CN103316046B - 一种体外培育牛黄的酶促生产工艺 - Google Patents
一种体外培育牛黄的酶促生产工艺 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103316046B CN103316046B CN201310234518.7A CN201310234518A CN103316046B CN 103316046 B CN103316046 B CN 103316046B CN 201310234518 A CN201310234518 A CN 201310234518A CN 103316046 B CN103316046 B CN 103316046B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enzymatic
- seu bubali
- fel
- bovis
- calculus bovis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 80
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title abstract 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 20
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 16
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 claims abstract description 16
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 claims abstract description 16
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 53
- 201000001883 cholelithiasis Diseases 0.000 claims description 23
- 239000004575 stone Substances 0.000 claims description 20
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 18
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims description 10
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 10
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 9
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000010129 solution processing Methods 0.000 claims description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims description 2
- 101000672034 Bacillus sp. (strain GL1) Unsaturated glucuronyl hydrolase Proteins 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 6
- 208000001130 gallstones Diseases 0.000 abstract description 5
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 abstract description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000927 lithogenic effect Effects 0.000 abstract 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 abstract 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 abstract 1
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 10
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 7
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 7
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 7
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 description 6
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 6
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 description 6
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 description 6
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 244000309464 bull Species 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010004542 Bezoar Diseases 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- DGABKXLVXPYZII-UHFFFAOYSA-N Hyodeoxycholic acid Natural products C1C(O)C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 DGABKXLVXPYZII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 description 1
- 102000019280 Pancreatic lipases Human genes 0.000 description 1
- 108050006759 Pancreatic lipases Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- DGABKXLVXPYZII-SIBKNCMHSA-N hyodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1[C@@H](O)C2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 DGABKXLVXPYZII-SIBKNCMHSA-N 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229940116369 pancreatic lipase Drugs 0.000 description 1
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 description 1
- 235000021110 pickles Nutrition 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种体外培育牛黄的生产工艺，特别是一种体外培育牛黄的酶促生产工艺。首先新鲜牛胆汁酶促发酵制备生物牛胆汁，生物牛胆汁中添加氢氧化钙，搅拌超声处理后，充分溶解加热至沸，制备成石牛胆汁，成石牛胆汁摇转培育过程中，滴加稀酸，破坏成石牛胆汁胶体平衡，促发胆石核心形成，继续滴加盐酸，出现棕红色球形物后，静置分层培育获得成品。本发明体外培育牛黄产品的性状、结构、成份等指标均与天然牛黄一致，并且质量稳定、成石率高，能规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药原料药的生产工艺，尤其涉及一种体外培育牛黄的酶促生产工艺。
背景技术
牛黄是中医中常用珍贵药，它具有清热解毒、清心豁痰、开窍凉肝、镇惊消肿、强心利胆等功用。我国许多名贵中成药，如：安宫牛黄丸、六神丸等均以牛黄为主药配制而成。但是天然牛黄的自然发生率仅为0.921%，药源匮乏，价格昂贵，严重地制约了我国传统医药工业的发展。自1972年国家药品监督管理部门陆续批准了3个牛黄代用品，即人工牛黄、培育牛黄和体外培育牛黄。
人工牛黄主要是胆酸、猪去氧胆酸、极微量的胆红素以及大量淀粉研磨过筛获得的粉末，不含有牛胆结石，成份、结构、含量及各种微量成份均与天然牛黄相差甚远，临床疗效远不及天然牛黄。
培育牛黄虽实验获得成功，但需对牛体剖腹处理，手术操作复杂，需2～3年才能剖腹提取产品，成石率低，产量小，胆红素含量低、质量极不稳定，不能规模化生产。
体外培育牛黄在外观、结构、成分上与天然牛黄基本相同，但是不能较好的模拟牛胆囊的酶促发酵过程，胆红素、胆酸含量较低，生成周期长，工艺复杂，且产品质量稳定性不高。
发明内容
本发明针对现有体外培育牛黄工艺中生成周期长，工艺复杂，成本高昂，不能较好的模拟牛胆囊的酶促发酵过程，产品的胆红素、胆酸含量较低的不足，提供了一种生产周期短，工艺简单，成本较低，能较好模拟牛胆囊的酶促发酵过程，产品胆红素、胆酸含量优于《中国药典》规定值的体外培育牛黄的酶促生产工艺。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决。
一种体外培育牛黄的酶促生产工艺，它包括如下步骤：
步骤一：新鲜牛胆汁中添加酶促培养液，体外培育后获得生物牛胆汁；
步骤二：生物牛胆汁中添加氢氧化钙，混合均匀，超声处理后加热至沸腾，获得成石牛胆汁；
步骤三：成石牛胆汁中加入酸性溶液，缓慢摇转，获得胆石核心；
步骤四：继续缓慢摇转培育，并在胆石核心表面滴加盐酸，待形成棕红色球状物后，静置培育获得成品。
作为优选，步骤一中新鲜牛胆汁经过灭菌处理。灭菌处理后，能保证后续的生物反应不受杂菌影响，保证发酵和酶促反应过程按所投放的菌种类型进行，能较好的模拟牛胆囊的中结石形成的生化反应过程。
作为优选，步骤一中添加的酶促培养液中，大肠杆菌干菌体质量占酶促培养液总质量的10～20%，β-葡萄糖醛酸酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的20～60%，胰酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的10～20%。β-葡萄糖醛酸酶是细胞溶酶体中的水解酶，胰酶是胰腺中提取的多种酶的混合物，主要是胰蛋白酶、胰淀粉酶与胰脂肪酶，在灭菌的新鲜牛胆汁中添加大肠杆菌、β-葡萄糖醛酸酶和胰酶，通过酶促水解，能有效消除胆汁内拮抗结石形成的因素，改变牛胆汁的理化性质，打破胆汁胶体的平衡状态。
作为优选，步骤一中添加酶促培养液的灭菌新鲜牛胆汁的培育温度为20～40℃，培育时间为2～5天。模仿牛胆囊中结石形成过程的生化反应的温度条件，经过发酵形成生物牛胆汁。
作为优选，步骤二中每升生物牛胆汁中添加氢氧化钙100～800mg，氢氧化钙的添加为后续胆酸钙、胆红素钙、脂肪酸钙等沉淀的形成提供底物。
作为优选，步骤二中超声处理时间为10～60min，超声处理保证氢氧化钙的充分溶解。
作为优选，步骤三中所添加的酸性溶液为质量分数为0.1%～0.5%的盐酸溶液或者质量分数为1%～2%的醋酸溶液或者质量分数为1%～2%的硫酸溶液。稀酸溶液的加入进一步打破胆汁胶体的平衡状态，能有效触发胆石核心的形成。
