见成效。所以尽管我国广大森林病虫害防治工作者在松线虫防治方面做了很大的努力，但是松材线虫的扩散蔓延趋势仍未得到根本性的扭转，发生形势依然十分严峻。

根据上述世界性林业有害线虫的防治形势分析，高效、环保、不诱导抗性天然化合物对松材线虫的生物防治显得十分重要。因此，寻找具有新机制、高活性、不诱导抗性物质成为今后的发展趋势。

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指外源或者内源的双链RNA特异性地引起基因沉默的现象，是2006年Fire和Mello诺贝尔奖技术，现在被植物学家作为线虫防治的成功技术(YadavBC，etal.2006；HuangG，etal.2006；SindhuAS，etal.2009；SindhuAS，etal.2009)。该现象首先在秀丽隐杆线虫中发现，后来被证明广泛存在于真核生物中，目前大量用于线虫的基因组功能研究，包括检疫性松材线虫(RossoMN，etal.2005；UrwinPE，etal.2002；VanholmeB，etal.2007；DalzellJJ，etal.2010；ParkJE，etal.2008；ChengXY，etal.2010；KangJS，etal.2011；LiX，etal.2011)。大量实验证明，线虫对基因沉默较其他生物物种更加敏感(MayRC，PlasterkRH2005)。RNA干扰技术在线虫防治方面取得的突破性进展为线虫的防治奠定了理论基础，提供了一种新的线虫防治策略，开辟了作物保护新局面。

虽然基因沉默技术开启了线虫防治的新篇章，该技术手段对松材线虫的杀灭作用已被证明，但是目前大量的尝试仅限于实验室范围，还未实现实际操作应用。限制该技术广泛应用的因素主要是：(一)没有开发出能增强dsRNA有效成分稳定性、维持其杀虫效果、适合规模化应用的成熟稳定的先进农药制剂；(二)没有探究出简单便捷、具可操作性的规模化生产工艺。

先进农药制剂的标志是高效、环境友好和控释。高效取决于有效成分本身和它在剂型中的微粒尺寸，尺寸越小，表面积越大，效率就越高。水基化农药制剂如水剂、乳化剂、水乳剂、悬浮剂、悬乳剂等被认为是环境友好剂型，其农药的微粒尺寸由纳米到微米依次增大，但都不具有控释作用。为了减小农药的尺寸和实现缓释，文献报到将农药制成纳米晶粒，或者在纳米粒外部用合成高分子涂敷，或将液体农药包括成微胶囊，以及用多入口旋涡混合器将联苯菊酯制成纳米颗粒，用海藻酸钠和壳聚糖通过层层组装将吡虫啉包裹等，但这些方法烦琐，并不简单，不易进行大规模生产。

壳聚糖纳米粒作为一种新型药物载体，在医学上已成为国内外研究开发的热点。邬思辉(2009)等将壳聚糖制成纳米粒负载胰岛素，控制药物释放、延长药物疗效、降低药物毒副作用，可以提高疏水性药物对细胞膜的通透性和药物稳定性及改变给药途径，还可以加强制剂的靶向给药能力。刘慧(2007)等研究壳聚糖纳米粒的制备并检测其性能，希望得到一种能在黏膜给药体系应用的药物载体，从而实现抗菌药物的持续释放，达到长期疗效的目标。苏丹(2007)等以壳聚糖纳米粒为载体负载siRNA穿过细胞膜，进入细胞质中的RNAi通路，为人类疾病发生机理、疾病基因治疗靶点的鉴别以及新药研发如小分子化合物和抗体类药物的发现提供理论依据，但其研究仅适合医学而不使用于农药研究。壳聚糖纳米粒在医学上的应用已多有报道，但是在农业上的应用报道还不多见。林春梅(2009)等利用壳聚糖带阳离子的特性，使其与带阴离子的三聚磷酸钠发生离于交联，包裹部分阿维菌素颗粒后形成纳米载药颗粒。赵书言(2009)等用壳聚糖纳米粒包埋尿素，使得尿素的释放速度减慢，增强缓释效果。冯博华(2009)等以蓖麻油酸钠和壳聚糖为原料制备纳米粒子包裹鱼藤酮、印楝素植物源农药，避免了大量有机溶剂和助剂的使用。李敏(2011)等通过过氧化氢降解壳聚糖制备低聚物，以吡虫啉、毒死蜱为模型药物，研究纳米粒子的理化性质及不同制备方法形成机理。张子勇(2012)等以壳聚糖和羧甲基壳聚糖为载体，制备印楝素纳米粒子水分散液。尽管上述报道成功制备了农药壳聚糖纳米粒制剂，但是其研发均处于探究阶段，所制备的纳米粒尺寸、粒径分布、药物负载率等理化指标均不稳定，未实现标准化水平，其次工艺烦琐，不易实现规模生产，所以至今局限于实验室研究，并未见转化为产品制剂流通市场。此外，目前成功报道的农药壳聚糖制剂包埋的农药有效成分多为现存化学农药，分子量小，技术操作相对简单。

