CN108220326A - 一种三七发状根系制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种三七发状根系制备方法，属于医药制备技术领域。本发明三七发状根系制备方法为：(1)在无菌的条件下，将培养出的颗粒状三七愈伤组织轻轻敲碎，形成均匀颗粒，然后在0.5mmol/L CaCl2+0.1g/L活性炭的液体中处理10min，用无菌水冲洗3‑5次，然后再用0.1mmol/L EDTA溶液处理5min，用无菌水冲洗3‑5次，放置在不含任何激素的MS固体培养基上预培养24 h，培养条件为25±1℃，黑暗。预培养后的愈伤组织将用于菌液侵染，获得转化三七愈伤组织。(2)在无菌操作台上，用镊子将预培养后的三七愈伤组织转移到制备好的发根农杆菌的菌液中侵染30 min，90r/min、28℃。

Description

一种三七发状根系制备方法
技术领域
本发明涉及一种三七发状根系制备方法，属于生物医药制备技术领域。。
背景技术
三七（Panax notoginseng F. H. Chen）为五加科人参属植物。明代著名药学家李时珍称其 为“全不须”。清朝药学著作《本草纲目拾遗》中记载“人参补气第一， 三七补血第一”，味同而功亦等，故称人参、三七为中药中之最珍贵者。《中药大辞典》（1997年版）“ 三七功用补血，去瘀损，止血，能通能补，功效最良，是方药中之最珍贵者。三七生吃，去瘀生新，消肿定痛，并有止血不留瘀血，行血不伤新的优点；熟服可补益健体。”三七是多种药物的主要成分，如云南白药、三七通舒胶囊、三七止血胶囊等，因此三七被人们誉为“人参之王”。三七市场需求量与日俱增。
在生物工程与基因技术发展的同时，利用发根农杆菌诱导药用植物产生的发状根能合成该植物体中有效药用成分。对其发状根进行离体扩增培养，因其生长迅速、稳定性强、变异性弱等特点成为实现濒危药用植物资源可持续发展的有效途径之一。并且发状根培养不受环境、生态、气候等条件的限制，所以，利用发状根培养技术标准化生产三七发状根从而替代野生植物资源，不但可以缓解日益增长的市场需求，而且解决了栽培困难，病虫害多，产量低且不稳定等难题。也为三七等民族药的现代化工业生产提供了新的思路。因此，建立三七发状根培养体系大量生产三七药用原材料具有重要意义。
研究表明，发根农杆菌Ri质粒转化药用植物可诱导其发状根产生，已成功的利用Ri质粒对包括27科55属的许多草本植物和一些林木与果树进行转化，如金铁锁、毛白杨等是迄今发状根诱导比较成功的例子。发状根培养与传统栽培获得中草药原材料相比具有如下优点：（1）发状根生长速度快、次生代谢产物含量高；(2)发状根中染色体和次生代谢产物合成相对稳定； (3)所得的产物可从培养体系内直接提取、回收和利用，简化生产步骤；(4)不受病虫害、地理和季节等各种环境因素的制约；(5)有利于生物转化，细胞筛选，控制新成分的合成，得到价值更高的产品；(6)节省大量种植原料的农田。正是因为发状根具有诸多优点，从而为其工业化生产优质中草药原材料提供了保证，成为继组织培养和细胞培养之后现代生物技术领域中重要的研究与开发热点。
利用植物发状根进行天然物质的生产已经被人类广泛关注，通过发状根培养已经分离出生物碱类、甙类、黄酮类、醌类和一些重要的酶等。据不完全统计，目前国内外已对23科50余种药用植物进行发状根制备的研究，建立培养体系，获得次生代谢产物。
发明内容
本发明的目的是公开一种三七发状根系制备方法。
本发明采取的技术方案：
取三七叶片为外植体进行消毒、脱分化处理，获得较好的三七愈伤组织，使用含有Ri质粒的发根农杆菌(ATCC11325，保藏单位缩写和菌种编号)侵染愈伤组织后，转入到共培养培养基中进行共培养，然后进行除菌培养，在三七愈伤组织处生长出三七的发状根，将具有发状根的愈伤组织转入扩增培养基中进行发状根的扩大培养。
所述三七叶片脱分化处理时，是取1～2cm2左右三七叶片进行消毒处理后，置于MS+2,4-D1.5mg/L +6-BA0.5 mg/L培养基中，在25℃±1下暗培养35d。获得新鲜三七愈伤组织;所述发根农杆菌与三七愈伤组织侵染前，先在固体YEB培养基中25℃±1下培养1～4d；然后选取单克隆到液体YEB培养基中振荡培养，菌液离心收集菌体；将菌体置于MS液体培养基中混匀后加入愈伤组织充分侵染20min；所述共培养培养基为100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基。共培养时间为1d；所述除菌培养基为含有500mg/L头孢噻肟钠的MS固体培养基；所述介导转化的外植体放入除菌培养基中于25℃±1黑暗培养，每2～6d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净；所述将除菌处理后具有发状根的外植体放入发状根扩增培养是在26℃±1黑暗条件下振荡培养；所述扩增培养基为无激素1/2MS液体基本培养基；所述振荡培养箱摇床转速为110～120r·min-1。