作为优选，步骤三中酸性溶液处理时间为1～3h，处理温度为30～40℃。
作为优选，步骤四中30～40℃条件下，缓慢摇转培育，并在胆石核心表面滴加盐酸，在与牛胆囊环境温度相似的环境下，进一步降低体系pH值，促使牛胆红素钙结石的析出。
作为优选，步骤四中静置培育时间为4～12小时。静置培育保证牛胆红素钙结石进一步结晶析出。
本发明的有益效果是：
（1）生物牛胆汁的制备中采用新鲜的无菌牛胆汁酶促发酵，通过酶促发酵，模拟牛胆囊结石形成的生化反应，能够有效提高体外培育牛黄的产率；
（2）成石牛胆汁制备中添加固体氢氧化钙，并超声处理，保证氢氧化钙的充分溶解，为后续反应中胆酸钙、胆红素钙、脂肪酸钙的形成提供底物，进一步提高了反应产率；
（3）胆汁核心的形成过程中添加稀酸液打破成石牛胆汁胶体的平衡状态，触发胆石核心的形成，工艺简单，且有效提高反应效率；
（4）胆石核心分层培育获得成品中，逐滴滴加盐酸，有利于体外培育牛黄的完全形成，有利于晶体的稳定生长，保证产品质量的稳定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
本实施例的一种体外培育牛黄的酶促生产工艺，包括以下步骤：
（1）新鲜牛胆汁高压蒸汽灭菌后，添加酶促培养液，30℃体外培育4天，获得生物牛胆汁。所添加酶促培养液体积占新鲜牛胆汁体积的5%，在所添加的酶促培养液中，大肠杆菌干菌体质量占酶促培养液总质量的15%，β-葡萄糖醛酸酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的40%，胰酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的15%。
（2）每升生物牛胆汁中添加400mg氢氧化钙固体，混合均匀，超声处理30min后加热至沸腾，获得成石牛胆汁生物。
（3）成石牛胆汁在37℃摇转培育，同时添加质量比为3%的质量分数为1.5%的醋酸溶液，反应2h，在物理摇转和化学平衡被打破的共同作用下，反应体系中出现白色簇集，后收缩形成胆石核心。
（4）37℃继续缓慢摇转，并在胆石核心表面逐滴滴加盐酸，待形成棕红色球状物后，静置培育8h，分离棕红色球状物，真空干燥获得成品。
经计算，产率为9.7‰，其中胆红素含量为39.2%，其它成分及氨基酸、微量元素含量与天然牛黄基本一致，符合现行《中国药典》的规定。
实施例2
本实施例的一种体外培育牛黄的酶促生产工艺，包括以下步骤：
（1）新鲜牛胆汁高压蒸汽灭菌后，添加酶促培养液，40℃体外培育2天，获得生物牛胆汁。所添加酶促培养液体积占新鲜牛胆汁体积的7%，在所添加的酶促培养液中，大肠杆菌干菌体质量占酶促培养液总质量的10%，β-葡萄糖醛酸酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的40%，胰酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的20%。
（2）每升生物牛胆汁中添加600mg氢氧化钙固体，混合均匀，超声处理50min后加热至沸腾，获得成石牛胆汁生物；
（3）成石牛胆汁在37℃摇转培育，同时添加质量比为10%的质量分数为1%的醋酸溶液，反应1h，在物理摇转和化学平衡被打破的共同作用下，反应体系中出现白色簇集，后收缩形成胆石核心。
（4）40℃缓慢摇转，并在胆石核心表面逐滴滴加盐酸，待形成棕红色球状物后，静置培育4h，分离棕红色球状物，真空干燥获得成品。
经计算，产率为8.4‰，其中胆红素含量为37.2%，其它成分及氨基酸、微量元素含量与天然牛黄基本一致，符合现行《中国药典》的规定。
实施例3
本实施例的一种体外培育牛黄的酶促生产工艺，包括以下步骤：
（1）新鲜牛胆汁高压蒸汽灭菌后，添加酶促培养液，25℃体外培育5天，获得生物牛胆汁。所添加酶促培养液体积为新鲜牛胆汁体积的3%，在所添加的酶促培养液中，大肠杆菌干菌体质量占酶促培养液总质量的20%，β-葡萄糖醛酸酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的20%，胰酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的18%。
（2）每升生物牛胆汁中添加800mg氢氧化钙固体，混合均匀，超声处理60min后加热至沸腾，获得成石牛胆汁生物；
（3）成石牛胆汁在30℃摇转培育，同时添加质量比为1%的质量分数为2%的硫酸溶液，反应2h，在物理摇转和化学平衡被打破的共同作用下，反应体系中出现白色簇集，后收缩形成胆石核心。
（4）35℃缓慢摇转，并在胆石核心表面逐滴滴加盐酸，待形成棕红色球状物后，静置培育6h，分离棕红色球状物，真空干燥获得成品。
经计算，产率为8.9‰，其中胆红素含量为37.2%，其它成分及氨基酸、微量元素含量与天然牛黄基本一致，符合现行《中国药典》的规定。
实施例4
本实施例的一种体外培育牛黄的酶促生产工艺，包括以下步骤：
（1）新鲜牛胆汁高压蒸汽灭菌后，添加酶促培养液，20℃体外培育5天，获得生物牛胆汁。所添加酶促培养液体积为新鲜牛胆汁体积的10%，在所添加的酶促培养液中，大肠杆菌干菌体质量占酶促培养液总质量的15%，β-葡萄糖醛酸酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的60%，胰酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的12%。
（2）每升生物牛胆汁中添加100mg氢氧化钙固体，混合均匀，超声处理10min后加热至沸腾，获得成石牛胆汁生物；
（3）成石牛胆汁在40℃摇转培育，同时添加质量比为7%的质量分数为0.5%的盐酸溶液，反应3h，在物理摇转和化学平衡被打破的共同作用下，反应体系中出现白色簇集，后收缩形成胆石核心。
（4）30℃缓慢摇转，并在胆石核心表面逐滴滴加盐酸，待形成棕红色球状物后，静置培育10h，分离棕红色球状物，真空干燥获得成品。
经计算，产率为7.8‰，其中胆红素含量为37.1%，其它成分及氨基酸、微量元素含量与天然牛黄基本一致，符合现行《中国药典》的规定。
实施例5