本发明基于上述现状，发明出首例基于基因沉默技术的防治松材线虫的生物农药制剂，同时利用一种简捷、规模化的制备方法，研制出适用于有效成分dsRNA大分子的壳聚糖纳米粒助剂。本发明生物农药制剂不仅能高效防治松材线虫，而且能体外保持dsRNA稳定性，增强其杀虫效果。本发明制剂是一种高效、环境友好和控释的先进农药制剂。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种适用于生物农药制剂的有效成分siRNA的大分子的壳聚糖纳米粒。

实现上述目的的技术方案如下：

一种壳聚糖纳米粒，其由以下重量百分比的原料组成：

壳聚糖0.5-5％、助溶剂1-10％、防冻剂0-5％、表面活性剂0.1-1％、乳化剂0.1-0.5％、缓冲液40-60％、余量为水。

优选地，壳聚糖纳米粒中的助溶剂用于增加壳聚糖的溶解性，为聚乙二醇200、聚乙二醇400、乙醇、丙二醇中的一种或者几种混合物。

壳聚糖纳米粒中的防冻剂用于保护制剂成分免于低温造成的物理损害，优选地，所述防冻剂为丙三醇、乙二醇、异丙醇、二甘醇中的一种或者几种混合物。

壳聚糖纳米粒中的表面活性剂用于降低了溶液的表面张力，增强了制剂在植物或害虫体表的润湿、展布以及附着力，从而提高药效。优选地，所述表面活性剂为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80中的一种或者几种混合物。

壳聚糖纳米粒中的乳化剂用于提高胶溶、乳化、分散、交联，优选地，所述乳化剂为三聚磷酸钠、农乳400#(苄基二甲基酚聚氧乙烯醚)、农乳500#(烷基苯磺酸钙)、农乳600#(苯乙基酚聚氧乙烯醚)、农乳700#(烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩聚物)、农乳1600#(苯乙基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚)、NP系列磷酸酯(壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯)、苯乙基聚氧乙烯醚硫酸铵盐、烷基联苯醚二磺酸镁盐中的一种或者几种混合物。

壳聚糖纳米粒中的缓冲液用于制剂酸碱调节、增加助剂溶解性。优选地，所述缓冲液为醋酸盐缓冲液、磷酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液的一种或者几种混合物。

壳聚糖纳米粒是有别于现存纳米粒的可以包裹大分子的农用纳米粒粒径100-600nm。

本发明的另一个目的是提供一种防治松材线虫的生物农药制剂，该生物农药制剂可有效控制松材线虫，是可持续发展的绿色农药。

具体方案如下：

一种防治松材线虫的生物农药制剂，其主要由以下重量百分比的成分组成：

(A)0.05-15％的有效成分：针对松材线虫高效致死靶基因设计合成siRNA，所述siRNA为15-50nt(更优选为17-25nt)的双链RNA、

(B)19.95-55％用于溶解有效成分双链核糖核酸的溶剂、

(C)上述30-80％壳聚糖纳米粒。

所述有效成分双链核糖核酸，是通过基因沉默机制杀灭有害昆虫。

优选地，所述松材线虫高效致死靶基因为乙酰胆碱酯酶基因、G蛋白基因、电子转移黄素蛋白基因、钙网蛋白基因。更优选地，所述针对乙酰胆碱酯酶基因的siRNA为SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、SEQIDNO.5及SEQIDNO.6、SEQIDNO.7及SEQIDNO.8、SEQIDNO.9及SEQIDNO.10、SEQIDNO.11及SEQIDNO.12、SEQIDNO.13及SEQIDNO.14、SEQIDNO.15及SEQIDNO.16、SEQIDNO.17及SEQIDNO.18中的一对或者多对；针对钙网蛋白基因的siRNA为SEQIDNO.19及SEQIDNO.20、SEQIDNO.21及SEQIDNO.22、SEQIDNO.23及SEQIDNO.24中的一对或者多对；针对电子转移黄素蛋白基因的siRNA为SEQIDNO.25及SEQIDNO.26、SEQIDNO.27及SEQIDNO.28中的一对或者两对；针对G蛋白基因的siRNA为SEQIDNO.29及SEQIDNO.30、SEQIDNO.31及SEQIDNO.32、SEQIDNO.33及SEQIDNO.34、SEQIDNO.35及SEQIDNO.36中的一对或者多对。

