CN102210265A - 三七不定根的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种三七不定根的培养方法，包括三七愈伤组织的诱导、三七愈伤组织的扩增与继代培养、三七不定根的诱导、三七不定根的扩繁与继代培养、三七不定根不同根系的筛选和扩繁及三七不定根的反应器培养本培养方法简单、效率高，次生代谢产物含量高、主要皂苷成分均得以表达且其比例与药材相近；不定根生长迅速、无内生真菌污染，本培养工艺操作简单、重复性好、规模生产迅速方便。
Description
技术领域
本发明属生物医药领域，具体涉及一种三七不定根的培养方法。
背景技术
三七是我国特有的中药材之一，名列我国“参、茸、桂、七”传统四大名贵中药之列。三七具有散瘀止血、消肿定痛等功效，既可作为滋补品直接食用，又是许多保健品和药品的重要原料，如血塞痛、云南白药、复方丹参滴丸和复方三七通络片等。
三七药材中含有约15％总皂苷，约3％黄酮，2％多糖，7％氨基酸及其他成分，包括多个单体成分，且各单体成分的药理和药效作用并不尽然相同。三七总皂苷分为人参二醇皂苷和人参三醇皂苷两大组分，还有一些独立于醇类皂苷之外的单体皂苷。其中，人参二醇皂苷中的Rg1具有镇静神经的作用，其功能与人参中的主要皂苷成分相同，此外还有一些单体皂苷起消炎、定痛作用。人参三醇皂苷中，Rb1起活血化瘀作用，而其中某些单体皂苷则起去腐生新作用。三七氨基酸中含有至少9个以上单体氨基酸，其中占三七块根总量仅2％-3％的单体物质L-二氨基丙酸，是三七止血作用的全部活性成分。其他单体氨基酸，如胱氨酸、谷氨酸等，则起其他补益作用，三七黄酮和多糖及其衍生物，有调节机体免疫能力、抑制癌细胞生长等作用。以三七总皂苷为处方原料的系列产品，已在临床广泛应用，年总产值将近30亿元。
三七具有不可替代的药用功能和价值，在医药行业中占有重要地位。但三七的生长受地理条件的限制以及载培土地不能重复利用的影响，栽培面积十分有限，导致药材供应不稳定。三七的适种区域狭小，长不到300公里，宽不足50公里，资源不可扩张。药用植物资源是中药产业得以存在、发展的根本，只有合理科学地保护性开发利用，才能保证中药产业的可持续发展。
产业化规模的非土地植物组织培养可以解决该问题。通过组织培养方法可获得有效成分含量高、生产周期短的三七组织培养物，从而代替土地栽培的三七，解决土地问题和三七药材供应问题，具有重要的经济意义和社会意义。不定根培养是80年代发展起来的一项新技术，不定根是分化的植物器官，是由植物的愈伤组织诱导出来的根，和药用植物的悬浮细胞相比，其有效成分含量稳定，和大田栽培的植物相比，不仅有效成分含量高而稳定、生长速度快，而且节省土地资源，因此不定根培养尤其适合于根类药材的组织培养，以组织培养物或其有效成分替代名贵稀有紧缺的三七原料。组织培养具有以下优点：(1)使用植物材料资源少，仅利用植物的一小部分营养器官作为外植体进行诱导；(2)生产周期短，繁殖系数大，在短期内可生产出大量组织，生产速度超过大田栽培；(3)不受环境、季节限制，可在有限空间内进行操作；利于工厂化生产。(4)可获得脱毒的无菌组织，提高药用植物的品质。
生物反应器是实现植物组织大规模工业化生产的关键因素之一，其具有工作体积大、单位体积生产能力高，物质和化学条件控制方便，不受时间和地点限制，随时随地规模化生产等许多优点，为植物组织培养生产天然产物的商业化开辟了广阔前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种三七不定根的培养方法。与传统大田栽培方法比较，本发明培养方法简单、效率高，次生代谢产物含量高、主要皂苷成分均得以表达且其比例与药材相近；不定根生长迅速、无内生真菌污染，本培养工艺操作简单、重复性好、规模生产迅速方便。
