CN110283827B - 松材线虫mog-2基因及其在发育干扰中应用 - Google Patents

松材线虫mog-2基因及其在发育干扰中应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及线虫病害防控技术领域，具体涉及松材线虫的mog‑2基因，及利用该基因干扰松材线虫发育以防治松材线虫病的专利申请。松材线虫mog‑2基因DNA序列全长953bp，包含3个内含子，4个外显子，该DNA序列的起始密码子和终止密码子分别为ATG和TGA。外显子构成的松材线虫mog‑2基因的CDS序列长度为843bp。本申请对松材线虫mog‑2基因进行了克隆，分析其功能，认为该基因与松材线虫的生长发育，尤其是性别决定密切相关；采用siRNA对松材线虫进行发育干扰，能够导致松材线虫明显偏雄性化，群体繁殖力下降，可以利用该siRNA进行发育干扰从而防治松材线虫病。

Description

松材线虫mog-2基因及其在发育干扰中应用
技术领域
本发明涉及线虫病害防控技术领域，具体涉及松材线虫的mog-2基因，及利用该基因干扰松材线虫发育以防治松材线虫病的专利申请。
背景技术
松材线虫病的背景：松材线虫病是世界性检疫病害，具有发病迅速、致死率高、防治困难等特征，一旦传入，造成松林大面积死亡。该病于1905年在日本首次发现，目前主要分布在中国、日本、韩国、墨西哥、葡萄牙、加拿大、美国等国家；自1982年传入以来，逐步在我国松林地区扩散，到2019年为止，18个省的多个区县都被列为松材线虫病疫区。松材线虫病严重威胁林业生产，破坏森林生态平衡，造成巨大经济损失。
松材线虫的背景：松材线虫[Bursaphelenchus xylophilus(Steiner et Buhrer)Nickle]，是松材线虫病的病原线虫。在食物充足和适合的环境中，松材线虫的雌雄成虫大量交配产卵，卵孵化依次发育为二龄幼虫，三龄幼虫，四龄幼虫进而发育为成虫状态。松材线虫属于雌雄异体生物，分为雌性成虫和雄性成虫，进行循环往复的繁殖活动，在种群中呈现世代交替的现象。松材线虫的繁殖效率极高，在极短时间内即可布满松树树体，进而造成松树的萎蔫死亡。
如何获得松材线虫的mog-2基因，以及如何利用该基因对松材线虫的生长发育产生干扰效果，是本发明需要解决的问题。
相关文献报道：在秀丽隐杆线虫中，mog-2基因可以使雌雄同体个体向雌性化发展，影响生殖细胞的发育、雄性生殖细胞的切换和有丝分裂和减数分裂的周期。mog-2基因突变体或者被mog-2siRNA干扰后的秀丽隐杆线虫虫体，其生殖系统会出现缺陷，并可导致虫体生长缓慢和胚胎致死效应。在松材线虫体内是否存在这样一个mog-2基因，其功能，以及能否应用于发育干扰松材线虫，均未可知。
发明内容
本发明提供一种松材线虫mog-2基因的克隆方法，以及mog-2基因序列，并提供一种双链siRNA，可对松材线虫进行发育干扰，防治松材线虫病。
本发明的松材线虫mog-2基因及其在发育干扰中应用的方法和技术，包括以下:
(1)松材线虫mog-2基因克隆的引物；
(2)松材线虫mog-2基因克隆的程序与步骤；
(3)松材线虫mog-2基因干扰引物；
(4)松材线虫mog-2基因干扰应用。
步骤(1)具体为:用于PCR扩增松材线虫mog-2基因的引物序列，具体为：
mog-2-F 5’-ATGGTTCGTCTATCCGC-3’
mog-2-R 5’-TCATTGAACCTCCACCTCTC-3’。
步骤(2)具体为:首先获得松材线虫的DNA，，经PCR扩增后，得到mog-2的PCR扩增产物；将扩增产物与载体进行连接，后转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在经特殊处理后的LB固体培养基上涂布培养后，取白色单菌落于添加抗体的LB液体培养基中培养后进行菌液PCR，凝胶电泳检测到目的条带大小的片段后，将菌落PCR产物送样检测。
步骤(3)具体为:用于松材线虫mog-2基因干扰的siRNA的引物序列，具体为：
mog-2-siRNA-F 5’-GCUUUGACCAACAACAAUUTT-3’
mog-2-siRNA-R 5’-AAUUGUUGUUGGUCAAAGCTT-3’。
步骤(4)具体为:构建松材线虫mog-2基因RNA干扰的浸染体系，25℃，120rpm，震荡培养18h。
步骤(4)具体为:挑取适量发育干扰的松材线虫虫体，在灰葡萄孢上培养3-5d，检测其雌雄性比。
所述的一种利用松材线虫生长发育相关基因mog-2对其发育进行干扰的方法，具体包括以下步骤:
(1)松材线虫mog-2基因克隆的引物设计：具体为：
mog-2-F 5’-ATGGTTCGTCTATCCGC-3’
mog-2-R 5’-TCATTGAACCTCCACCTCTC-3’；