所述有效成分双链核糖核酸核苷酸数为15-50nt、分子量为8000-40000。优选地，所述siRNA的3’末端设有悬挂碱基。

所述溶剂用于溶解有效成分双链核糖核酸，优选地，所述溶剂为甲醇、二甲亚砜、水、Tris缓冲液中一种或者几种混合物。

本发明的另一目的是提供了一种上述防治松材线虫的生物农药制剂的制备方法。

具体技术方案如下：

一种上述防治松材线虫的生物农药制剂的制备方法，包括以下步骤：

(A)溶解：称所述siRNA晶体，溶于溶剂(优选在8003000r/min的转速下)，搅拌(优选时间5-60min)，使双链核糖核酸充分溶解；

(B)壳聚糖纳米粒制备：

1)准确称取壳聚糖、助溶剂和防冻剂，加入到缓冲液中，(优选800-3000r/min)搅拌使其充分溶解；

2)将上述溶液(优选以3000-10000rpm)离心(优选10-60min)，取上清，加入表面活性剂，充分搅拌，混匀；

3)将乳化剂用水溶解后(优选以10-30ml/min的速度)加入步骤2)溶液中，混匀即得壳聚糖纳米粒；

(C)制剂制备：将步骤(A)中所得溶液与步骤(B)所述的壳聚糖纳米粒均匀混合，后继续搅拌即得均一稳定的双链核糖核酸生物农药制剂。

按照上述方法制备的壳聚糖纳米粒及生物农药制剂的粒径分布、药物负载率等理化指标均比较稳定，可进行标准化水平生产。

与现存技术相比，本发明有以下创新点：

第一，本发明农药制剂的载体为壳聚糖纳米粒，是有别于现存纳米粒的可以包裹大分子的农用纳米粒。由于松材线虫生物防治农药制剂中的所述有效成分为双链核糖核酸，平均分子量均在8000-40000之间，分子量大，在壳聚糖纳米粒制备中需要更高的技术来符合大分子有效成分的包埋，所以本发明壳聚糖纳米粒与现存包埋小分子化学农药的纳米粒存在本职区别。

第二，本发明为双链核糖核酸的壳聚糖纳米粒制剂，较双链核糖核酸与阳离子化合物的简单配伍物更有利于提高有效成分稳定性，保持更高的害虫防治效果。

第三，本发明是首例基于基因沉默技术的松材线虫生物防治农药制剂，在世界范围内属首例剂型成熟的双链核糖核酸农药。基于其特殊杀灭害虫的机制，该制剂是一种环保、绿色、健康的生物农药制剂。

第四，本发明具有一套成熟、简便、工业化操作的工艺流程，所涉生产步骤规范、标准，生产出的纳米粒生物农药制剂的理化性质等指标均为优化标准，易实现工业化大规模操作，利用该制备方法可突破实验室操作规模，实现农药纳米制剂产品的市场化。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不限于此。

实施例一

本实施例特别提供了以松材线虫乙酰胆碱酯酶基因双链核糖核酸序列为有效成分的壳聚

糖纳米粒生物制剂的制备及其效果研究。

(一)针对松材线虫乙酰胆碱酯酶基因双链核糖核酸原药成分的设计和合成

上述序列的3’末端设有dTdT的悬挂碱基。按照上述序列设计和合成双链核糖核酸并冷冻干燥成原药粉末。

(二)0.05％双链核糖核酸生物农药制剂的制备

1有效成分溶解：称取500mg上述双链核糖核酸，溶于199.5g水中，800r/min搅拌使其充分溶解；

2壳聚糖纳米粒制备

以聚乙二醇200做助溶剂、丙三醇做防冻剂、吐温20做表面活性剂、三聚磷酸钠做乳化剂、磷酸盐缓冲液做缓冲液制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比为分别5％、10％、5％、1％、0.5％、60％制备壳聚糖纳米粒，余量为水；

(1)称取壳聚糖40g、聚乙二醇20080g、丙三醇40g，溶于480g磷酸盐缓冲液(pH4-5)，800r/min转速下搅拌12h，使壳聚糖充分溶解；

(2)将步骤(1)所得溶液在3000r/min下离心10min，取上清，加入8g吐温20，充分搅拌混合均匀；

(3)称取4g三聚磷酸钠溶于156g水中，充分搅拌，后与步骤(2)所得溶液混合均匀，即得壳聚糖纳米粒，粒径为100-600nm；

3制剂制备：将步骤1中有效成分溶液与步骤2所得壳聚糖纳米粒溶液均匀混合，即得。

(三)0.05％双链核糖核酸生物农药制剂的防治效果

采用PDA平板培养灰葡萄孢，待灰葡萄孢铺满平板后接种松材线虫，25℃恒温培养15天，然后漏斗收集。将上述制备的0.05％生物农药制剂稀释至200mg/L，把离心收集到的线虫50μl(约40头线虫)加入其中，20℃恒温放置，于12h和24h观察死亡率，结果如下表所示。