本实施例的一种体外培育牛黄的酶促生产工艺，包括以下步骤：
（1）新鲜牛胆汁高压蒸汽灭菌后，添加酶促培养液，37℃体外培育3天，获得生物牛胆汁。所添加酶促培养液体积为新鲜牛胆汁体积的1%，在所添加的酶促培养液中，大肠杆菌干菌体质量占酶促培养液总质量的20%，β-葡萄糖醛酸酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的50%，胰酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的10%。
（2）每升生物牛胆汁中添加600mg氢氧化钙固体，混合均匀，超声处理40min后加热至沸腾，获得成石牛胆汁生物；
（3）成石牛胆汁在37℃摇转培育，同时添加质量比为8%的质量分数为1%的硫酸溶液，反应3h，在物理摇转和化学平衡被打破的共同作用下，反应体系中出现白色簇集，后收缩形成胆石核心。
（4）37℃缓慢摇转，并在胆石核心表面逐滴滴加盐酸，待形成棕红色球状物后，静置培育12h，分离棕红色球状物，真空干燥获得成品。
经计算，产率为8.4‰，其中胆红素含量为38.6%，其它成分及氨基酸、微量元素含量与天然牛黄基本一致，符合现行《中国药典》的规定。
实施例6
本实施例的一种体外培育牛黄的酶促生产工艺，包括以下步骤：
（1）新鲜牛胆汁高压蒸汽灭菌后，添加酶促培养液，35℃体外培育4天，获得生物牛胆汁。所添加酶促培养液体积为新鲜牛胆汁体积的9%，在所添加的酶促培养液中，大肠杆菌干菌体质量占酶促培养液总质量的20%，β-葡萄糖醛酸酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的20%。
（2）每升生物牛胆汁中添加200mg氢氧化钙固体，混合均匀，超声处理30min后加热至沸腾，获得成石牛胆汁生物；
（3成石牛胆汁在37℃摇转培育，同时添加质量比为5%的质量分数为0.1%的盐酸溶液，反应2h，在物理摇转和化学平衡被打破的共同作用下，反应体系中出现白色簇集，后收缩形成胆石核心。
（4）37℃缓慢摇转，并在胆石核心表面逐滴滴加盐酸，待形成棕红色球状物后，静置培育6h，分离棕红色球状物，真空干燥获得成品。
经计算，产率为9.2‰，其中胆红素含量为36.3%，其它成分及氨基酸、微量元素含量与天然牛黄基本一致，符合现行《中国药典》的规定。
实施例7
本实施例的一种体外培育牛黄的酶促生产工艺，包括以下步骤：
（1）新鲜牛胆汁高压蒸汽灭菌后，添加酶促培养液，25℃体外培育5天，获得生物牛胆汁。所添加酶促培养液体积为新鲜牛胆汁体积的5%，在所添加的酶促培养液中，大肠杆菌干菌体质量占酶促培养液总质量的12%，β-葡萄糖醛酸酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的50%，胰酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的18%。
（2）每升生物牛胆汁中添加500mg氢氧化钙固体，混合均匀，超声处理30min后加热至沸腾，获得成石牛胆汁生物；
（3）成石牛胆汁在32℃摇转培育，同时添加质量比为5%的质量分数为2%的醋酸溶液，反应1h，在物理摇转和化学平衡被打破的共同作用下，反应体系中出现白色簇集，后收缩形成胆石核心。
（4）32℃缓慢摇转，并在胆石核心表面逐滴滴加盐酸，待形成棕红色球状物后，静置培育12h，分离棕红色球状物，真空干燥获得成品。
经计算，产率为8.3‰，其中胆红素含量为37.6%，其它成分及氨基酸、微量元素含量与天然牛黄基本一致，符合现行《中国药典》的规定。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
Claims (8)
1.一种体外培育牛黄的酶促生产工艺，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一：新鲜牛胆汁中添加酶促培养液，添加酶促培养液体积占新鲜牛胆汁体积的1％或3％或5％或7％或9％或10％，体外培育后获得生物牛胆汁；
步骤二：生物牛胆汁中添加氢氧化钙固体，混合均匀，超声处理后加热至沸腾，获得成石牛胆汁；
步骤三：成石牛胆汁中加入酸性溶液，缓慢摇转，获得胆石核心；
步骤四：继续缓慢摇转培育，并在胆石核心表面滴加质量分数为0.1％‐0.5％的盐酸，待形成棕红色球状物后，静置培育获得成品；
其中，步骤一中，添加的酶促培养液中，大肠杆菌干菌体质量占酶促培养液总质量的10～20％，β‐葡萄糖醛酸酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的20～60％，胰酶酶干粉质量占酶促培养液总质量的10～20％；
步骤一中，体外培育的温度为20℃或25℃或30℃或35℃或37℃或40℃；
步骤三中，酸性溶液是质量分数为0.1％～0.5％的盐酸溶液或者质量分数1％～2％的醋酸溶液或者质量分数1％～2％的硫酸溶液。
2.根据权利要求1所述的一种体外培育牛黄的酶促生产工艺，其特征在于：步骤一中，新鲜牛胆汁经过灭菌处理。
3.根据权利要求1所述的一种体外培育牛黄的酶促生产工艺，其特征在于：步骤一中，培育时间为2～5天。
4.根据权利要求1所述的一种体外培育牛黄的酶促生产工艺，其特征在于：步骤二中，每升生物牛胆汁中添加氢氧化钙100～800mg。
5.根据权利要求1所述的一种体外培育牛黄的酶促生产工艺，其特征在于：步骤二中，超声处理时间为10～60min。
6.根据权利要求1所述的一种体外培育牛黄的酶促生产工艺，其特征在于：步骤三中，酸性溶液处理时间为1～3h，处理温度为30～40℃。
7.根据权利要求1所述的一种体外培育牛黄的酶促生产工艺，其特征在于：步骤四中，摇转培育温度为30～40℃。