(2)松材线虫mog-2基因克隆的程序与步骤：利用动物组织DNA提取试剂盒提取松材线虫DNA；质量合格后，以DNA为模板，加入克隆引物及其他PCR扩增所需组分，在PCR仪上设计PCR反应程序并运行；得到PCR扩增产物后，16℃水浴锅孵育4h或4℃冰箱过夜培养，使其与表达载体连接，后转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞，取适量转化后的菌液，涂布于经8μL 20％(w/v)IPTG、40μL 20mg/mL的X-Gal处理的含100μL/mL Amp的LB固体培养基上，37℃倒置培养18-24h；取白色单菌落于含有50mg/mL Amp的5mL LB液体培养基中培养，然后取适量菌液作模板进行PCR反应，反应体系和程序同前；反应结束后，取10μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以检测是否有相应大小的条带。凝胶电泳检测到目的条带大小的片段后，将菌液PCR产物送样检测；
(3)松材线虫mog-2基因干扰引物设计：根据克隆成功的松材线虫mog-2基因，设计用于松材线虫mog-2基因干扰的双链siRNA的引物序列，具体为：
mog-2-siRNA-F 5’-GCUUUGACCAACAACAAUUTT-3’
mog-2-siRNA-R 5’-AAUUGUUGUUGGUCAAAGCTT-3’；
(4)松材线虫mog-2基因干扰技术施用：以松材线虫mog-2基因的双链siRNA，浸染松材线虫幼虫，25℃，120rpm，震荡培养18h；
(5)松材线虫mog-2基因干扰效果检查：在长势良好的灰葡萄孢上培养浸染的松材线虫，3-5d，贝尔曼漏斗法过滤松材线虫，用普通光学显微镜检测其雌雄性比。
本发明的有益效果为:获得mog-2基因序列，为揭示松材线虫发育有重要作用。
本发明提供的基因干扰siRNA，为干扰松材线虫发育，进而利用于松材线虫病防控，有良好作用。
附图说明
图1为松材线虫mog-2基因PCR扩增检测电泳图；其中M表示核酸标准分子量，1为空白加样孔，2为mog-2基因PCR产物；
图2为松材线虫mog-2基因菌液PCR检测电泳图；其中M表示核酸标准分子量，1-5为mog-2基因菌液PCR产物；
图3为松材线虫mog-2RNA干扰后松材线虫F0代成虫的雌雄性比；CK表示空白对照组，siRNA表示mog-2siRNA处理组，a、b表示在差异水平P＞0.05上差异显著。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1
松材线虫mog-2基因的基因序列的克隆
(1)松材线虫DNA的提取
取在长满灰葡萄孢菌的PDA培养基上持续培养的25℃松材线虫NXY61虫株，改进式贝尔曼漏斗法分离线虫，将线虫液的浓度调到2000头/mL左右，取1mL左右的线虫液放到1.5mL的离心管中，离心、漂洗、去上清备用；
用匀浆器匀浆处理离心管中的线虫，加入180μL的Buffer GTL；
加入20μL Proteinase K，涡旋震荡使样品彻底混匀。56℃水浴，直至组织完全裂解；
加入200μL Buffer GL，涡旋震荡充分混匀。加入200μL无水乙醇，涡旋震荡充分混匀；
将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸收柱中，10000rpm(～11500×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸收柱重新放回收集管中；
向吸附柱中加入500μL Buffer GW1，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
向吸附柱中加入500μL Buffer GW2，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如需进一步提高DNA纯度，可重复此步骤；
12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；
将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μLBuffer GE或灭菌水，室温放置2-5min，10000rpm离心1min，收集DNA溶液；
取2uL松材线虫的DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，得到一条亮的条带，并且OD260/OD280介于1.6-1.8，满足下一步的试验要求。所获得的松材线虫DNA直接应用或-20℃保存备用。
(2)mog-2基因的扩增
以松材线虫的基因组DNA为模板，利用Primer Premier 6设计松材线虫mog-2基因的克隆引物，并使用DNAMAN分析引物自身及引物之间的错配情况，最终确定使用的克隆引物序列如下，用于获得松材线虫mog-2基因的基因全序列；
mog-2-F 5’-ATGGTTCGTCTATCCGC-3’
mog-2-R 5’-TCATTGAACCTCCACCTCTC-3’；