表以松材线虫AChE基因设计合成的双链核糖核酸为有效成分的生物制剂对松材线虫的防治效果

其中CK1为0.05wt％的Si-AChE3_003双链核糖核酸+99.95wt％阳离子聚合物壳聚糖；CK2为0.05wt％Si-AChE2_002双链核糖核酸+99.95wt％阳离子聚合物聚赖氨酸；CK3为DEPC水。

根据上述生物农药制剂的成分和制备方法，制备浓度为15wt％的双链核糖核酸生物农药制剂(其中，所述壳聚糖纳米粒为35％，水为50％)，稀释至200mg/L，按上述处理方式处理松材线虫，后分别与12h、24h观察其防治效果，结果如下：

其中CK1为15wt％的Si-AChE3_002双链核糖核酸+阳离子聚合物壳聚糖；CK2为15wt％Si-AChE2_003双链核糖核酸+阳离子聚合物聚赖氨酸；CK3为DEPC水。

实施例二

本实施例特别提供了针对松材线虫钙网蛋白基因双链核糖核酸序列为有效成分的壳聚糖纳米粒生物制剂的制备及其效果研究。

(一)针对松材线虫钙网蛋白基因双链核糖核酸原药成分的设计和合成

CRT：GU585910

Si-CRT_001：GACTGTGGAGGTGGATATTTG

正义链(5’-3’)：5’GACUGUGGAGGUGGAUAUUUGdTdT3’SEQIDNO.19

反义链(3’-5’)：3’dTdTCUGACACCUCCACCUAUAAAC5’SEQIDNO.20

Si-CRT_002：GAGATCTACAAGTTCGATGAC

正义链(5’-3’)：5’GAGAUCUACAAGUUCGAUGACdTdT3’SEQIDNO.21

反义链(3’-5’)：3’dTdTCUCUAGAUGUUCAAGCUACUG5’SEQIDNO.22

Si-CRT_003：TTGAATTATCTTGGAAATGAC

正义链(5’-3’)：5’UUGAAUUAUCUUGGAAAUGACdTdT3’SEQIDNO.23

反义链(3’-5’)：3’dTdTAACUUAAUAGAACCUUUACUG5’SEQIDNO.24

(二)15％双链核糖核酸生物农药制剂的制备

1有效成分溶解：称取150g上述双链核糖核酸，溶于350g甲醇，2000r/min搅拌使其充分溶解；

2壳聚糖纳米粒制备

以聚乙二醇400做助溶剂、乙二醇做防冻剂、吐温40做表面活性剂、农乳500#做乳化剂、醋酸盐缓冲液做缓冲液制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比为分别2％、4％、3％、0.5％、0.5％、45％制备壳聚糖纳米粒，余量为水。

(1)称取壳聚糖10g、聚乙二醇40020g、乙二醇15g，溶于225g醋酸盐缓冲液(pH＝4-5)，1000r/min转速下搅拌24h，使壳聚糖充分溶解；

(2)将步骤(1)所得溶液在2500r/min下离心5min，取上清，加入2.5g吐温40，充分搅拌混合均匀；

(3)称取2.5g农乳500#溶于225g水中，充分搅拌，后与步骤(2)所得溶液混合均匀，即得壳聚糖纳米粒，粒径100-600nm。

(三)15％双链核糖核酸生物农药制剂的防治效果

采用PDA平板培养灰葡萄孢，待灰葡萄孢铺满平板后接种松材线虫，25℃恒温培养15天，然后漏斗收集。将上述15％生物农药制剂稀释至200mg/L，把离心收集到的线虫50μl(约40头线虫)加入其中，20℃恒温放置，于12h和24h观察死亡率，结果如下表所示。

表以松材线虫钙网蛋白基因设计合成的双链核糖核酸为有效成分的生物制剂对松材线虫的防治效果

其中CK1为15wt％Si-CRT_001双链核糖核酸+阳离子聚合物壳聚糖；CK2为15wt％Si-CRT_002双链核糖核酸+阳离子聚合物聚赖氨酸；CK3为DEPC水。

根据上述生物农药制剂的成分和制备方法，制备浓度为1wt％的双链核糖核酸生物农药制剂(其中，所述壳聚糖纳米粒为74％，甲醇为25％)，稀释至200mg/L，按上述处理处理松材线虫，后12h、24h观察其防治效果，结果如下：

其中CK1为1wt％Si-CRT_001双链核糖核酸+阳离子聚合物壳聚糖；CK2为1wt％Si-CRT_002双链核糖核酸+阳离子聚合物聚赖氨酸；CK3为DEPC水。