本发明三七发状根系制备方法为：
(1)在无菌的条件下，将培养出的颗粒状三七愈伤组织轻轻敲碎，形成均匀颗粒，然后在0.5mmol/L CaCl2+0.1g/L活性炭的液体中处理10min，用无菌水冲洗3-5次，然后再用0.1mmol/L EDTA溶液处理5min，用无菌水冲洗3-5次，放置在不含任何激素的MS 固体培养基上预培养24 h，培养条件为25±1℃，黑暗。预培养后的愈伤组织将用于菌液侵染，获得转化三七愈伤组织。
(2) 在无菌操作台上，用镊子将预培养后的三七愈伤组织转移到制备好的发根农杆菌的菌液中侵染 30 min，130 r/min、28 ℃，使预培养的外植体与发根农杆菌之间能够充分的接触。侵染结束后，用无菌滤纸将取出的愈伤组织表面的菌液吸干，然后再转接到含有 0、20、40、60、80、100 mg/L 的乙酰丁香酮的 MS 固体培养基中，25±1 ℃，暗培养条件下进行共培养 2 d。
(3)挑取1菌环单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25℃±3振荡培养12h，OD值为0.3～1.2，取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，培养6h。OD值为0.3～0.9，3500rpm下离心5～15min收集菌体。
(4)将(3)收集的菌体置于MS液体培养基中并混匀。
(5)用(4)混匀后得到的菌液浸染三七愈伤组织10～30min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的三七愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9%琼脂的MS固体培养基中培养1～3d。
(6) 将(5)共培养后的愈伤组织接入含有500mg/L 头孢噻肟钠的 MS 固体培养基上进行除菌培养，每隔一周就要进行继代培养一次，并逐渐的降低除菌抗生素的浓度直至三七愈伤组织和叶片、茎段周围的菌斑完全消失。
(7) 用无激素1/2MS液体培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后1g的诱导出来的发状根放入30mL的扩增培养基中，黑暗悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min-1。
(8) 当诱导出来的毛状根长到 2-3 cm 左右时，将毛状根剪下，并转移到含有200 mg/L卡那霉素的 MS 固体培养基上，25±1 ℃，12 h/d 光照条件下进行培养，培养过程中要筛选出具有卡那霉素抗性的生长速度较快、分支较多的即为三七毛状根。
本发明三七发状根系高效制备与培养优选方法为：
(1) 在无菌的条件下，将培养出的颗粒状三七愈伤组织轻轻敲碎，形成均匀颗粒，然后在0.5mmol/L CaCl2+0.1g/L活性炭的液体中处理10min，用无菌水冲洗3-5次，然后再用0.1mmol/L EDTA溶液处理5min，用无菌水冲洗3-5次，放置在不含任何激素的MS 固体培养基上预培养24 h，培养条件为25±1℃，黑暗。预培养后的愈伤组织将用于菌液侵染，获得转化三七愈伤组织。
(2) 在无菌操作台上，用镊子将预培养后的三七愈伤组织转移到制备好的发根农杆菌的菌液中侵染 30 min，130 r/min、28 ℃，使预培养的外植体与发根农杆菌之间能够充分的接触。侵染结束后，用无菌滤纸将取出的愈伤组织和叶片表面的菌液吸干，然后再转接到含有 0、20、40、60、80、100 mg/L 的乙酰丁香酮的 MS 固体培养基中，25±1 ℃，暗培养条件下进行共培养 2 d。
(3)挑取1菌环单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25℃±3振荡培养12h，OD值为0.3～1.2，取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，培养6h。OD值为0.3～0.9，3500rpm下离心5～15min收集菌体。
(4)将(3)收集的菌体置于MS液体培养基中并混匀。