本发明三七不定根的培养方法包括以下步骤：
(7)三七愈伤组织的诱导：将三七根消毒，切成小片，接种于MS固体培养基上，在无菌、室温及避光条件下培养3-5周可见愈伤组织形成；
(8)三七愈伤组织的扩增与继代培养：将诱导出的愈伤组织接种于MS固体培养基上，加入浓度为1mg/L的2，4-D、IAA和激动素中的任一种植物生长调节剂，在无菌、室温及避光条件下培养3-5周；
(9)三七不定根的诱导：将扩增出的愈伤组织接种于MS固体培养基上，在无菌、室温及避光条件下培养3-5周，可见不定根的形成；
(10)三七不定根的扩繁与继代培养：将已形成的不定根接种于MS固体培养基上，加入浓度为1mg/L的IBA、NAA和激动素中的任一种植物生长调节剂，在无菌、室温及避光条件下培养3-5周；
(11)三七不定根不同根系的筛选和活性成分的测定及扩繁：对培养出的不同生长情况、不同颜色及不同粗细的不定根进行分类，进行扩繁与继代培养，待株系稳定后，进行活性成分的测定，并建立相应成分的指纹图谱，然后根据检测结果筛选出最优不定根系，并接种于内装含3％蔗糖的MS液体培养基的不同体积三角瓶中，并加入浓度为1mg/L的IBA植物生长调节剂，在100rpm速度的摇床上、25度避光条件下进行扩繁，培养周期为3-4周。
(12)三七不定根的反应器培养：将不定根接种于内部装有含3-5％蔗糖的MS液体培养基的气升式反应器中，并加入浓度为1mg/L的IBA植物生长调节剂，在供气速度为0.1vvm、18-25度及避光或光照条件下进行培养，培养周期为6-12周，即得三七不定根。
本培养方法简单、效率高，次生代谢产物含量高、主要皂苷成分均得以表达且其比例与药材相近；不定根生长迅速、无内生真菌污染，本培养工艺操作简单、重复性好、规模生产迅速方便。
具体实施方式
实施例1 将三七根消毒，切成小片，接种于MS固体培养基上，在无菌、室温及避光条件下培养3周可见愈伤组织形成；将诱导出的愈伤组织接种于MS固体培养基上，加入浓度为1mg/L的激动素，在无菌、室温及避光条件下培养3周；将扩增出的愈伤组织接种于MS固体培养基上，在无菌、室温及避光条件下培养3周，可见不定根的形成；将已形成的不定根接种于MS固体培养基上，加入浓度为1mg/L的IBA、，在无菌、室温及避光条件下培养3周；对培养出的不同生长情况、不同颜色及不同粗细的不定根进行分类，进行扩繁与继代培养，待株系稳定后，进行活性成分的测定，并建立相应成分的指纹图谱，然后根据检测结果筛选出最优不定根系，并接种于内装含3％蔗糖的MS液体培养基的不同体积三角瓶中，并加入浓度为1mg/L的IBA植物生长调节剂，在100rpm速度的摇床上、25℃避光条件下进行扩繁，培养周期为3周。将不定根接种于内部装有含3％蔗糖的MS液体培养基的气升式反应器中，并加入浓度为1mg/L的IBA植物生长调节剂，在供气速度为0.1vvm、18-25℃及避光或光照条件下进行培养，培养周期为6-8周，即得三七不定根。
实施例2 将三七根消毒，切成小片，接种于MS固体培养基上，在无菌、室温及避光条件下培养5周可见愈伤组织形成；将诱导出的愈伤组织接种于MS固体培养基上，加入浓度为1mg/L的IAA，在无菌、室温及避光条件下培养4周；将扩增出的愈伤组织接种于MS固体培养基上，在无菌、室温及避光条件下培养3周，可见不定根的形成；将已形成的不定根接种于MS固体培养基上，加入浓度为1mg/L的NAA、，在无菌、室温及避光条件下培养5周；对培养出的不同生长情况、不同颜色及不同粗细的不定根进行分类，进行扩繁与继代培养，待株系稳定后，进行活性成分的测定，并建立相应成分的指纹图谱，然后根据检测结果筛选出最优不定根系，并接种于内装含3％蔗糖的MS液体培养基的不同体积三角瓶中，并加入浓度为1mg/L的IBA植物生长调节剂，在100rpm速度的摇床上、25℃避光条件下进行扩繁，培养周期为5周。将不定根接种于内部装有含3％蔗糖的MS液体培养基的气升式反应器中，并加入浓度为1mg/L的IBA植物生长调节剂，在供气速度为0.1vvm、18-25℃及避光或光照条件下进行培养，培养周期为8-10周，即得三七不定根。