实施例三

本实施例特别提供了针对松材线虫电子转移黄素蛋白基因双链核糖核酸序列为有效成分的壳聚糖纳米粒生物制剂的制备及其效果研究。

电子转移黄素蛋白基因：GU130161

(一)针对松材线虫电子转移黄素蛋白基因双链核糖核酸原药的设计和合成

Si-001：ACGAAATTAGTGTGCTGGTG

正义链(5’-3’)：5’ACGAAAUUAGUGUGCUGGUGdTdT3’SEQIDNO.25

反义链(3’-5’)：3’dTdTUGCUUUAAUCACACGACCAC5’SEQIDNO.26

Si-002：ATCGTCCCGACCTCCAAACC

正义链(5’-3’)：5’AUCGUCCCGACCUCCAAACCdTdT3’SEQIDNO.27

反义链(3’-5’)：3’dTdTUAGCAGGGCUGGAGGUUUGG5’SEQIDNO.28

(二)5％双链核糖核酸生物农药制剂的制备

1有效成分溶解：称取50g双链核糖核酸，溶于550g二甲亚砜中，3000r/min搅拌使其充分溶解；

2壳聚糖纳米粒的制备

以异丙醇做防冻剂、聚乙二醇200做助溶剂、吐温60做表面活性剂、农乳700#做乳化剂、柠檬酸盐缓冲液做缓冲液制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比为分别1％、1％、1％、0.1％、0.1％、40％制备壳聚糖纳米粒，余量为水。

(1)称取壳聚糖4g、异丙醇4g、聚乙二醇2004g，溶于160g柠檬酸盐缓冲液(pH＝4-5)，1000r/min转速下搅拌24h，使壳聚糖充分溶解；

(2)将步骤(1)所得溶液在2500r/min下离心5min，取上清，加入0.4g吐温60，充分搅拌混合均匀；

(3)称取0.4g农乳700#溶于227.2g水中，充分搅拌，后与步骤(2)所得溶液混合均匀，即得壳聚糖纳米粒，粒径100-600nm。

3制剂制备：将步骤1中有效成分溶液与步骤2所得壳聚糖纳米粒溶液搅拌均匀混合，即得。

(三)5％双链核糖核酸生物农药制剂的防治效果

采用PDA平板培养灰葡萄孢，待灰葡萄孢铺满平板后接种松材线虫，25℃恒温培养15天，然后漏斗收集。将5％生物农药制剂稀释至200mg/L，把离心收集到的线虫50μl(约40头线虫)加入其中，20℃恒温放置，于12h和24h观察死亡率，结果如下表所示。

表针对松材线虫电子转移黄素蛋白基因设计合成的双链核糖核酸为有效成分的生物制剂对松材线虫的防治效果

其中CK1为5WT％Si-CRT_001双链核糖核酸+阳离子聚合物壳聚糖；CK为5WT％Si-CRT_002双链核糖核酸+阳离子聚合物聚赖氨酸；CK3为DEPC水。

根据上述生物农药制剂的成分和制备方法，制备浓度为10wt％的双链核糖核酸生物农药制剂(其中，所述壳聚糖纳米粒为35％，二甲亚砜为55％)，稀释至200mg/L，按上述方法处理松材线虫，后12h、24h观察其防治效果，结果如下：

其中CK1为10WT％Si-CRT_001双链核糖核酸+阳离子聚合物壳聚糖；CK为10WT％Si-CRT_002双链核糖核酸+阳离子聚合物聚赖氨酸；CK3为DEPC水。