8.根据权利要求1所述的一种体外培育牛黄的酶促生产工艺，其特征在于：步骤四中，静置培育时间为4～12小时。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310234518.7A CN103316046B (zh) | 2013-06-09 | 2013-06-09 | 一种体外培育牛黄的酶促生产工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310234518.7A CN103316046B (zh) | 2013-06-09 | 2013-06-09 | 一种体外培育牛黄的酶促生产工艺 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103316046A CN103316046A (zh) | 2013-09-25 |
| CN103316046B true CN103316046B (zh) | 2014-12-17 |
Family
ID=49185279
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310234518.7A Active CN103316046B (zh) | 2013-06-09 | 2013-06-09 | 一种体外培育牛黄的酶促生产工艺 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103316046B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105832770A (zh) * | 2016-04-22 | 2016-08-10 | 刘建军 | 一种凝结法生产牛黄的方法 |
| CN114703109B (zh) * | 2022-05-10 | 2023-09-01 | 山东中医药大学 | 一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基、配制方法及应用 |
| CN116059251B (zh) * | 2023-03-07 | 2023-06-16 | 济南七贤堂生物科技有限公司 | 一种采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1153635A (zh) * | 1995-12-04 | 1997-07-09 | 郭福琦 | 新牛黄的制造方法 |
| CN1347700A (zh) * | 2001-10-12 | 2002-05-08 | 武汉大鹏药业有限公司 | 一种利用天然牛胆汁在动物牛体外培育药用牛胆结石的方法 |
| CN1563393A (zh) * | 2004-04-06 | 2005-01-12 | 周广礼 | 酶促天然牛黄制备方法 |
| JP2005278604A (ja) * | 2004-03-31 | 2005-10-13 | Daicho Kikaku:Kk | 健康食品 |
| CN101284016A (zh) * | 2008-06-04 | 2008-10-15 | 江苏华阳制药有限公司 | 一种体外培育牛黄及含有它的固体口服制剂 |
| CN101474209A (zh) * | 2009-01-23 | 2009-07-08 | 刘化侠 | 酶育牛黄的制备方法 |
| TW201006480A (en) * | 2008-08-12 | 2010-02-16 | Nat Univ Chung Hsing | A manufacturing method of in vitro cultured Calculus Bovis |
| CN102429927A (zh) * | 2011-12-21 | 2012-05-02 | 武汉大鹏药业有限公司 | 一种制备牛胆结石的方法 |
-
2013
- 2013-06-09 CN CN201310234518.7A patent/CN103316046B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1153635A (zh) * | 1995-12-04 | 1997-07-09 | 郭福琦 | 新牛黄的制造方法 |
| CN1347700A (zh) * | 2001-10-12 | 2002-05-08 | 武汉大鹏药业有限公司 | 一种利用天然牛胆汁在动物牛体外培育药用牛胆结石的方法 |
| JP2005278604A (ja) * | 2004-03-31 | 2005-10-13 | Daicho Kikaku:Kk | 健康食品 |
| CN1563393A (zh) * | 2004-04-06 | 2005-01-12 | 周广礼 | 酶促天然牛黄制备方法 |
| CN101284016A (zh) * | 2008-06-04 | 2008-10-15 | 江苏华阳制药有限公司 | 一种体外培育牛黄及含有它的固体口服制剂 |
| TW201006480A (en) * | 2008-08-12 | 2010-02-16 | Nat Univ Chung Hsing | A manufacturing method of in vitro cultured Calculus Bovis |
| CN101474209A (zh) * | 2009-01-23 | 2009-07-08 | 刘化侠 | 酶育牛黄的制备方法 |
| CN102429927A (zh) * | 2011-12-21 | 2012-05-02 | 武汉大鹏药业有限公司 | 一种制备牛胆结石的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 以大肠杆菌β―葡萄糖醛酸酶培育牛黄实验研究;周广礼等;《泰山医学院学报》;19910331;第12卷(第01期);第13页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103316046A (zh) | 2013-09-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103109679B (zh) | 一种樟芝子实体椴木二段培养方法 | |
| CN105284520A (zh) | 一种促进无花果扦插生根的方法 | |