以步骤(1)获得的松材线虫DNA为模板，利用上述克隆引物进行PCR扩增。25μL扩增体系设计如下：
模板，2μL；
10×buffer，3μL；
dNTP，1μL；
mog-2-F，2μL；
mog-2-R，2μL；
TaqE，0.5μL；
ddH2O，14.5μL；
PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟；94℃、45秒，57℃、60秒，72℃、90秒，30个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存。
对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，扩增出一条约850bp的特异性目的条带，与预期条带大小843bp相符(该PCR扩增产物的电泳检测如图1)。
(3)mog-2基因扩增产物与克隆载体的连接
将步骤(2)得到的PCR扩增产物连接到pMD18-T载体上，按如下操作加试剂于PCR管，16℃水浴锅孵育4h或4℃冰箱过夜培养。
Ligation solution I，2.5μL；
pMD18-T Vector，0.5μL；
PCR扩增产物，2.0μL。
(4)连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞
取8μL 20％(w/v)IPTG、40μL 20mg/mL的X-Gal涂布于含100μL/mL Amp的LB固体培养基上，室温下至涂布液被培养基吸干；
取2μL步骤(3)得到的连接反应物，加入50μLE.coliDH5α感受态细胞中，轻缓转动以混匀内容物；冰浴20-30min，42℃水浴热激90sec，快速转至冰浴中2min；加入950μL加Amp的LB液体培养基，于37℃下150rpm摇动复苏培养1.5h；
取100μL涂布于第1步处理的LB固体培养基平板上，室温下放置，至涂布的菌液被培养基完全吸干；倒置培养皿，置于37℃培养18-24h。
(5)菌液PCR检测
挑取步骤(4)培养基上的白色单菌落，接种于含有50mg/mL Amp的5mL LB液体培养基中；37℃，200rpm振荡摇菌培养8h左右；然后取适量菌液作模板进行PCR反应，反应体系和程序同前；反应结束后，取10μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以检测是否有相应大小的条带。电泳检测如图2。
(6)序列测定
菌液PCR检测正确后，测序。
测序结果显示发明人获得了一个长为953bp的核苷酸序列，就是松材线虫mog-2基因的DNA序列，包含3个内含子，4个外显子，该DNA序列的起始密码子和终止密码子分别为ATG和TGA，该DNA全长序列如SEQ ID 1所示，具体序列如下：
ATGGTTCGTCTATCCGCGGAGCTGATACACGATGCTTTCCCCTATGTGAATGCCGTCAAACAGAGGGAATTGAACCTGAGGGACCTACAGATTCCTGCAATAGAGAATCTTGGGGCCACTCGAAATCAGTACGATGTTATTGATCTTACGGATAACAACATCCGGAAGTTGGAGAATTTTCCTTTCCTCAAACGTCTAGAGTCATTGCTTCTTCACAACAATAGGATTCAGTAAGTCCTTCATCTTTTACCTATTCCTGTCTTTAGGTATATTCAGAAGGATCTCCATGAGAAACTCCCTAATTTGAATACCTTGGCTTTGACCAACAACAATTTAGCTGAGCTTGGAGATATTGAACCTCTAGCGAAATGCAAGAAACTTGAGTATTTAACTCTGATGGGGAATCCGTTGACACACAAACCTCATTACAGAGCCTATGTGATATACAAGCTGAGATCAGTCCGTGTTCTTGATTTTAAAAGAATCAAATTGGCGGTAAGTTAAAGATCTATTATAATATTGTGGTTAAGGAACGACAAGCTGCTCTTCAATTGTTCAAGGGAGCTGAAGGGAAGAAGTTGCGAGAACAACTTGTTAAGAAATCCCAGCCATTACCAAATGAGAACGAACCAGTTAGAGCTCAGCCCGTTGAGAGTAATAGGACAGATGAAGAGCAAGAAAAGATCAGGCAGGCGATTCAGAACGCAAAAACGTTAGCAGAAGTTGAGCATCTGCAGAGTTTGTTGCAGCACGGAAAAGTGCCTGATCCCTCACAGTAAGTTCATTTTTATTTTGACATGTGTTTCGTCTCTAGGTTTGGTCAAGAAAACAATGGTAGCAATCCGAGTAAACCCGATGGACAAGAAGAGGAGGAAGATATGGACACAGGGGGAGACGTTCAGCCCCTCAATGAACTCCAGAATGGTCAAAACGGAGAGGTGGAGGTTCAATGA