实施例四

本实施例特别提供了针对松材线虫G蛋白β亚基基因双链核糖核酸序列为有效成分的壳聚糖纳米粒生物制剂的制备及其效果研究。

(一)以松材线虫G蛋白β亚基基因双链核糖核酸原药的设计和合成

Si-G_001：GAACGACACCACGCTGG

正义链(5’-3’)：5’GAACGACACCACGCUGGdTdT3’SEQIDN0.29

反义链(3’-5’)：3’dTdTCUUGCUGUGGUGCGACC5’SEQIDN0.30

Si-G_002：GAATCTGGTGTCCGACT

正义链(5’-3’)：5’GAAUCUGGUGUCCGACUdTdT3’SEQIDN0.31

反义链(3’-5’)：3’dTdTCUUAGACCACAGGCUGA5’SEQIDN0.32

Si-G_003：GACTCTTCGATATTCGC

正义链(5’-3’)：5’GACUCUUCGAUAUUCGCdTdT3’SEQIDN0.33

反义链(3’-5’)：3’dTdTCUGAGAAGCUAUAAGCG5’SEQIDN0.34

Si-G_004：CGATTTCAACTGCAATG

正义链(5’-3’)：5’CGAUUUCAACUGCAAUGdTdT3’SEQIDN0.35

反义链(3’-5’)：3’dTdTGCUAAAGUUGACGUUAC5’SEQIDN0.36

(二)5％生物农药制剂的制备

1、以G蛋白β亚基基因Si-G_001基因siRNA为有效成分配置含有不同防冻剂的双链核糖核酸生物农药制剂

(1)有效成分溶解：称取50gSi-G_001双链核糖核酸溶于550gTris缓冲液中，3000r/min搅拌使其充分溶解；

(2)壳聚糖纳米粒制备

分别以丙三醇、乙二醇、异丙醇、二甘醇、丙三醇+乙二醇、丙三醇+异丙醇+二甘醇做防冻剂剂，以聚乙二醇200做助溶剂、吐温40做表面活性剂、农乳400#做乳化剂、柠檬酸盐缓冲液做缓冲液制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比为分别1％、1％、1％、0.1％、0.1％、40％制备壳聚糖纳米粒，余量为水。

1)称取壳聚糖4g、防冻剂4g、聚乙二醇2004g，溶于160g柠檬酸盐缓冲液(pH4-5)，1000r/min转速下搅拌24h，使壳聚糖充分溶解；

2)将步骤1)所得溶液在2500r/min下离心5min，取上清，加入0.4g吐温40，充分搅拌混合均匀；

3)称取0.4g农乳400#溶于227.2g水中，充分搅拌，后与步骤2)所得溶液混合均匀，即得壳聚糖纳米粒，粒径100-600nm。

(3)制剂制备：将步骤(1)中有效成分溶液与步骤(2)所得壳聚糖纳米粒溶液均匀混合，即得。

(4)5％双链核糖核酸生物农药制剂对松材线虫的防效

采用PDA平板培养灰葡萄孢，待灰葡萄孢铺满平板后接种松材线虫，25℃恒温培养15天，然后漏斗收集。将5％生物农药制剂稀释至200mg/L，把离心收集到的线虫50μl(约40头线虫)加入其中，20℃恒温放置，于72h观察死亡率，结果如下表所示。

表含不同防冻剂剂成分的生物农药制剂对松材线虫的防治效果

2、以G蛋白β亚基基因Si-G_002基因siRNA为有效成分配置含有不同表面活性剂的双链核糖核酸生物农药制剂

(1)称取150g双链核糖核酸，溶于350g甲醇中，2000r/min搅拌使其充分溶解；

(2)壳聚糖纳米粒的制备

分别以吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、吐温20+吐温60、吐温40+吐温60+吐温80、吐温20+吐温40+吐温60+吐温80为表面活性剂，以聚乙二醇400做助溶剂、乙二醇做防冻剂、农乳500#做乳化剂、磷酸盐缓冲液做缓冲液制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比为分别2％、4％、3％、0.5％、0.5％、45％制备壳聚糖纳米粒，余量为水。

1)称取壳聚糖10g、聚乙二醇40020g、乙二醇15g，溶于225g磷酸盐缓冲液(pH4-5)，1000r/min转速下搅拌24h，使壳聚糖充分溶解；

2)将步骤1)所得溶液在2500r/min下离心5min，取上清，加入2.5g表面活性剂，充分搅拌混合均匀；

3)称取2.5g农乳500#溶于225g水中，充分搅拌，后与步骤2)所得溶液混合均匀，即得壳聚糖纳米粒，粒径100-600nm。

(3)制剂制备：将步骤(1)中有效成分溶液与步骤(2)所得壳聚糖纳米粒溶液均匀混合，即得15％双链核糖核酸生物农药制剂。

(4)15％双链核糖核酸生物农药制剂对松材线虫的防效

采用PDA平板培养灰葡萄孢，待灰葡萄孢铺满平板后接种松材线虫，25℃恒温培养15天，然后漏斗收集。将15％生物农药制剂稀释至200mg/L，把离心收集到的线虫50μl(约40头线虫)加入其中，20℃恒温放置，于72h观察死亡率，结果如下表所示。

表含不同表面活性剂成分的生物农药制剂对松材线虫的防治效果

表面活性剂	死亡率(％)
		吐温20	89.74
吐温40	85.03
		吐温60	87.32
吐温80	84.66
		吐温20+吐温60	89.25
吐温40+吐温60+吐温80	88.33
		吐温20+吐温40+吐温60+吐温80	87.89
DEPC水	55.54