(5)用(4)混匀后得到的菌液浸染三七愈伤组织10～30min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的三七愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9%琼脂的MS固体培养基中培养1～3d。
(6)将(5)共培养后的愈伤组织接入含有500mg/L 头孢噻肟钠的 MS 固体培养基上进行除菌培养，每隔一周就要进行继代培养一次，并逐渐的降低除菌抗生素的浓度直至三七愈伤组织和叶片、茎段周围的菌斑完全消失。
(7)用无激素1/2MS液体培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后1g的诱导出来的发状根放入30mL的扩增培养基中，黑暗悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min-1。
(8) 当诱导出来的毛状根长到 2-3 cm 左右时，将毛状根剪下，并转移到含有200 mg/L卡那霉素的 MS 固体培养基上，24±1 ℃，10 h/d 光照条件下进行培养，培养过程中要筛选出具有卡那霉素抗性的生长速度较快、分支较多的即为三七毛状根。
具体实施方式
实施例1：
(1) 在无菌的条件下，将培养出的颗粒状三七愈伤组织轻轻敲碎，形成均匀颗粒，然后在0.5mmol/L CaCl2+0.1g/L活性炭的液体中处理10min，用无菌水冲洗3-5次，然后再用0.1mmol/L EDTA溶液处理5min，用无菌水冲洗3-5次，放置在不含任何激素的MS 固体培养基上预培养24 h，培养条件为25±1℃，黑暗。预培养后的愈伤组织将用于菌液侵染，获得转化三七愈伤组织。
(2) 在无菌操作台上，用镊子将预培养后的三七愈伤组织转移到制备好的发根农杆菌的菌液中侵染 30 min，130 r/min、28 ℃，使预培养的外植体与发根农杆菌之间能够充分的接触。侵染结束后，用无菌滤纸将取出的愈伤组织和叶片表面的菌液吸干，然后再转接到含有 0、20、40、60、80、100 mg/L 的乙酰丁香酮的 MS 固体培养基中，25±1 ℃，暗培养条件下进行共培养 2 d。
(3) 挑取1菌环单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25℃±3振荡培养12h，OD值为0.3～1.2.取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，培养6h。OD值为0.3～0.9.3500 rpm下离心5～15min收集菌体。
(4) 将(3)收集的菌体置于MS液体培养基中并混匀。
(5) 用(4)混匀后得到的菌液浸染三七愈伤组织10～30min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的三七愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9%琼脂的MS固体培养基中培养1～3d。
(6) 将(5)共培养后的愈伤组织接入含有500mg/L 头孢噻肟钠的 MS 固体培养基上进行除菌培养，每隔一周就要进行继代培养一次，并逐渐的降低除菌抗生素的浓度直至三七愈伤组织和叶片、茎段周围的菌斑完全消失。
(7) 用无激素1/2MS液体培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后1g的诱导出来的发状根放入30mL的扩增培养基中，黑暗悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min-1。
(8) 当诱导出来的毛状根长到 2-3 cm 左右时，将毛状根剪下，并转移到含有200 mg/L卡那霉素的 MS 固体培养基上，25±1 ℃，12 h/d 光照条件下进行培养，培养过程中要筛选出具有卡那霉素抗性的生长速度较快、分支较多的即为三七毛状根。
实施例2：
(1) 在无菌的条件下，将培养出的颗粒状三七愈伤组织轻轻敲碎，形成均匀颗粒，然后在0.5mmol/L CaCl2+0.1g/L活性炭的液体中处理10min，用无菌水冲洗3-5次，然后再用0.1mmol/L EDTA溶液处理5min，用无菌水冲洗3-5次，放置在不含任何激素的MS 固体培养基上预培养24 h，培养条件为25±1℃，黑暗。预培养后的愈伤组织将用于菌液侵染，获得转化三七愈伤组织。
(2) 在无菌操作台上，用镊子将预培养后的三七愈伤组织和叶片、茎段转移到制备好的发根农杆菌的菌液中侵染 30 min，130 r/min、28 ℃，使预培养的外植体与发根农杆菌之间能够充分的接触。侵染结束后，用无菌滤纸将取出的愈伤组织和叶片表面的菌液吸干，然后再转接到含有 0、20、40、60、80、100 mg/L 的乙酰丁香酮的 MS 固体培养基中，25±1 ℃，暗培养条件下进行共培养 2 d。