实施例3 将三七根消毒，切成小片，接种于MS固体培养基上，在无菌、室温及避光条件下培养5周可见愈伤组织形成；将诱导出的愈伤组织接种于MS固体培养基上，加入浓度为1mg/L的IAA，在无菌、室温及避光条件下培养4周；将扩增出的愈伤组织接种于MS固体培养基上，在无菌、室温及避光条件下培养3周，可见不定根的形成；将已形成的不定根接种于MS固体培养基上，加入浓度为1mg/L的IBA、，在无菌、室温及避光条件下培养5周；对培养出的不同生长情况、不同颜色及不同粗细的不定根进行分类，进行扩繁与继代培养，待株系稳定后，进行活性成分的测定，并建立相应成分的指纹图谱，然后根据检测结果筛选出最优不定根系，并接种于内装含3％蔗糖的MS液体培养基的不同体积三角瓶中，并加入浓度为1mg/L的IBA植物生长调节剂，在100rpm速度的摇床上、25℃避光条件下进行扩繁，培养周期为5周。将不定根接种于内部装有含3％蔗糖的MS液体培养基的气升式反应器中，并加入浓度为1mg/L的IBA植物生长调节剂，在供气速度为0.1vvm、18-25℃及避光或光照条件下进行培养，培养周期为10-12周，即得三七不定根。
Claims (3)
1.一种三七不定根的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)三七愈伤组织的诱导：将三七根消毒，切成小片，接种于MS固体培养基上，在无菌、室温及避光条件下培养3-5周可见愈伤组织形成；
(2)三七愈伤组织的扩增与继代培养：将诱导出的愈伤组织接种于MS固体培养基上，加入植物生长调节剂，在无菌、室温及避光条件下培养3-5周；
(3)三七不定根的诱导：将扩增出的愈伤组织接种于MS固体培养基上，在无菌、室温及避光条件下培养3-5周，可见不定根的形成；
(4)三七不定根的扩繁与继代培养：将已形成的不定根接种于MS固体培养基上，加入植物生长调节剂，在无菌、室温及避光条件下培养3-5周；
(5)三七不定根不同根系的筛选和活性成分的测定及扩繁：对培养出的不同生长情况、不同颜色及不同粗细的不定根进行分类，进行扩繁与继代培养，待株系稳定后，进行活性成分的测定，并建立相应成分的指纹图谱，然后根据检测结果筛选出最优不定根系，并接种于内装含3％蔗糖的MS液体培养基的不同体积三角瓶中，并加入浓度为1mg/L的IBA植物生长调节剂，在100rpm速度的摇床上、25℃避光条件下进行扩繁，培养周期为3-4周。
(6)三七不定根的反应器培养：将不定根接种于内部装有含3-5％蔗糖的MS液体培养基的气升式反应器中，并加入浓度为1mg/L的IBA植物生长调节剂，在供气速度为0.1vvm、18-25℃及避光或光照条件下进行培养，培养周期为6-12周，即得三七不定根。
2.如权利要求1所述的三七不步根的培养方法，其特征在于，如步骤(2)所述的植物生长调节剂，选自浓度为1mg/L的2，4-D、IAA和激动素。
3.如权利要求1所述的三七不步根的培养方法，其特征在于，如步骤(4)所述的植物生长调节剂，选自浓度为1mg/L的IBA、NAA和激动素。
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