3、以G蛋白β亚基基因Si-G_003基因siRNA为有效成分配置含有不同乳化剂的双链核糖核酸生物农药制剂

(2)壳聚糖纳米粒的制备

分别以三聚磷酸钠、农乳400#(苄基二甲基酚聚氧乙烯醚)、农乳500#(烷基苯磺酸钙)、农乳600#(苯乙基酚聚氧乙烯醚)、农乳700#(烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩聚物)、农乳1600#(苯乙基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚)、NP系列磷酸酯(壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯)、苯乙基聚氧乙烯醚硫酸铵盐、烷基联苯醚二磺酸镁盐、三聚磷酸钠+农乳400#、农乳500#+农乳600#、农乳400#+NP系列磷酸酯、NP系列磷酸酯+烷基联苯醚二磺酸镁盐、三聚磷酸钠+农乳1600#+NP系列磷酸酯、三聚磷酸钠+农乳1600#+NP系列磷酸酯+苯乙基、聚氧乙烯醚硫酸铵盐+烷基联苯醚二磺酸镁盐为乳化剂，以丙二醇做助溶剂、异丙醇做防冻剂、磷酸缓冲液做缓冲液制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比为分别2％、4％、3％、0.5％、0.5％、45％制备壳聚糖纳米粒，余量为水。

1)称取壳聚糖10g、丙二醇20g、异丙醇15g，溶于225g磷酸缓冲液(pH4-5)，1000r/min转速下搅拌24h，使壳聚糖充分溶解；

2)将步骤1)所得溶液在2500r/min下离心5min，取上清，加入2.5g吐温40，充分搅拌混合均匀；

3)称取2.5g乳化剂溶于225g水中，充分搅拌，后与步骤2)所得溶液混合均匀，即得壳聚糖纳米粒，粒径100-600nm。

(4)15％双链核糖核酸生物农药制剂对松材线虫的防效

表含不同乳化剂成分的生物农药制剂对松材线虫的防治效果

4、以G蛋白β亚基基因Si-G_004基因siRNA为有效成分配置含有不同缓冲液的双链核糖核酸生物农药制剂

(1)称取500mg双链核糖核酸，溶于199.5g水中，800r/min搅拌使其充分溶解；

(2)壳聚糖纳米粒的制备

分别以醋酸盐缓冲液(pH4-5)、磷酸盐缓冲液((pH4-5))、柠檬酸盐缓冲液(pH4-5)、醋酸盐缓冲液+柠檬酸盐缓冲液(pH4-5)、磷酸盐缓冲液+柠檬酸盐缓冲液(pH4-5)、醋酸盐缓冲液+磷酸盐缓冲液+柠檬酸盐缓冲液做壳聚糖纳米粒制备的缓冲液(pH4-5)，以二甘醇做防冻剂、吐温60做表面活性剂、农乳1600#做乳化剂、制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比为分别5％、10％、5％、1％、0.5％、60％制备壳聚糖纳米粒，余量为水。

1)称取壳聚糖40g、聚乙二醇20080g、二甘醇40g，溶于480g缓冲液(pH4-5)，800r/min转速下搅拌12h，使壳聚糖充分溶解；

2)将步骤1)所得溶液在3000r/min下离心10min，取上清，加入8g吐温60，充分搅拌混合均匀；

3)称取4g农乳1600#溶于156g水中，充分搅拌，后与步骤2)所得溶液混合均匀，即得壳聚糖纳米粒，粒径100-600nm。

(3)制剂制备：将步骤(1)中有效成分溶液与步骤(2)所得壳聚糖纳米粒溶液均匀混合，即得0.05％双链核糖核酸生物农药制剂。

(4)0.05％双链核糖核酸生物农药制剂对松材线虫的防效

采用PDA平板培养灰葡萄孢，待灰葡萄孢铺满平板后接种松材线虫，25℃恒温培养15天，然后漏斗收集。将0.05％生物农药制剂稀释至200mg/L，把离心收集到的线虫50μl(约40头线虫)加入其中，20℃恒温放置，于72h观察死亡率，结果如下表所示。

表含不同缓冲液成分的生物农药制剂对松材线虫的防治效果

缓冲液	死亡率(％)
		醋酸盐缓冲液	75.06
磷酸盐缓冲液	73.18
		柠檬酸盐缓冲液	74.67
醋酸盐缓冲液+柠檬酸盐缓冲液	69.98
		磷酸盐缓冲液+柠檬酸盐缓冲液	76.01
醋酸盐缓冲液+磷酸盐缓冲液+柠檬酸盐缓冲液	73.33
		DEPC水	58.15

5、复配核糖核酸生物农药制剂的制备和应用

本例特别提供了松材线虫乙酰胆碱酯酶基因Si-ace1_001、Si-ace2_002和Si-ace3_003双链核糖核酸的复配生物制剂及应用。

(1)有效成分溶解：分别称取Si-ace1_001、Si-ace2_002、Si-ace3_003、Si-ace1_001+Si-ace2_002、Si-ace1_001+Si-ace2_002+Si-ace3_003双链核糖核酸原药粉末500mg，溶于199.5g水中，800r/min搅拌使其充分溶解；

(2)壳聚糖纳米粒制备

以聚乙二醇200做助溶剂、丙三醇做防冻剂、吐温20做表面活性剂、三聚磷酸钠做乳化剂、磷酸盐缓冲液做缓冲液制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比为分别5％、10％、5％、1％、0.5％、60％制备壳聚糖纳米粒，余量为水。