对松材线虫mog-2基因的cDNA序列进行分析，发明人获得了一个长为843bp的核苷酸序列，就是松材线虫mog-2基因的CDS序列，该CDS序列如SEQ ID 2所示，具体序列如下：
ATGGTTCGTCTATCCGCGGAGCTGATACACGATGCTTTCCCCTATGTGAATGCCGTCAAACAGAGGGAATTGAACCTGAGGGACCTACAGATTCCTGCAATAGAGAATCTTGGGGCCACTCGAAATCAGTACGATGTTATTGATCTTACGGATAACAACATCCGGAAGTTGGAGAATTTTCCTTTCCTCAAACGTCTAGAGTCATTGCTTCTTCACAACAATAGGATTCAGTATATTCAGAAGGATCTCCATGAGAAACTCCCTAATTTGAATACCTTGGCTTTGACCAACAACAATTTAGCTGAGCTTGGAGATATTGAACCTCTAGCGAAATGCAAGAAACTTGAGTATTTAACTCTGATGGGGAATCCGTTGACACACAAACCTCATTACAGAGCCTATGTGATATACAAGCTGAGATCAGTCCGTGTTCTTGATTTTAAAAGAATCAAATTGGCGGAACGACAAGCTGCTCTTCAATTGTTCAAGGGAGCTGAAGGGAAGAAGTTGCGAGAACAACTTGTTAAGAAATCCCAGCCATTACCAAATGAGAACGAACCAGTTAGAGCTCAGCCCGTTGAGAGTAATAGGACAGATGAAGAGCAAGAAAAGATCAGGCAGGCGATTCAGAACGCAAAAACGTTAGCAGAAGTTGAGCATCTGCAGAGTTTGTTGCAGCACGGAAAAGTGCCTGATCCCTCACAGTTTGGTCAAGAAAACAATGGTAGCAATCCGAGTAAACCCGATGGACAAGAAGAGGAGGAAGATATGGACACAGGGGGAGACGTTCAGCCCCTCAATGAACTCCAGAATGGTCAAAACGGAGAGGTGGAGGTTCAATGA
对松材线虫mog-2基因的CDS序列进行分析，可知松材线虫mog-2基因能编码280个氨基酸。该编码区编码的氨基酸序列如SEQ ID 3所示，具体如下：
MVRLSAELIHDAFQYVNAVKQRELNLRDLQIPAIENFGATRNQYDVIDLTDNNIRKLENFPFLKRLESLLLHNNRIQYIQKDLHEKLPNLNTLALTNNNLAELGDIEPLAKCKKLEYLTLMGNPLTHKPHYRAYVIYKLRSVRVLDFKRIKLAERQAALQLFKGAEGKKLREQLVKKSQPLPNENEPVRAQPVESNRTDEEQEKIRQAIQNAKTLAEVEHLQSLLQHGKVPDPSQFGQENNGSNPSKPDGQEEEEDMDTEEDVQPLNELQNGQNGEVEVQ。
实施例2
基于实施例1的结果，利用mog-2基因的双链siRNA进行发育干扰
(1)引物设计：
根据实施例1所得松材线虫mog-2基因的cDNA序列，设计用于松材线虫mog-2基因干扰的双链siRNA的引物序列，并送公司合成。所设计并应用的双链siRNA位于松材线虫mog-2基因的CDS序列具体为：
mog-2-siRNA-F 5’-GCUUUGACCAACAACAAUUTT-3’
mog-2-siRNA-R 5’-AAUUGUUGUUGGUCAAAGCTT-3’；
(2)干扰体系
将培养5-7d的松材线虫的平板在25℃培养箱中采用贝尔曼漏斗法过滤4-6h，收集漏斗橡胶管管底4cm左右的线虫液，显微镜下挑取松材线虫2龄幼虫，无菌水清洗2-3次，备用；
siRNA溶液(终浓度1.0ug/uL)，120μL；
2龄幼虫(3500条)，120μL；
M9缓冲液，260μL；
置于25℃下摇床内120rpm振荡孵育18h。
实施例3
基于实施例2的结果，松材线虫经基因的siRNA进行发育干扰后，其生长发育以及后代的发育受到抑制。
mog-2基因的siRNA干扰松材线虫二龄幼虫后，发育成的当代(F0代)成虫的雌雄性比为1.21，较空白对照F0代成虫的雌雄比(2.6075)明显偏小，且siRNA处理组和空白对照组的雌雄性比在P＞0.05水平下差异显著。(附图3)
mog-2siRNA能够影响松材线虫个体的雌雄系统发育，使松材线虫个体偏雄性化发育，松材线虫种群中的雌雄性比降低。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不限制本发明，尽管参照实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、修改等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 松材线虫mog-2基因及其在发育干扰中应用