| CN104013657A (zh) | 一种西洋参药材提取皂苷后发酵提取方法 | |
| CN106491662B (zh) | 一种从桑黄栽培废料中同时提取多糖和黄酮的方法 | |
| CN103483040B (zh) | 冬虫夏草规模化液体深层发酵用培养基及其发酵生产方法 | |
| CN103460994B (zh) | 蛹虫草纳米硒及其制备方法 | |
| CN102342218B (zh) | 固态发酵生产冬虫夏草菌丝的方法 | |
| CN103688759A (zh) | 一种以蚕蛹为载体培养人工虫草的方法 | |
| CN103858676B (zh) | 一种北虫草液体菌种的制备方法 | |
| CN103316046B (zh) | 一种体外培育牛黄的酶促生产工艺 | |
| CN106222093A (zh) | 制备金针菇液体菌种的新方法 | |
| CN102210265A (zh) | 三七不定根的培养方法 | |
| CN109168995A (zh) | 一种利用棉籽壳栽培粗毛纤孔菌的培养基及方法 | |
| CN102296098A (zh) | 一种运用现代发酵技术生产高纯度云芝胞内糖肽的方法 | |
| CN102948325A (zh) | 一种北虫草高效快速栽培技术 | |
| CN104255299A (zh) | 一种北虫草栽培方法 | |
| CN102367463B (zh) | 一种间歇补料发酵生产单葡萄醛酸基甘草次酸的方法 | |
| CN106085876A (zh) | 一种基于糖化淀粉液的草菇液体菌种培养基以及草菇液体菌种制备方法 | |
| CN105725195A (zh) | 一种蛹虫草复合益生菌酵素及其制备方法 | |
| CN103304298B (zh) | 一种猴头菇母种培养基及其制作方法 | |
| CN103396953B (zh) | 一种分阶段补料法培养小球藻的方法 | |
| CN102172171B (zh) | 一种富锗蛹虫草菌丝体的培养方法 | |
| CN103005437B (zh) | 一种固体培养制备富硒麦麸食用菌营养粉的方法 | |
| CN110484476A (zh) | 一种螺旋藻的养殖方法 | |
| CN109362479A (zh) | 一种利用桑木屑栽培粗毛纤孔菌的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: NINGBO XINUOYA MARINE BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: NINGBO NEWGEN BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20150515 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 315100 NINGBO, ZHEJIANG PROVINCE TO: 315706 NINGBO, ZHEJIANG PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20150515 Address after: 315706 Zhejiang Province, Ningbo city Xiangshan County East Wing Industrial Park Road No. 5 Patentee after: NINGBO XINUOYA MARINE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 315100 Zhejiang city of Ningbo province Yinzhou District song Xiao Gao Road No. 199 South Street Patentee before: NINGBO NEWGEN BIOTECH Co.,Ltd. |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Enzymatic production process for cultivating bezoar in vitro Effective date of registration: 20210927 Granted publication date: 20141217 Pledgee: Ningbo Tianjin Enterprise Service Co.,Ltd. Pledgor: NINGBO XINUOYA MARINE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2021330001782 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20220926 Granted publication date: 20141217 Pledgee: Ningbo Tianjin Enterprise Service Co.,Ltd. Pledgor: NINGBO XINUOYA MARINE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2021330001782 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Enzymatic production process for in vitro cultivation of bezoar Granted publication date: 20141217 Pledgee: China Construction Bank Corporation Xiangshan Branch Pledgor: NINGBO XINUOYA MARINE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024980036420 |