1)称取壳聚糖40g、聚乙二醇20080g、丙三醇40g，溶于480g磷酸盐缓冲液(pH4-5)，800r/min转速下搅拌12h，使壳聚糖充分溶解；

2)将步骤1)所得溶液在3000r/min下离心10min，取上清，加入8g吐温20，充分搅拌混合均匀；

3)称取4g三聚磷酸钠溶于156g水中，充分搅拌，然后与步骤2)所得溶液混合均匀，即得壳聚糖纳米粒，粒径100-600nm。

(4)0.05％双链核糖核酸生物农药制剂的防治效果

采用PDA平板培养灰葡萄孢，待灰葡萄孢铺满平板后接种松材线虫，25℃恒温培养15天，然后漏斗收集。将0.05％生物农药制剂稀释至200mg/L，把离心收集到的线虫50μl(约40头线虫)加入其中，20℃恒温放置，后12h、24h观察死亡率，结果如下表所示。

表8复配双链核糖核酸为有效成分的生物制剂对小菜蛾的防治效果

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种防治松材线虫的生物农药制剂，其特征是，其主要由以下重量百分比的成分组成：

(A)0.05-15％的有效成分：针对松材线虫高效致死靶基因设计合成siRNA，所述松材线虫高效致死靶基因为乙酰胆碱酯酶基因、G蛋白基因、电子转移黄素蛋白基因、钙网蛋白基因，所述siRNA为15-50nt的双链RNA；

(B)19.95-55％溶剂；

(C)30-80％的壳聚糖纳米粒，所述壳聚糖纳米粒，其由以下重量百分比的原料组成：壳聚糖0.5-5％、助溶剂1-10％、防冻剂0-5％、表面活性剂0.1-1％、乳化剂0.1-0.5％、缓冲液40-60％、余量为水；

且上述(A)有效成分，(B)溶剂，和(C)壳聚糖纳米粒的总量为100％，

所述助溶剂为聚乙二醇200、聚乙二醇400、乙醇、丙二醇中的一种或者几种混合物；

所述防冻剂为丙三醇、乙二醇、异丙醇、二甘醇中的一种或者几种混合物；

所述表面活性剂为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80中的一种或者几种混合物；

所述乳化剂为三聚磷酸钠、苄基二甲基酚聚氧乙烯醚、烷基苯磺酸钙、苯乙基酚聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩聚物、苯乙基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯、苯乙基聚氧乙烯醚硫酸铵盐、烷基联苯醚二磺酸镁盐中的一种或者几种混合物；所述缓冲液为醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液的一种或者几种混合物。

2.根据权利要求1所述的防治松材线虫的生物农药制剂，其特征是，所述针对乙酰胆碱酯酶基因的siRNA为SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、SEQIDNO.5及SEQIDNO.6、SEQIDNO.7及SEQIDNO.8、SEQIDNO.9及SEQIDNO.10、SEQIDNO.11及SEQIDNO.12、SEQIDNO.13及SEQIDNO.14、SEQIDNO.15及SEQIDNO.16、SEQIDNO.17及SEQIDNO.18中的一对或者多对；针对钙网蛋白基因的siRNA为SEQIDNO.19及SEQIDNO.20、SEQIDNO.21及SEQIDNO.22、SEQIDNO.23及SEQIDNO.24中的一对或者多对；针对电子转移黄素蛋白基因的siRNA为SEQIDNO.25及SEQIDNO.26、SEQIDNO.27及SEQIDNO.28中的一对或者两对；针对G蛋白基因的siRNA为SEQIDNO.29及SEQIDNO.30、SEQIDNO.31及SEQIDNO.32、SEQIDNO.33及SEQIDNO.34、SEQIDNO.35及SEQIDNO.36中的一对或者多对。

3.根据权利要求1-2任一项所述的防治松材线虫的生物农药制剂，其特征是，所述溶剂为甲醇、二甲亚砜、水、Tris缓冲液中一种或者几种混合物。

4.一种权利要求1-3任一项所述的防治松材线虫的生物农药制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

(A)溶解：称取所述siRNA，溶于溶剂，搅拌，使所述siRNA充分溶解；

(B)壳聚糖纳米粒制备：

1)称取所述壳聚糖、助溶剂和防冻剂，加入到缓冲液中，搅拌使其充分溶解，得溶液1；

2)将溶液1离心，取上清，加入表面活性剂，充分搅拌，混匀，得溶液2；

3)将乳化剂用水溶解后加入溶液2中，混匀后即得壳聚糖纳米粒；

(C)制剂制备：将步骤(A)中所得溶液与步骤(B)所得的壳聚糖纳米粒混合均匀，即得所述防治松材线虫的生物农药制剂。