<130> none
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 953
<212> DNA
<213> Bursaphelenchus xylophilus
<400> 1
<210> 2
<211> 843
<212> DNA
<213> Bursaphelenchus xylophilus
<400> 2
<210> 3
<211> 280
<212> PRT
<213> Bursaphelenchus xylophilus
<400> 3
Met Val Arg Leu Ser Ala Glu Leu Ile His Asp Ala Phe Gln Tyr Val
1 5 10 15
Asn Ala Val Lys Gln Arg Glu Leu Asn Leu Arg Asp Leu Gln Ile Pro
20 25 30
Ala Ile Glu Asn Phe Gly Ala Thr Arg Asn Gln Tyr Asp Val Ile Asp
35 40 45
Leu Thr Asp Asn Asn Ile Arg Lys Leu Glu Asn Phe Pro Phe Leu Lys
50 55 60
Arg Leu Glu Ser Leu Leu Leu His Asn Asn Arg Ile Gln Tyr Ile Gln
65 70 75 80
Lys Asp Leu His Glu Lys Leu Pro Asn Leu Asn Thr Leu Ala Leu Thr
85 90 95
Asn Asn Asn Leu Ala Glu Leu Gly Asp Ile Glu Pro Leu Ala Lys Cys
100 105 110
Lys Lys Leu Glu Tyr Leu Thr Leu Met Gly Asn Pro Leu Thr His Lys
115 120 125
Pro His Tyr Arg Ala Tyr Val Ile Tyr Lys Leu Arg Ser Val Arg Val
130 135 140
Leu Asp Phe Lys Arg Ile Lys Leu Ala Glu Arg Gln Ala Ala Leu Gln
145 150 155 160
Leu Phe Lys Gly Ala Glu Gly Lys Lys Leu Arg Glu Gln Leu Val Lys
165 170 175
Lys Ser Gln Pro Leu Pro Asn Glu Asn Glu Pro Val Arg Ala Gln Pro
180 185 190
Val Glu Ser Asn Arg Thr Asp Glu Glu Gln Glu Lys Ile Arg Gln Ala
195 200 205
Ile Gln Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Val Glu His Leu Gln Ser Leu
210 215 220
Leu Gln His Gly Lys Val Pro Asp Pro Ser Gln Phe Gly Gln Glu Asn
225 230 235 240
Asn Gly Ser Asn Pro Ser Lys Pro Asp Gly Gln Glu Glu Glu Glu Asp
245 250 255
Met Asp Thr Glu Glu Asp Val Gln Pro Leu Asn Glu Leu Gln Asn Gly
260 265 270
Gln Asn Gly Glu Val Glu Val Gln
275 280

Claims (1)

1.松材线虫mog-2基因在松材线虫防治中的应用，其特征在于，利用该基因对松材线虫进行发育干扰；利用该基因设计合成双链siRNA，对松材线虫发育进行干扰；合成该双链siRNA，需要使用扩增该双链siRNA的引物，引物序列为：mog-2-siRNA-F 5’-GCUUUGACCAACAACAAUUTT-3’；mog-2-siRNA-R 5’-AAUUGUUGUUGGUCAAAGCTT-3’；利用该双链siRNA引物设计合成的双链siRNA，以松材线虫2龄幼虫，构建浸染体系，并在25℃、120rpm条件下振荡培养18h，从而对松材线虫的发育进行干扰；利用该基因设计合成的双链siRNA对松材线虫2龄幼虫进行干扰后，松材线虫当代生长发育以及后代的发育受到抑制，使松材线虫个体偏雄性化发育，松材线虫种群繁殖力降低；所述mog-2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
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