(3)挑取1菌环单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25℃±3振荡培养12h，OD值为0.3～1.2，取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，培养6h。OD值为0.3～0.9，3500rpm下离心5～15min收集菌体。
(4)将(3)收集的菌体置于MS液体培养基中并混匀。
(5)用(4)混匀后得到的菌液浸染三七愈伤组织10～30min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的三七愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9%琼脂的MS固体培养基中培养1～3d。
(6)将(5)共培养后的愈伤组织接入含有500mg/L 头孢噻肟钠的 MS 固体培养基上进行除菌培养，每隔一周就要进行继代培养一次，并逐渐的降低除菌抗生素的浓度直至三七愈伤组织周围的菌斑完全消失。
(7)用无激素1/2MS液体培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后1g的诱导出来的发状根放入30mL的扩增培养基中，黑暗悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min-1。
(8) 当诱导出来的毛状根长到 2-3 cm 左右时，将毛状根剪下，并转移到含有200 mg/L卡那霉素的 MS 固体培养基上，24±1 ℃，10 h/d 光照条件下进行培养，培养过程中要筛选出具有卡那霉素抗性的生长速度较快、分支较多的即为三七毛状根。
对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种三七发状根系制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1) 在无菌的条件下，将培养出的颗粒状三七愈伤组织轻轻敲碎，形成均匀颗粒，然后在0.5mmol/L CaCl2+0.1g/L活性炭的液体中处理10min，用无菌水冲洗3-5次，然后再用0.1mmol/L EDTA溶液处理5min，用无菌水冲洗3-5次，放置在不含任何激素的MS 固体培养基上预培养24 h，培养条件为25±1℃，黑暗。预培养后的愈伤组织将用于菌液侵染，获得转化三七愈伤组织。
(2) 在无菌操作台上，用镊子将预培养后的三七愈伤组织转移到制备好的发根农杆菌的菌液中侵染 30 min，130 r/min、28 ℃，使预培养的愈伤组织表面的菌液吸干，然后再转接到含有 0、20、40、60、80、100 mg/L 的乙酰丁香酮的 MS 固体培养基中，25±1 ℃，暗培养条件下进行外植体与发根农杆菌之间能够充分的接触；侵染结束后，暗培养 2 d，25±1℃；
(3)挑取1菌环单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25±1℃振荡培养12h，O.D值为0.3～1.2.取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，培养6h；O.D值为0.3～0.9，3500 rpm下离心5～15min收集菌体；
(4)将(3)收集的菌体置于MS液体培养基中并混匀；
(5)用(4)混匀后得到的菌液浸染三七愈伤组织10～30min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的三七愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9%琼脂的MS固体培养基中培养1～3d；
(6)将(5)共培养后的愈伤组织接入含有500mg/L 头孢噻肟钠的 MS 固体培养基上进行除菌培养，每隔一周就要进行继代培养一次，并逐渐的降低除菌抗生素的浓度直至三七愈伤组织周围的菌斑完全消失；
(7) 当诱导出来的毛状根长到 2-3 cm 左右时，将毛状根剪下，并转移到含有 200mg/L卡那霉素的 MS 固体培养基上，25±1 ℃，12 h/d 光照条件下进行培养，培养过程中要筛选出具有卡那霉素抗性的生长速度较快、分支较多的即为三七发状根。
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